GUIDE COMPLÉMENTAIRE VetMAX™ M. bovis Kit Protocoles de purification des acides nucléiques optimisés pour une utilisation avec le kit (réf. n° MPBO50) Pub. nº MAN0008810 Rév. D.0 Espèces Matrices d’échantillons Type de test • Liquide synovial • Liquide trachéo-bronchique • Lait Bovins • Organe (poumon) Individuel • Colonies microbiennes • Semences (fraiches ou paillettes commerciales, sexuées ou non) AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Suivre toutes les réglementations du travail avec des échantillons biologiques locales, nationales et/ou communautaires en vigueur. ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ Objectif de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Choix de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Conservation des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Purifier de l’ADN avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Préparation des échantillons en vue de leur purification avec d’autres kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Purification de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ■ ■ Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Procédure de purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Annexe B Documentation et support ■ ■ Assistance à la clientèle et support technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Garantie limitée du produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Pour usage en laboratoire. Objectif de ce guide Ce guide décrit les protocoles de purification d’ADN de Mycoplasma bovis validés et optimisés pour une utilisation en aval avec Applied ™ ™ Biosystems VetMAX M. bovis Kit (Réf. MPBO50). ™ • La purification automatisée des acides nucléiques est réalisée à l’aide de l’un des instruments suivants : KingFisher Flex, MagMAX ™ ™ Express-96, KingFisher mL ou KingFisher Duo Prime. ™ • La purification manuelle des acides nucléiques utilise des colonnes de centrifugation à base de silice. Choix de l’échantillon Type d’échantillon Type d’analyse Quantité requise et matériel de prélèvement Liquide synovial et liquide trachéo-bronchique Individuel 200 µl de liquide Lait Individuel 700 µl de laits de mélange ou 200 µl de lait individuel Organe (poumon) Individuel 20 à 30 mg de tissu Colonies microbiennes Individuel Colonies en suspension dans 200 µl d’eau sans nucléase Semences (fraiches ou paillettes commerciales, sexuées ou non) Individuel 200 μl Conservation des échantillons Conservation Type d’échantillon Liquide synovial et liquide trachéobronchique Après le prélèvement, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours au maximum). Lait Immédiatement après le prélèvement, ajouter des conservateurs et conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours au maximum). Après utilisation ou à expiration du délai de 8 jours, stocker les échantillons en dessous de –16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de –70°C pour une conservation à long terme. Après utilisation ou à expiration du délai de 8 jours, stocker les échantillons en dessous de –16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de –70°C pour une conservation à long terme. Organes (poumons) Après le prélèvement, conserver selon le cas de figure : • Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement. • Conserver les échantillons en dessous de -16°C si l’analyse est effectuée au-delà des 24 heures suivant le prélèvement. Après utilisation ou à expiration du délai de 24 heures, stocker les échantillons en dessous de –16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de –70°C pour une conservation à long terme. Colonies microbiennes Placer plusieurs colonies dans un microtube contenant 200 µl d’eau sans nucléase, puis vortexer. Conserver et transporter les échantillons entre 2°C et 8°C. Semences (fraiches ou paillettes commerciales, sexuées ou non) Conserver les échantillons selon le type de semences à tester : • Pour les semences fraîches, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours maximum). • Pour les paillettes commerciales, conserver les échantillons selon les recommandations du fournisseur. Matériels requis non fournis Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits. 2 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit Matériel nécessaire pour le prélèvement d’échantillon, la préparation et la purification d’acides nucléiques Tableau 1 Matériel requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons Élément Source Équipement Poste de sécurité microbiologique de type II (PSMII) PFL Centrifugeuse de paillasse PFL Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL Micropipettes de précision ajustables (gamme de 1 µl à 1 000 µl) PFL Consommables Embouts de pipettes résistant aux aérosols, sans nucléase PFL Microtubes sans DNase / RNase de 1,5 ml et 2,0 ml PFL Réactifs Eau sans nucléase AM9932 PBS (1X), pH 7,4 PFL Tableau 2 Matériels supplémentaires nécessaires pour la purification des échantillons d’organes Source Élément Équipement (Facultatif) Broyeur de tissus pour l’agitation avec billes, parmi les modèles suivants ou équivalent : • Fisherbrand™ Bead Mill 24 Homogenizer • 15-340-163 • Precellys™ 24 Homogenizer (Bertin) • Bertin EQ03119.200.RD000.0 • FastPrep‑24 Instrument (MP Biomedical 116004500) • MP116004500 • Mixer Mill MM 400 (Retsch 207450001) • 08418241 ™ Balance de précision PFL PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) ou billes en verre de 3 mm équivalentes 11-312-10A Scalpels et pinces métalliques (stériles) PFL Consommables Boîte de Petri (stérile) PFL Matériel supplémentaire nécessaire pour la purification automatisée des acides nucléiques Tableau 3 Matériel nécessaire pour le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit Élément Source Instrument, l’un des suivants : KingFisher™ Flex Purification System MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor KingFisher™ Duo Prime Purification System Contacter votre bureau de vente local. KingFisher™ mL Purification System Équipement Bloc chauffant à 55°C ou à 70°C[1] PFL Réservoir de réactifs PFL ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 3 Élément Source Consommables Adhesive PCR Plate Foils, ou équivalent AB0626 Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 : • KingFisher™ 96 Deep-Well Plate • 95040450 • KingFisher™ 96 KF microplates • 97002540 • KingFisher 96 tip comb for deep-well magnets • 97002534 ™ Consommables pour les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Voir Tableau 8 en page 15. Kits et réactifs MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit A32700 ou A32702 PBS, pH 7,4 (10X), exempt de RNase [1] PFL La température requise dépend du type d’échantillon utilisé. Matériel supplémentaire nécessaire pour la purification manuelle des acides nucléiques Source Élément Équipement Bloc chauffant à 70°C PFL Kits et réactifs L’un des kits suivants : • QIAamp™ DNA Mini Kit • Kit NucleoSpin™ Tissue Éthanol à 96–100 % • Qiagen 51304 • Macherey Nagel 740952 PFL Purifier de l’ADN avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Flex ™ • MagMAX Express-96 Suivre Annexe A, “Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” si vous utilisez les instruments suivants : ™ • KingFisher Duo Prime ™ • KingFisher mL 4 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit Méthode Purification de l’ADN à partir de liquide synovial, de liquide trachéo-bronchique, de lait, d’organes et de colonies microbiennes Préparation des plaques de traitement (page 7) Préparation de l’échantillon (page 8) Préparation de la Lysis/PK Solution (page 8) Traitement des échantillons avec la Lysis/PK Solution (page 9) Mélange des échantillons avec le mélange de Binding/Bead (page 9) Placement des échantillons dans l’instrument (page 10) Purification de l’ADN à partir de semences Préparation de l’échantillon (page 10) Préparation de la PK Solution (page 10) ™ Traitement des échantillons avec la MagMAX CORE Lysis Solution et la PK Solution (page 10) Préparation des plaques de traitement (page 11) Mélange des échantillons avec le mélange de Binding/Bead (page 11) Placement des échantillons dans l’instrument (page 11) Instructions • Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger. • Pour éviter toute contamination croisée : – Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement. – Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures. • Pour éviter toute contamination par les nucléases : – Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent les acides nucléiques des nucléases présentes sur la peau. – Utiliser des embouts de pipettes exempts des acides nucléiques pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés dans les récipients de réactifs. ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 5 – Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer. Avant la première utilisation du kit (Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes ™ Nous recommandons l’utilisation de Fisherbrand Bead Mill 24 Homogenizer pour un rendement maximal en acides nucléiques. Si un autre instrument est utilisé, suivre les directives du fournisseur pour déterminer les paramètres de vitesse et de temps pour obtenir une lyse de cellules suffisante. Téléchargement et installation du script ™ Le script adapté au MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation. ™ 1. Sur la page internet du produit MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit (à l’adresse thermofisher.com, effectuer une recherche à partir de la référence), faire défiler jusqu’à la section Product Literature (Documentation du produit). 2. Faire un clic droit sur le fichier approprié pour télécharger la version la plus récente du script MagMAX_CORE pour votre instrument. Tableau 4 Scripts recommandés Instrument KingFisher™ Flex Nom du script Script standard Script express MagMAX_CORE_Flex.bdz MagMAX_CORE_Flex_Express.bdz MagMAX_CORE_KF-96.bdz MMC_KF96_Express.kf2 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz MagMAX_CORE_DUO_Express.bdz KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz MagMAX_CORE_mL_Express.bdz KingFisher™ 96 MagMAX™ Express-96 Si requis par votre laboratoire, utiliser l’un des scripts suivants, qui ne chauffe pas le liquide lors de l’étape d’élution. Tableau 5 Scripts alternatifs sans étape d’élution chauffée Instrument KingFisher™ Flex Nom du script Script standard Script express MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz MagMAX_CORE_Flex_Express.bdz MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz MMC_KF96_Express.kf2 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz MagMAX_CORE_DUO_Express.bdz KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz MagMAX_CORE_mL_Express.bdz KingFisher™ 96 MagMAX™ Express-96 3. Se référer au guide de l’utilisateur de l’instrument ou contacter le support technique pour connaître les instructions d’installation du script. 6 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit Purifier de l’ADN à partir de liquide synovial, de liquide trachéo-bronchique, de lait, d’organes ou de colonies microbiennes 1 1. Préparer les plaques de traitement. Préparation des plaques pour le traitement Tableau 6 Configuration de la plaque : instrument MagMAX™ Express-96 ou KingFisher™ Flex Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument KingFisher ™ Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 15. ™ 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 7 2 Préparation de l’échantillon Préparer les échantillons comme décrit. Type d’échantillon Action Liquide synovial ou liquide trachéobronchique Procéder avec 200 µl de liquide. Lait (individuel) Procéder avec 200 µl de lait entier. Lait (mélange) 1. Transférer 700 µl de laits de mélange dans un microtube de 1,5 ml. 2. Ajouter 700 µl de PBS (1X), pH 7,4, puis centrifuger à 1 500 × g pendant 10 minutes. 3. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette. 4. Procéder avec le culot cellulaire. Si nécessaire, stocker le culot cellulaire en-dessous de -16°C jusqu’à 1 mois, ou en-dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Organe (poumon)[1] Méthode de broyage : Préparer les échantillons d’organes à l’aide d’un broyeur de tissus. 1. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7,4 : 1 ml • PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes 2. Broyer (agiter avec les billes) les échantillons. • Fisherbrand™ Bead Mill 24 Homogenizer : 6 m/s pendant 45 secondes • Mixer Mill MM 400 : 30 Hz pendant 5 minutes 3. Centrifuger 1 minute à 1 000 x g. 4. Procéder avec 200 µl de surnageant. Méthodes d’échantillon non broyé avec des billes : Préparer les échantillons d’organes à l’aide d’un agitateur vortex. 1. Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une pince et d’un scalpel stériles. 2. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu (haché finement) : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7,4 : 500 μl • PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes 3. Vortexer vigoureusement. 4. Centrifuger 1 minute à 1 000 x g. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. Colonies microbiennes Procéder avec 200 µl de suspensions bactériennes. Semences Voir “Purifier de l’ADN à partir de semences” en page 10. [1] 3 Préparation de la Lysis/PK Solution Sélectionner la méthode de préparation appropriée pour votre laboratoire. Remarque : Préparer la Lysis/PK Solution au moment de l’utilisation. Ne pas mélanger à l’avance. 1. Mélanger les composants suivants (dans l’ordre indiqué) pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). ™ a. Mélanger le MagMAX CORE Lysis Solution avec PBS (1X), pH 7,4. Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 200 μl PBS (1X), pH 7,4 200 μl Total de Lysis Solution diluée 400 μl b. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. 8 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 3 ™ Préparation de la Lysis/PK Solution (suite) c. Ajouter MagMAX CORE Proteinase K à la Lysis Solution diluée. Remarque : La PK Buffer n’est pas requis pour ce protocole. Composant Volume par échantillon Lysis Solution diluée 400 μl MagMAX CORE Proteinase K 10 μl Volume total de la Lysis/PK Solution 410 μl ™ 2. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 4 Traitement des échantillons avec la Lysis/PK Solution Suivre cette procédure dans des tubes individuels pour éviter toute contamination. Ne pas utiliser de plaques. 1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué. Composant Échantillon préparé Volume par échantillon Volume par échantillon témoin • 200 µl d’échantillon liquide — • Culot cellulaire PBS (1X), pH 7,4 — 200 μl Lysis/PK Solution 410 μl 410 μl 2. Vortexer brièvement pour mélanger l’échantillon avec la Lysis/PK Solution. 3. Incuber l’échantillon selon le type d’échantillon. Pour... • Liquide synovial ou liquide trachéo-bronchique Procéder ainsi… Incuber 30 minutes à 55°C. • Lait (lait entier ou culot cellulaire) • Suspension bactérienne Surnageant d’organe Incuber entre 30 minutes et 2 heures à 55°C. 4. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 5 1. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon (jusqu’à 610 μl) dans les puits appropriés de la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes. Mélanger les échantillons avec le mélange de Binding/Bead ™ 2. Bien vortexer le MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. 3. Préparation du mélange de Binding/Bead : mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl MagMAX CORE Magnetic Beads 20 μl Mélange de Binding/Bead total 420 µl ™ 4. Remuer le mélange de Binding/Bead par inversion jusqu’à ce que la solution soit homogène, puis ajouter 420 μl du mélange de Binding/Bead dans chaque échantillon. 5. Procéder immédiatement au traitement des échantillons dans l’instrument (section suivante). ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 9 6 Placement des échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Purifier de l’ADN à partir de semences 1 Préparation de l’échantillon Préparer les échantillons comme décrit. Type d’échantillon Semences (paillettes commerciales) Semences (fraiches) Action Procéder avec 200 µl de liquide. 1. Ajouter 200 µl de semences dans un microtube propre de 1,5 à 2 ml. 2. Centrifuger à 3 000 × g pendant 5 minutes. 3. Éliminer précautionneusement le surnageant sans agiter le culot cellulaire. IMPORTANT ! Si le culot cellulaire est petit, retirer 100 μl du surnageant uniquement. 4. Procéder avec le culot cellulaire. 2 Préparation de la PK Solution Remarque : Préparer la PK Solution au moment de l’utilisation. Ne pas mélanger à l’avance. 1. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon PBS (1X), pH 7,4 200 µl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 µl PK Solution totale 210 µl 2. Vortexer pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement. 3 Traitement des échantillons avec la MagMAX™ CORE Lysis Solution et la PK Solution ™ 1. Ajouter 200 µl de MagMAX CORE Lysis Solution à chaque échantillon, puis mélanger immédiatement par aspiration-refoulement. 2. Ajouter 210 µl de PK solution, puis vortexer soigneusement. 3. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 4. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 70°C sans agiter. 5. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 10 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 4 Préparation des plaques de traitement 1. Préparer les plaques de traitement. Tableau 7 Configuration de la plaque : instrument MagMAX™ Express-96 ou KingFisher™ Flex Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de la plaque [1] Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument KingFisher ™ Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 15. ™ 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 5 1. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon (jusqu’à 610 μl) dans les puits appropriés de la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes. Mélanger les échantillons avec le mélange de Binding/Bead ™ 2. Bien vortexer le MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. 3. Préparation du mélange de Binding/Bead : mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl MagMAX CORE Magnetic Beads 20 μl Mélange de Binding/Bead total 420 µl ™ 4. Remuer le mélange de Binding/Bead par retournement jusqu’à ce que la solution soit homogène, puis ajouter 420 μl du mélange de Binding/Bead dans chaque échantillon. 5. Procéder immédiatement au traitement des échantillons sur l’instrument (section suivante). 6 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). Placement des échantillons dans l’instrument 2. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 11 Préparation des échantillons en vue de leur purification avec d’autres kits Préparer les échantillons comme décrit. Type d’échantillon Action Liquide synovial ou liquide trachéobronchique Procéder avec 200 µl de liquide. Lait (individuel) Procéder avec 200 µl de lait entier. Lait (mélange) 1. Transférer 700 µl de laits de mélange dans un microtube de 1,5 ml. 2. Ajouter 700 µl de PBS (1X), pH 7,4, puis centrifuger à 1 500 × g pendant 10 minutes. 3. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette. 4. Procéder avec le culot cellulaire. Si nécessaire, stocker le culot cellulaire en-dessous de -16°C jusqu’à 1 mois, ou en-dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Organe (poumon) Pour la purification manuelle de l’ADN : hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile, en utilisant des pinces et un scalpel stériles, puis traiter 20 à 30 mg d’organe haché. Pour la purification automatisée de l’ADN : préparer les échantillons de la manière décrite. 1. Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une pince et d’un scalpel stériles. 2. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7,4 : 1 ml • Microbilles en verre (3 mm de diamètre) : 1 à 3 billes 3. Broyer (agiter avec les billes) les échantillons. Sinon, si aucun broyeur de tissus n’est disponible, vortexer pendant 30 secondes à 1 minute. • Broyeur Precellys™ 24 : 6 000 tr/min pendant 40 secondes • Instrument FastPrep‑24™ : 6 m/s pendant 45 secondes • Mixer Mill MM 400 : 30 Hz pendant 2 minutes 4. Centrifuger à 1 500 × g pendant 2 minutes. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. Colonies microbiennes Procéder avec 200 µl de suspensions bactériennes. Purification de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit • Reconstitution des tampons AW1 et AW2 Buffer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 Lyse et homogénéisation des échantillons 1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin • 200 µl d’échantillon liquide Échantillon préparé • 20 à 30 mg d’organe haché — • Culot cellulaire PBS (1X), pH 7,4 — 200 µl Tampon ATL 180 µl 180 µl Protéinase K 20 μl 20 μl 2. Vortexer pendant 15 secondes. 12 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 1 Lyse et homogénéisation des échantillons (suite) 3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes. 4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 5. Ajouter 200 µl d’AL Buffer, puis vortexer pendant 15 secondes. 6. Incuber à 70°C pendant 10 minutes. 7. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement. 8. Ajouter 200 µl d’éthanol 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis centrifuger rapidement pour recueillir le contenu. 2 ™ 1. Insérer une colonne QIAamp DNA Mini Kit dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du volume de l’échantillon dans la colonne. Liaison de l’ADN à la colonne 2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 15 000 × g pendant 1 minute. 3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3 1. Ajouter 500 μl de tampon AW1 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g pendant 1 minute. Lavage et élution de l’ADN 2. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3. Ajouter 500 μl de tampon AW2 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g pendant 1 minute 4. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 5. Centrifuger à 15 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane. 6. Jeter le tube collecteur. 7. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl de tampon AE Buffer. 8. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. 9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ADN purifié se trouve dans le microtube. Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit • Reconstitution du tampon B5 Buffer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. • Reconstitution de la PK : ajouter le volume requis de tampon PK Buffer selon les recommandations du fournisseur. ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 13 Réalisation de la procédure de purification 1 Lyse et homogénéisation des échantillons 1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin • 200 µl d’échantillon liquide Échantillon préparé • 20 à 30 mg d’organe haché — • Culot cellulaire PBS (1X), pH 7,4 — 200 µl Tampon T1 180 µl 180 µl Protéinase K 25 µl 25 µl 2. Vortexer pendant 15 secondes. 3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes. 4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 5. Ajouter 200 µl de B3 Buffer, puis vortexer pendant 15 secondes. 6. Incuber à 70°C pendant 10 minutes. 7. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement. 8. Ajouter 200 µl d’éthanol 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis centrifuger rapidement pour recueillir le contenu. 2 Liaison de l’ADN à la colonne ™ 1. Insérer une colonne de kit NucleoSpin Tissue dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du volume de l’échantillon dans la colonne. 2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 11 000 × g pendant 1 minute. 3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3 Lavage et élution de l’ADN 1. Ajouter 500 μl de tampon BW Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 11 000 × g pendant 1 minute. 2. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3. Ajouter 500 μl de tampon B5 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 11 000 × g pendant 1 minute 4. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 5. Centrifuger à 11 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane. 6. Jeter le tube collecteur. 7. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl de tampon BE Buffer. 8. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. 9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ADN purifié se trouve dans le microtube. 14 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 3 Lavage et élution de l’ADN (suite) Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. • Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ™ ™ Suivre cette procédure pour la purification avec le MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit à l’aide de l’instrument KingFisher Duo ™ Prime ou KingFisher mL. Matériels requis non fournis Tableau 8 Matériels requis pour le traitement avec les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Source[1] Élément Consommables pour l’instrument KingFisher™ Duo Prime KingFisher™ Duo Pack Combi pour plaque Microtiter 96 Deepwell (peignes, plaques et barrettes d’élution pour 96 échantillons) 97003530 KingFisher™ Duo Elution Strip (40 pièces)[2] 97003520 KingFisher™ Duo 12-tip comb for Microtiter 96 deep-well plate (50 pièces)[2] 97003500 KingFisher™ Flex Microtiter Deep-Well 96 plates[2] 95040460 Consommables pour l’instrument KingFisher™ mL KingFisher™ mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141 KingFisher™ mL Peigne (800 unités) 97002111 KingFisher mL Tube (20 x 45 unités) 97002121 ™ [1] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. [2] Inclus dans le pack KingFisher™ Duo Combi (cat. n° 97003530). Procédure de purification ™ Remarque : Pour la réalisation de cette procédure pour un traitement sur l’instrument KingFisher mL, mélanger les échantillons par aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument. 1. Suivre le protocole, de la préparation du broyat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution de lyse. Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons. ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit 15 ™ ™ ™ 2. Ajouter la MagMAX CORE Wash Solution 1, la MagMAX CORE Wash Solution 2 et le MagMAX CORE Elution Buffer aux positions indiquées, selon votre instrument. Tableau 9 Configuration de la plaque : instrument KingFisher™ Duo Prime [1] [2] ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon A Deep Well Mélange billes / lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution[1] Barrette de tubes séparée[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne H Deep Well Placer un peigne protecteur dans la plaque. S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution. Placée sur l’élément chauffant. Tableau 10 Configuration de la barrette de tubes : instrument KingFisher™ mL ID de la position Position de la barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits Échantillon 1 Standard Mélange billes / lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne N/A N/A Glisser le peigne dans le support pour peigne. 3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). 4. Démarrer le test, puis charger en même temps les plaques ou les barrettes de tubes préparées dans l’instrument. L’instrument ne vous invite pas à charger les éléments individuellement. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Annexe B Documentation et support Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. 16 ™ Guide complémentaire de VetMAX M. bovis Kit Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0019166 B.0 . Historique des révisions : Pub. nº MAN0019166 B.0 Révision Date Description • Une procédure pour extraire les acides nucléiques des échantillons de semences a été ajoutée au document. ™ B.0 30 juin 2023 • Des scripts express ont été ajoutés pour la purification automatisée d’acides nucléiques à l’aide du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit. ™ • Le protocole de purification du MagVet Universal Isolation Kit a été enlevé du document. Nouveau document traduit à partir d’un document en français (MAN0008810 rév. B.0) avec les mises à jour suivantes : A.0 24 avril 2020 ™ • Ajout du protocole du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit. • Modifications mineures de la formulation et de la mise en page pour plus de cohérence avec les documents connexes. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2020-2023 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. FastPrep-24 est une marque de MP Biomedicals, LLC. Precellys est une marque de Bertin Technologies. QIAamp est une marque de QIAGEN GmbH. Nucleospin est une marque de MACHEREY-NAGEL. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 26 septembre 2023 ">
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