MACHEREY-NAGEL Bioanalysis Biologie Moléculaire User manual Manuel d’utilisation ADN génomique des échantillons de fèces n NucleoSpin® DNA Stool Février 2023 / Rev. 04 www.mn-net.com www.mn-net.com ADN génomique des échantillons de fèces Résumé du protocole (Rev. 04) NucleoSpin® DNA Stool MN Bead Tube Type A 1 Préparer l’échantillon 180 – 220 mg d’échantillon 850 μL ST1, Agiter horizontallement 2 – 3 s 2 Lyser l’échantillon 70 °C, 5 min Vortexer pendant 10 min à TA vitesse max. sur le MN Bead Tube Holder placé sur un Vortex-Genie® 2 13,000 x g, 3 min Transférer 600 μL de surnageants 100 μL ST2 3 P récipiter les contaminants Vortexer 5 s Incuber 5 min, 2 – 8 °C 13,000 x g, 3 min Transférer 550 μL de lysat clarifié sur une colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal 4 Filtrer le lysat 13,000 x g, 1 min 5 Ajuster les conditions de fixation de l’ADN 200 μL ST3 Vortexer 5 s Déposer 700 μL d’échantillon sur une colonne NucleoSpin® DNA Stool 6 Fixer l’ADN 13,000 x g, 1 min 1 7 L aver la membrane de silice er 600 μL ST3 13,000 x g, 1 min ème 2 550 μL ST4 13,000 x g, 1 min 3 700 μL ST5 Vortexer 2 s 13,000 x g, 1 min 4 700 μL ST5 13,000 x g, 1 min ème ème 8 S écher la membrane de silice 13,000 x g, 2 min 9 Eluer l’ADN purifié 13,000 x g, 1 min 30 – 100 μL SE Vortexer 2 s MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: [email protected] Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-333 E-mail: [email protected] USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: [email protected] France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: [email protected] MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: [email protected] www.mn-net.com ADN génomique des échantillons de fèces Sommaire 1 2 Composition 4 1.1 Composants des kits 4 1.2 Réactifs, consommables et équipement nécessaires 5 1.3 A propos de ce manuel d’utilisation 5 Description du kit 6 2.1 Principe général 6 2.2 Caractéristiques du kit 7 2.3 Quantité d’échantillon 7 2.4 Lyse de l’échantillon 8 2.5 Clarification du lysat et fixation de l’ADN 9 2.6 Procédure de lavage 9 2.7 Procédures d’élution 9 2.8 Estimation du rendement et de la qualité de l’ADN 10 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 11 4 Instructions de sécurité 12 4.1 Elimination des déchets 12 5 Protocole de purification pour les fèces fraîches ou congelées 13 6 Annexes 18 6.1 Guide de résolution des problèmes 18 6.2 Informations de commande 20 6.3 Restrictions d’utilisation / garantie 21 6.4 Versions linguistiques et prédominance 21 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 3 ADN génomique des échantillons de fèces 1 Composition 1.1 Composants des kits NucleoSpin® DNA Stool 10 preps 740472.10 50 preps 740472.50 250 preps 740472.250 Tampon de lyse ST1 20 mL 50 mL 2 × 125 mL Tampon de lyse ST2 10 mL 10 mL 50 mL Tampon de fixation ST3 10 mL 60 mL 2 × 125 mL Tampon de lavage ST4 6 mL 30 mL 2 × 75 mL Tampon de lavage ST5 (Concentré)* 6 mL 25 mL 1 × 25 mL 1 × 50 mL Tampon d’élution SE** 13 mL 13 mL 30 mL MN Bead Tubes Type A 10 50 250 ® Colonnes NucleoSpin Inhibitor Removal (Bagues rouges) 10 50 250 Colonnes NucleoSpin® DNA Stool (Bagues vertes) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL, avec bouchons) 10 50 250 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF * pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3. ** Composition du tampon d’élution SE: Tris/HCl 5 mM; pH 8.5 4 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 ADN génomique des échantillons de fèces 1.2 Réactifs, consommables et équipement nécessaires Réactifs • Ethanol 96 – 100 % Consommables • Tubes 1,5 mL avec bouchons • Tubes 2,0 mL avec bouchons • Tubes collecteurs 2 mL sans bouchons (optionnel) • Cônes jetables Equipement • Pipettes manuelles • Centrifugeuse pour microtubes • Equipement de protection individuelle (ex: blouse, gants, lunettes de protection) • Appareil pour le broyage des échantillons: Le support ’MN Bead Tube Holder’ (REF 740469, voir ’Informations de commande’, paragraphe 6.2) est recommandé en combinaison d’un Vortex-Genie® 2 pour bénéficier d’une solution économique et efficace pour l’homogénéisation des échantillons de fèces. L’adaptateur ’Vortex Adapter’ (MoBio) pour Vortex-Genie® 2 X est également utilisable. Alternativement, des broyeurs pour tubes de billes peuvent être utilisés (ex: mixer mill MM200, MM300, MM400 (Retsch®)). L’utilisation d’autres appareils de broyage comme le système FastPrep® (MPBiomedicals), Precellys® (Bertin Technologies), MagNA™ Lyser (Roche), TissueLyser (QIAGEN), Bullet Blender® (Next Advance), Mini-Beadbeater™ (Biospec Products), Speed Mill (Analytik Jena) ou tout autre équipement similaire peut entraîner la destruction des tubes à billes. De tels appareils induisent un stress mécanique important. En fonction du type de tube de broyage et de son contenu (par exemple billes métalliques, volume de liquide, type d’échantillon), et en particulier à haute fréquence d’agitation et/ou si la durée d’agitation est importante, les tubes peuvent être endommagés. Lors de l’utilisation de ces appareils, il est de la responsabilité de l’utilisateur d’effectuer un test préalable de stabilité afin de s’assurer du maintien de l’intégrité des tubes (ex: compatibilité avec l’intensité et la durée d’agitation). 1.3 A propos de ce manuel d’utilisation Il est fortement recommandé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSpin® DNA Stool de lire la version détaillée du protocole. Les utilisateurs expérimentés pourront utiliser le résumé du protocole pour un suivi rapide de la succession des étapes de la procédure. Toute la littérature technique est disponible en ligne: www.mn‑net.com. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 5 ADN génomique des échantillons de fèces 2 Description du kit 2.1 Principe général Le kit NucleoSpin® DNA Stool est conçu pour l’extraction efficace à la fois de l’ADN génomique microbien et aussi de l’ADN de l’hôte, à partir d’échantillons de fèces fraiches ou congelées. Le kit contient un tampon de lyse spécifique ST1 qui, utilisé en combinaison avec une étape de chauffe de 5 minutes, constitue une lyse chimique efficace des membranes avant la lyse mécanique avec les tubes de broyage NucleoSpin® Beads Tubes Type A (contenant des billes de broyage en céramique) agités dans un dispositif de broyage adéquat (voir 1.2). Aucune réaction enzymatique comme la digestion par des protéases n’est nécessaire pour l’homogénéisation de l’échantillon. Les matières insolubles de l’échantillon et les billes en céramique sont ensuite éliminées par une courte centrifugation. Les protéines et inhibiteurs de PCR présents dans l’échantillon de fèces sont précipités par l’ajout du tampon ST2 au cours d’une brève incubation à froid, suivie d’une étape de centrifugation permettant l’élimination des impuretés. Le surnageant est finalement clarifié lors du passage à travers une colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal, éliminant totalement les substances issues de l’échantillon et susceptibles d’interférer sur les réactions enzymatiques. Les conditions de fixation sont créées par ajout du tampon de fixation ST3 au filtrat issu de la colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal et l’échantillon est ensuite chargé sur la colonne NucleoSpin® DNA Stool. Les contaminants résiduels comme les polysaccharides complexes, les sels biliaires et d’autres inhibiteurs de PCR sont éliminés lors d’une procédure de lavage performante faisant intervenir le tampon de fixation ST3 et les tampons de lavage ST4 et ST5. Après séchage de la membrane, l’ADN purifié prêt à l’emploi est élué dans le tampon d’élution. 6 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 ADN génomique des échantillons de fèces 2.2 Caractéristiques du kit Table 1: Résumé des caractéristiques du kit Paramètre NucleoSpin® DNA Stool Technologie Technologie membrane de silice Format Mini colonne à centrifuger Nature des échantillons Fèces (fraiches ou congelés) Quantité de l’échantillon 180 – 220 mg* Rendement 2 – 10 μg (selon l’échantillon et la méthode de broyage) Volume d’élution 30 – 100 μL Temps de préparation 60 min/10 preps Capacité de fixation 50 μg 2.3 Quantité d’échantillon NucleoSpin® DNA Stool est optimisé pour une quantité de 180 – 220 mg de fèces humaines. Pour les échantillons animaux, une quantité moindre peut être préférable. Les échantillons de fèces très sèches, comme celles de lapin ou de souris peuvent absorber le tampon de lyse, induisant un volume insuffisant après la première centrifugation. Dans ce cas, il est recommandé de réduire la quantité d’échantillon à environ 60 – 80 mg et d’augmenter le volume total de lyse à 1 mL. Un mélange 1 :1 de tampon de lyse ST1 et d’eau exempte de nucléases est conseillé pour ces échantillons (voir aussi 2.4 pour des informations détaillées à propos de la quantité d’échantillon et des conditions de lyse). Pour les échantillons de fèces difficiles, par exemple riches en lipides, polysaccharides ou protéines, une diminution de la prise d’essais peut également s’avérer bénéfique en améliorant l’efficacité de la lyse et la pureté de l’ADN. Il est préférable dans ce cas de débuter l’extraction à partir de 60 – 80 mg. Les échantillons d’origine humaine peuvent aussi contenir des matières non digérés (ex: peaux de fruits ou de céréales, graines). Ces particules ne doivent pas être transférées dans les tubes de broyage MN Bead Tubes. * Pour les échantillons humains utiliser environ 200 mg. Pour les échantillons de provenance animale - selon l’espèce - une quantité moindre peut s’avérer préférable pour des résultats optimaux. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 7 ADN génomique des échantillons de fèces 2.4 Lyse de l’échantillon Une lyse complète de l’échantillon est essentielle pour l’obtention d’un rendement élevé d’ADN et afin d’éliminer les contaminants pendant la procédure de purification sur colonne de silice. Comme les échantillons de fèces contiennent un mélange complexe de résidus alimentaires, de lipides, de protéines, de sels biliaires et de polysaccharides, la lyse chimique effectuée par le tampon ST1 est amplifiée par une étape de chauffage à 70 °C pendant 5 minutes. Cette étape de traitement thermique améliore la lyse et la solubilisation des composants des fèces. Il est nécessaire d’agiter les échantillons horizontalement pendant 2 – 3 secondes après l’ajout du tampon ST1 et avant l’incubation à chaud afin de mélanger l’échantillon et le tampon de lyse (prendre deux tubes de broyage MN Bead Tubes entre le pouce et l’index et agiter vigoureusement pendant 2 – 3 s). Pour certains échantillons d’origine animale, par exemple les fèces d’herbivores comme le lapin ou le mouton, l’étape d’incubation à 70 °C peut être omise. L’étape de broyage avec les billes est suffisante pour lyser ces échantillons. L’étape suivante d’homogénéisation dans les MN Bead Tubes dissout totalement l’échantillon de fèces dans le tampon de lyse et brise les cellules microbiennes. Même les fèces solides et sèches comme celles de souris seront mise en suspension après 10 minutes d’agitation sur un vortex ou dans un broyeur de type Retsch® 300 MM pendant 30 – 60 secondes à une fréquence de 30/s (les conditions optimales de lyse mécaniques sont à ajuster en fonction de l’appareil utilisé). Les billes de céramique incluses s’avèrent être les plus performantes avec le support MN Bead Tube Holder (REF 740469) placé sur un Vortex-Genie® 2 (Scientific Industries Inc.). Voir le manuel d’utilisation du ’’MN Bead Tube Holder” pour l’utilisation de cet adaptateur. Voir les recommandations suivantes pour optimiser les conditions de lyse : Table 2: Quantité d’échantillon et conditions de lyse recommandées Quantité Volume de tampon Traitement thermique Omnivores et carnivores, ex: humains ou félins (contenu en eau moyen à élevé, parfois visqueux) 180 – 220 mg 850 μL ST1 Yes Herbivores, ex: mouton ou lapin (faible teneur en eau, riche en fibres) 60 – 80 mg 500 μL ST1 plus 500 μL eau* No Fèces très solides et sèches, ex : fèces sèches de souris (très faible teneur en eau) 60 – 70 mg 500 μL ST1 plus 500 μL eau* Yes Echantillon de Fèces * diluer le tampon ST1 avec de l’eau nucléases-free. 8 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 ADN génomique des échantillons de fèces 2.5 Clarification du lysat et fixation de l’ADN Le lysat est clarifié en deux étapes. Lors de la première étape, les contaminants sont précipités par ajout du tampon de lyse ST2 et incubation à 2 – 8 °C pour potentialiser la précipitation. Afin de permettre un transfert de température efficace pendant cette courte incubation, il est recommandé d’utiliser des racks de tubes pré-refroidis sur la glace pilée dans une boite en Styrofoam™ ou dans un réfrigérateur. Une colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal est utilisée pour l’élimination finale des contaminants contenus dans le lysat. Après ajout du tampon de fixation ST3 au filtrat de la colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal, l’ADN est fixé efficacement à la colonne NucleoSpin® DNA Stool. 2.6 Procédure de lavage La procédure de lavage effectuée dans le protocole NucleoSpin® DNA Stool est optimisée pour éliminer les contaminants résiduels fixés à la membrane de silice. Elle débute par un lavage avec le tampon de fixation ST3, suivi d’un second lavage avec le tampon de lavage ST4, contenant également un sel de guanidine. Le troisième et quatrième lavage sont menés avec le tampon de lavage ST5, faiblement salin. La courte étape de vortex de la colonne NucleoSpin® DNA Stool après le premier lavage avec ST5 a pour but d’éliminer les potentiel contaminants en sels de guanidine déposés sur le plastique de la colonne et le bouchon. Comme le sel de guanidine utilisé possède une absorbance élevée à 230 nm, cette étape permet d’améliorer le ratio A260/ A230. La seconde étape de lavage avec ST5 peut être effectuée par centrifugation seule, sans vortex préalable de la colonne. 2.7 Procédures d’élution Il est possible d’ajuster le volume de tampon d’élution en fonction des applications avales auxquelles l’ADN purifié sera soumis. En plus de la procédure standard, une augmentation de la concentration est possible en réduisant le volume d’élution de 100 à 30 µL. Si un volume d’élution inférieur à 100 µL est utilisé pour l’élution, il est important de pipeter le tampon d’élution directement au centre de la membrane de la colonne NucleoSpin® DNA Stool afin de mouiller la membrane totalement. Incuber la colonne NucleoSpin® DNA Stool pendant 1 minute à température ambiante après le dépôt du tampon d’élution améliore également l’efficacité de l’élution lorsque le volume déposé est inférieur à 100 µL. Si l’élution est menée dans un volume de 30 µL, le rendement peut être amélioré en rechargeant le tampon d’élution sur la colonne. Après une première élution, pipeter les 30 µL et les déposer une nouvelle fois sur la membrane de la colonne NucleoSpin® DNA Stool et centrifuger à nouveau pendant 1 minute à 13,000 x g. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 9 ADN génomique des échantillons de fèces 2.8 Estimation du rendement et de la qualité de l’ADN La méthode la plus couramment utilisée pour quantifier l’ADN est la spectrophotométrie UV-VIS. La concentration de l’ADN dans la fraction finale éluée peut être déduite à partir de l’absorption maximale à 260 nm (A260). Cependant, cette mesure implique l’absence de contaminants susceptibles de contribuer significativement à l’absorption totale à 260 nm, pouvant donc induire à une surestimation de la concentration en ADN. Ratio de pureté A260/A280 Le principal indicateur de pureté est le ratio A260/A280, qui doit se situer entre 1,7 et 1,9. Des valeurs inférieures à 1,7 indiquent une contamination en protéines. Ratio de pureté A260/A230 Un autre indicateur de pureté de l’ADN est le ratio d’absorption à 260 nm et 230 nm. A260/ A230 doit excéder 2,0 pour indiquer la pureté de l’ADN et est acceptable jusqu’à environ 1,5. Des ratios autour de 1,0 indiquent des impuretés dans la fraction d’ADN éluée, pouvant être de différentes natures, plusieurs composants absorbant à ces longueurs d’onde. 10 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 ADN génomique des échantillons de fèces 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention: les tampons ST3 et ST4 contiennent du thiocyanate de guanidine et du chlorhydrate de guanidine, respectivement. Porter des gants et des lunettes de protection ! Conditions de stockage : • Tous les composants doivent être stockés à température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit. Le stockage à des températures inférieures peut induire la précipitation de sels. Le cas échéant, incuber les flacons pendant quelques minutes à environ 30 – 40 °C et mélanger jusqu’à dissolution totale des précipités. Avant de débuter la procédure NucleoSpin® DNA Stool, préparer : • Tampon de lavage ST5 : Ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) dans le flacon de tampon ST5 concentré. Indiquer sur le flacon que l’éthanol a bien été ajouté. Le tampon ST5 est stable à température ambiante (15 – 25 °C) pendant au moins 1 an. NucleoSpin® DNA Stool REF Tampon ST5 (Concentré) 10 preps 740472.10 50 preps 740472.50 250 preps 740472.250 6 mL Ajouter 24 mL d’éthanol 25 mL Ajouter100 mL d’éthanol 25 mL Ajouter 100 mL d’éthanol 50 mL Ajouter 200 mL d’éthanol MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 11 ADN génomique des échantillons de fèces 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® DNA Stool, portez des vêtements de protection appropriés (par exemple: une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn‑net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon ST4 et le thiocyanate de guanidinium dans le tampon ST3 peuvent former des composés hautement réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus de la procédure. Les déchets générés par le kit NucleoSpin® DNA Stool n’ont pas été testés pour la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. 12 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 ADN génomique des échantillons de fèces 5 Protocole de purification pour les fèces fraîches ou congelées Avant de débuter la préparation: • Vérifier l’absence de précipités dans le tampon de lyse ST1 en incubant le tampon 30 – 40 °C pendant 10 minutes en agitant le flacon toutes les 2 minutes. • Régler un bloc chauffant à 70 °C pour l’étape initiale d’incubation. • Placer un rack de tubes dans une boîte de Styrofoam™ contenant de la glace pilée ou dans un réfrigérateur pour l’étape de précipitation des contaminants à 2 – 8 °C. Il est recommandé de porter une blouse, des lunettes de protection et des gants pendant toute la procédure. 1 Préparer l’échantillon Voir les paragraphes 2.3 et 2.4 pour plus d’informations concernant la quantité d’échantillon et la procédure de lyse recommandée pour les échantillons de fèces en fonction de l’espèces. Transférer 180 – 220 mg de fèces humaines dans un tube de broyage MN Bead Tube Type A. Important: Ne pas surcharger le tube de billes, ceci pourrait réduire le rendement et la pureté de l’ADN obtenu. Il est recommandé d’utiliser une balance appropriée pour mesurer la masse de l’échantillon. 180 – 220 mg d’échantillon + 850 μL ST1 Agiter horizontalement 2–3 s Ajouter 850 μL de tampon ST1. Note: pour les échantillons très secs ou fibreux de fèces animales, il est recommandé d’augmenter le volume total de lyse à 1 mL en ajoutant 0.5 mL de tampon ST1 et 0.5 mL d’eau nucléases-free, les fèces absorbant une partie du volume de lyse. Fermer le tube MN Bead Tube et agiter horizontalement pendant 2 – 3 secondes pour mélanger l’échantillon de fèces et le tampon de lyse avant de le placer dans le bloc chauffant. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 13 NucleoSpin® DNA Stool 2 Lyse de l’échantillon Voir le paragraphe 2.4 pour plus d’information concernant les conditions recommandées pour la lyse et l’homogénéisation selon la nature des échantillons. 70 °C, 5 min Incuber le MN Bead Tubes pendant 5 min à 70 °C. Note: Pour certains échantillons d’origine animale contenant principalement des fibres, par exemple les fèces d’herbivores comme le lapin ou le mouton, l’incubation à 70 °C peut être omise. L’étape de lyse mécanique avec les billes est suffisante (voir le paragraphe 2.4 pour plus d’informations). Agiter le MN Bead Tube dans le support MN Bead Tube Holder placé sur un Vortex-Genie® 2. Vortexer les échantillons à vitesse maximale pendant 10 min à température ambiante. D’autres appareils utilisables (voir 1.2) 3 de broyage sont également Précipiter les contaminants Centrifuger pendant 3 min à 13,000 x g. 13,000 x g, 3 min Transférer 600 μL de surnageant dans un nouveau tube 2 mL avec bouchon (non fourni). Transférer 600 μL de surnageant Note: si le volume disponible est moindre transférer le maximum dans le tube 2 mL. Eviter le transfert de matières du culot ou flottantes. Les fibres ou résidus de peaux peuvent colmater le cône. Aspirer le surnageant lentement et précautionneusement. + 100 μL ST2 Ajouter 100 μL de tampon ST2, fermer le tube et vortexer pendant 5 s. Incuber 5 min à 2 – 8 °C. Centrifuger pendant 3 min à 13,000 x g. 14 Agiter TA, 10 min MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 Vortexer 5 s 2 – 8 °C, 5 min 13,000 x g, 3 min NucleoSpin® DNA Stool 4 Filtrer le lysat Placer une colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal (bague rouge) dans un tube collecteur (2 mL, avec bouchon). Transférer 550 μL de lysat clarifié En évitant le culot, transférer 550 μL de lysat clarifié sur la colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal. Note: si seul un volume moindre est récupérable, transférer le maximum dans la colonne. Eviter de transférer sur la colonne des matières provenant du culot ou flottant au-dessus du lysat. 13,000 x g, 1 min Centrifuger pendant 1 min à 13,000 x g. Jeter la colonne NucleoSpin® Inhibitor Removal. Note: si un culot est visible dans le filtrat, transférer le surnageant clair dans un nouveau tube 2 mL (non fourni). 5 Créer les conditions de fixation Ajouter 200 μL de tampon ST3 et fermer le tube. Vortexer pendant 5 s 6 Fixer l’ADN Placer une colonne NucleoSpin® DNA Stool (bague verte) dans le tube collecteur (2 mL). Déposer 700 μL d’échantillon sur la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 13,000 x g. + 200 μL ST3 Vortexer 5 s Déposer 700 μL d’échantillon 13,000 x g, 1 min Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 15 NucleoSpin® DNA Stool 7 Laver la membrane de silice 1er Lavage Ajouter 600 μL de tampon ST3 à la colonne NucleoSpin® DNA Stool. Centrifuger pendant 1 min à 13,000 x g. + 600 μL ST3 13,000 x g, 1 min Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 2ème Lavage + 550 μL ST4 Ajouter 550 μL de tampon ST4 à la colonne NucleoSpin® DNA Stool. Centrifuger pendant 1 min à 13,000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. 13,000 x g, 1 min 3ème Lavage Ajouter 700 μL de tampon ST5 à la colonne NucleoSpin® DNA Stool. Refermer la colonne et vortexer pendant 2 s. Centrifuger pendant 1 min à 13,000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. + 700 μL ST5 Vortexer 2 s 13,000 x g, 1 min 4ème Lavage Ajouter 700 μL de tampon ST5 à la colonne NucleoSpin® DNA Stool. Centrifuger pendant 1 min à 13,000 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur. + 700 μL ST5 13,000 x g, 1 min Note: le même tube collecteur est réutilisé pendant les lavages pour réduire les déchets. Sinon, des tubes collecteurs supplémentaires sont disponibles séparément. Voir 6.2 ’Informations de commande’. 8 Sécher la membrane de silice Centrifuger pendant 2 min à 13,000 x g. Note: si, pour quelque raison, la colonne NucleoSpin® DNA Stool est entrée en contact avec le filtrat après l’étape de séchage, jeter le filtrat et centrifuger de nouveau. 16 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 13,000 x g, 2 min NucleoSpin® DNA Stool 9 Eluer l’ADN Placer la colonne NucleoSpin® DNA Stool dans un nouveau tube 1.5 mL (non fourni). 30 – 100 μL SE Ajouter 30 μL (pour une concentration maximale), 50 μL (compromis rendement/concentration), ou 100 μL (pour un rendement maximal) de tampon SE dans la colonne. Note: si le volume d’élution utilisé est inférieur, le rendement peut être amélioré en suivant les recommandations du 2.7. Fermer la colonne et centrifuger pendant une 1 min à 13,000 x g. Jeter la colonne NucleoSpin® DNA Stool. 13,000 x g, 1 min Vortex 2 s Vortexer chaque tube d’élution pendant 2 s. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 17 NucleoSpin® DNA Stool 6 Annexes 6.1 Guide de résolution des problèmes Problème Causes possibles et suggestions Conditions de lyse suboptimales • Quantité d’échantillon excessive déposée dans le tube de broyage MN Bead Tube. Manque d’espace vide empêche le mouvement nécessaire des billes pour une efficacité de broyage optimale. Utiliser une moindre quantité d’échantillon (voir paragraphes 2.3 et 2.4 pour plus d’informations). Broyage et/ou homogénéisation insuffisants • Agitation insuffisante des tubes de broyage MN Bead Tube, ou de trop courte durée. Augmenter la durée d’agitation ou la fréquence d’agitation ou utiliser un autre appareil (voir paragraphe 2.4 pour plus d’informations). Mauvaise utilisation ou conservation des réactifs Rendement faible ou nul • Distribuer toujours les volumes exacts recommandés dans le protocole ! • Suivre les instructions concernant les méthodes de mélange (agitation, vortex etc.). • Ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au tampon de lavage ST5 fourni sous forme concentrée et mélanger précautionneusement (voir paragraphe 3 pour plus d’informations). • Stocker les kits à température ambiante. Le stockage à des températures inférieures peut induire la précipitation de sels. Vérifier l’absence de précipité blanc dans le tampon de lyse ST1. En cas de précipité visible, incuber le flacon pendant 10 min à 30 – 40 °C et agiter toutes les 2 minutes jusqu’à dissolution complète du précipité. • Conserver les flacons bien clos pour éviter l’évaporation et les contaminations potentielles. Mauvaise conservation des échantillons de fèces • 18 Les échantillons de fèces doivent être stockés à 2 – 8 °C après collecte. Si l’ADN n’est pas extrait le même jour, congeler les échantillons à -20 °C. Ils devront être décongelés à température ambiante immédiatement avant l’extraction ou laissés une nuit dans un bac de Styrofoam™ rempli de glace pilée. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 ADN génomique des échantillons de fèces Problème Causes possibles et suggestions Broyage mécanique excessivement violent ADN dégradé • Réduire l’intensité ou la durée d’incubation pendant l’étape de lyse mécanique. Rendement d’ADN surestimé • Si l’ADN n’est pas totalement exempt de contaminants, la quantification UV-VIS basée sur la mesure de A260 n’est pas fiable en raison de la contribution des contaminants à l’absorption à 260 nm. Contamination par de l’éthanol ou des sels Performance suboptimale de l’ADN dans les applications • Veiller à bien sécher la membrane de silice de la colonne NucleoSpin® DNA Stool avant l’élution pour éviter la contamination de l’ADN par de l’éthanol du tampon de lavage ST5. • Vérifier que le tampon ST5 est bien à température ambiante avant utilisation. Le lavage avec le tampon à températures inférieures diminue l’efficacité de dessalage du tampon. Contamination par des inhibiteurs de PCR • La pureté de l’ADN peut être améliorée en diminuant la quantité d’échantillon initial (voir paragraphe 2.3 pour plus d’informations). • Suivre scrupuleusement les instructions concernant les différentes étapes de lavages. • Diluer l’ADN à 1 :10 pour réduire la concentration en inhibiteur. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 19 ADN génomique des échantillons de fèces 6.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoSpin DNA Stool 740472.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps MN Bead Tube Holder 740469 1 NucleoSpin® DNA Insect 740470.10 / .50 10 / 50 preps ® 740235.10 / .50 10 / 50 preps ® NucleoSpin Soil 740780.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 preps MN Bead Tubes Type A (billes céramique 0.6 – 0.8 mm ; recommandé pour les fèces, sols, sédiments) 740786.50 50 MN Bead Tubes Type B (billes en verre 40 – 400 μm ; recommandé pour les bactéries) 740812.50 50 MN Bead Tubes Type C (Corindon 1 – 3 mm ; recommandé pour les levures) 740813.50 50 MN Bead Tubes Type D (billes en métal 3 mm ; recommandé pour les insectes) 740814.50 50 MN Bead Tubes Type E 740815.50 (billes en verre 40 – 400 μm et billes en métal 3 mm ; recommandé pour les bactéries difficiles à lyser à l’intérieur des insectes et tissus) 50 MN Bead Tubes Type F (corindon 1 – 3 mm + billes en métal 3 mm ; à utiliser uniquement avec le support MN Bead Tube Holder !) 740816.50 50 Tubes collecteur (2 mL) 740600 1000 ® NucleoSpin Microbial DNA Visitez www.mn‑net.com pour des informations plus détaillées sur les produits. 20 MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 ADN génomique des échantillons de fèces 6.3 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tél : +49 24 21 969 333 [email protected] 6.4 Versions linguistiques et prédominance Ce document est disponible en plusieurs langues. En cas de divergence ou de problème d’interprétation, la version anglaise prévaut. MACHEREY-NAGEL – 02/2023, Rev. 04 21 www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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