GUIDE COMPLÉMENTAIRE VetMAX™ African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 Protocoles de purification d’ADN à utiliser avec le kit (réf. A57008) Référence catalogue A57008 Pub. nº MAN0030049 Rév. A Espèces Échantillons[1] Type de test Porcin et sanglier Sang total, sérum, tissus, organes lymphoïdes, fluides oraux, exsudat musculaire, écouvillons, papier buvard, chiffonnettes (échantillons environnementaux) Échantillons en mélange (jusqu’à 20 échantillons[2]) [1] [2] Individuel Pour la France, seuls les types d’échantillons indiqués dans le document de spécifications français ANSES (2024) pour la présentation des réactifs PCR détectant le virus de la peste porcine africaine (PPA) ont été validés. Les recommandations et réglementations relatives au mélange peuvent varier selon les pays. Pour la Pologne, suivre les exigences locales : mélanger jusqu’à 5 échantillons. Pour la France, suivre les exigences locales : mélanger jusqu’à 5 échantillons de sang total. AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité concernant les risques biologiques sur la page du produit à l’adresse thermofisher.com. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection appropriés. ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ Objectif de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Sélection de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Stockage de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Matériel requis non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Instructions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Purifier de l’ADN avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Annexe A Purification de l’acide nucléique avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ■ ■ Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Procédure de purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Annexe B Documentation et support ■ ■ Assistance à la clientèle et support technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Garantie limitée du produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Pour usage en laboratoire. Objectif de ce guide Ce guide décrit les méthodes de purification de l’ADN pour le virus de la peste porcine africaine à partir d’échantillons (sang total, ™ sérum, tissus, organes, fluides oraux, exsudat musculaire, écouvillons, papier buvard et chiffonnettes) à l’aide du MagMAX CORE ™ Nucleic Acid Purification Kit. Les méthodes ont été validées et optimisées pour une utilisation ultérieure avec l’Applied Biosystems ™ VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 (réf. A57008). Sélection de l’échantillon Type d’échantillon Type d’analyse Quantité requise et matériel de prélèvement Sang total Individuel ou en mélange[1] 100 μl de sang total recueilli dans des tubes EDTA Sérum Individuel ou en mélange 100 μl de sérum recueilli dans des tubes secs Individuel ou en mélange 20 à 30 mg de tissu Exsudat musculaire Individuel 100 µl de liquide Écouvillons Individuel Écouvillon sec stérile Papier buvard Individuel 1 disque Whatman™, grade 3 Chiffonnettes (échantillons environnementaux) Individuel 1 kit de chiffonnettes stériles Sodibox (A04122C) N/A[2] 300 µl de liquide Tissus Organes Fluides oraux [1] Les recommandations et réglementations relatives au mélange peuvent varier selon les pays. Pour la Pologne, suivre les exigences locales : mélanger jusqu’à 5 échantillons. Pour la France, suivre les exigences locales : mélanger jusqu’à 5 échantillons de sang total. [2] Un mélange d’animaux ou d’échantillons différents est utilisé pour ce type d’échantillon. Stockage de l’échantillon Type d’échantillon Sang total (dans un tube EDTA) Sérum (dans un tube sec) Exsudat musculaire Conservation Après le prélèvement, stocker les échantillons à une température comprise entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 8 jours au maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 8 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Écouvillons Papier buvard Chiffonnettes (échantillons environnementaux) Tissus Organes Fluides oraux Après le prélèvement, stocker les échantillons à une température comprise entre 2°C et 8°C si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement. Après utilisation ou expiration du délai de 24 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de -70°C pour une conservation au-delà de 1 an. Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 7 jours maximum). Après utilisation ou expiration du délai de 7 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pendant 1 an au maximum ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. 2 ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 Matériel requis non fourni Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits. Tableau 1 Matériel requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons Élément Source Instrument, parmi les modèles suivants : KingFisher™ Flex Purification System Contacter votre représentant commercial local. KingFisher™ Apex Purification System MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor KingFisher™ Duo Prime Purification System KingFisher™ mL Purification System Équipement Poste de sécurité microbiologique de type II (PSMII) PFL Centrifugeuse de paillasse PFL Centrifugeuse de paillasse pouvant atteindre 15 000 × g (pour tube de 1,5 à 2 ml) Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL Bloc chauffant à 55°C ou 70°C PFL Micropipettes de précision ajustables (gamme de 1 µl à 1 000 µl) PFL Consommables Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 : • KingFisher™ 96 Deep-Well Plate • 95040450 • KingFisher 96 KF microplates • 97002540 • KingFisher™ 96 tip comb for deep-well magnets • 97002534 Consommables pour l’instrument KingFisher™ Apex : • Peigne 96 PCR KingFisher™ Apex • 97002560 ™ • KingFisher Apex 96 Combi tip comb • 97002570 • Plaque deep well à 96 puits KingFisher™ • 95040450B ™ Consommables pour les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Voir Tableau 6 en page 12. Embouts de pipette résistants aux aérosols, sans nucléase PFL Microtubes sans nucléase de 1,5 ml et 2,0 ml PFL Réservoir de réactifs PFL Adhesive PCR Plate Foils, ou l’équivalent AB0626 Kits et réactifs MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit A32700 ou A32702 Provenant du VetMAX™ African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 5 – IPC ASFV 2.0 Eau exempte de nucléases (pour les échantillons de contrôle négatif d’extraction) Solution saline tamponnée au phosphate (PBS (1X), pH 7.4) ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 AM9932 PFL 3 Tableau 2 Matériel supplémentaire nécessaire pour la purification à partir d’échantillons d’organes Élément Source Équipement Broyeur de tissus pour l’agitation, parmi les modèles suivants ou équivalents : • Fisherbrand™ Bead Mill 24 Homogenizer • Fisher Scientific 15-340-163 • Broyeur Precellys 24 (Bertin) • Bertin EQ03119.200.RD000.0 • Instrument FastPrep‑24™ (MP Biomedical 116004500) • Fisher Scientific MP116004500 • Mixer Mill MM 400 (Verder 207450001) • Fisher Scientific 08 418 241 ™ Balance de précision PFL PYREX Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) ou billes en verre de 3 mm équivalentes Fisher Scientific™ 11-312-10A ™ Scalpels et pinces métalliques (stériles) PFL Consommables Boîte de Petri (stérile) PFL Instructions • Préparer au moins un échantillon témoin à utiliser en tant que contrôle négatif d’extraction. Utiliser du PBS ou de l’eau sans nucléase au lieu de l’échantillon testé, sauf indication contraire. Traiter l’échantillon témoin en même temps que les échantillons testés, en utilisant le même protocole de purification de l’acide nucléique. • Du matériel provenant d’un autre fournisseur de matériel de laboratoire peut être utilisé. Purifier de l’ADN avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Flex ™ • KingFisher Apex ™ • MagMAX Express-96 Suivre l’Annexe A, “Purification de l’acide nucléique avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” en cas d’utilisation des instruments suivants : ™ • KingFisher Duo Prime ™ • KingFisher mL Méthode Suivre la méthode appropriée en fonction de votre type d’échantillon. • Purification de l’ADN à partir de sang total, sérum, exsudat musculaire, écouvillons, papier buvard, chiffonnettes, tissus et échantillons d’organes (Méthode Incubation–Plus) (page 7) 4 ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 • Purification de l’ADN à partir d’échantillons de fluides oraux (Méthode Complexe) (page 10) Purification de l’ADN à partir de sang total, sérum, exsudat musculaire, écouvillons, papier buvard, chiffonnettes, tissus et échantillons d’organes (Méthode Incubation– Plus) Préparation des plaques pour le traitement Préparation du mélange PK Préparer l’échantillon Traitement des échantillons avec Lysis Solution et le mélange PK Combinaison des échantillons avec le mélange Binding / Beads / IPC Traitement des échantillons dans l’instrument Purification de l’ADN à partir d’échantillons de fluides oraux (Méthode Complexe) Préparation des plaques Préparation du mélange Beads/PK Préparation de la solution Lysis/IPC Préparation du lysat clarifié Combinaison du lysat clarifié avec le mélange Beads/PK et MagMAX™ CORE Binding Solution Traitement des échantillons dans l’instrument Instructions • Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger. • Pour éviter toute contamination croisée : – Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement. – Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures. • Pour éviter toute contamination par les nucléases : – Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent les acides nucléiques des nucléases présentes sur la peau. – Utiliser des embouts de pipettes exempts des acides nucléiques pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés dans les récipients de réactifs. – Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer. ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 5 Avant la première utilisation du kit (Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes ™ Nous recommandons l’utilisation de Fisherbrand Bead Mill 24 Homogenizer pour un rendement maximal en acides nucléiques. Si un autre instrument est utilisé, suivre les directives du fournisseur pour déterminer les paramètres de vitesse et de temps pour obtenir une lyse de cellules suffisante. Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques Si un agitateur de plaques est utilisé, suivre les étapes suivantes pour déterminer le réglage maximal. 1. Vérifier que la plaque est bien fixée sur l’agitateur. 2. Ajouter 1 ml d’eau dans chaque puits de la plaque, puis couvrir avec une feuille adhésive. 3. Déterminer le réglage maximal qu’il est possible d’utiliser avec l’agitateur afin d'éviter les projections d'eau sur la feuille adhésive. Choisir le script approprié Tableau 3 Scripts selon le type d’échantillon et la méthode Script standard Script express (avec ou sans étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) Méthode Incubation–Plus Autre possibilité Recommandé Méthode Complexe Recommandé Autre possibilité Méthode Type d’échantillon Sang total Sérum Exsudat musculaire Écouvillons Papier buvard Chiffonnettes Tissus Organes Fluides oraux Télécharger et installer le script ™ Le script approprié au MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation. ™ IMPORTANT ! En cas d’utilisation de l’instrument KingFisher Apex, contacter le support technique pour télécharger le script. ™ 1. Sur la page produit du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit sur Internet (sur thermofisher.com, effectuer une recherche à partir de la référence catalogue), aller dans la section Documents. 2. Localiser et télécharger la dernière version du fichier approprié, puis télécharger la dernière version du script MagMAX_CORE pour votre instrument. Tableau 4 Scripts pour l’instrument Nom du script Instrument Script standard Script standard Script express (avec étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) (sans étape d’élution chauffée) MagMAX_CORE_Flex.bdz MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz MagMAX_CORE_Flex_Express.bdz MagMAX_CORE_KF-96.bdz MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz MMC_KF96_Express.kf2 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz MagMAX_CORE_DUO_Express.bdz KingFisher™ mL N/A MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz MagMAX_CORE_mL_Express.bdz KingFisher™ Flex KingFisher 96 ™ MagMAX™ Express-96 6 ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 Pour la France, utiliser un script sans étape d’élution chauffée. 3. Consulter le guide de l’utilisateur de votre instrument ou contacter le support technique pour obtenir les instructions sur l’installation du script. Purification de l’ADN à partir de sang total, sérum, exsudat musculaire, écouvillons, papier buvard, chiffonnettes, tissus et échantillons d’organes (Méthode Incubation–Plus) 1 1. Préparer les plaques de traitement. Préparation des plaques pour le traitement Tableau 5 Configuration de la plaque : instrument MagMAX™ Express-96 ou KingFisher™ Flex Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard ID de la plaque [1] Volume par puits Placer un peigne dans la plaque. Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument ™ ™ KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 12. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange PK Remarque : Préparer le mélange PK immédiatement avant utilisation. 1. Combiner les composants suivants (dans l’ordre indiqué) pour le nombre requis d’échantillons, plus jusqu’à 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon PBS (1X), pH 7.4 200 μl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 μl PK Solution totale 210 μl 2. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 7 3 Préparer l’échantillon Préparer les échantillons selon le type d’échantillon. Type d’échantillon Sang total Action Homogéniser puis procéder avec 100 μl d’échantillon. Sérum Exsudat musculaire Tissus Organes Préparer les échantillons de tissus ou d’organes à l’aide d’un broyeur de tissus. 1. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7,4 : 1 ml • PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes 2. Broyer (les agiter avec les billes) les échantillons. • Fisherbrand™ Bead Mill 24 Homogenizer : 6 m/s pendant 45 secondes • Mixer Mill MM 400 : 30 Hz pendant 5 minutes 3. Centrifuger à 1 000 × g pendant 2 minutes. 4. Procéder avec 200 µl de surnageant. Préparer les échantillons de tissus ou d’organes à l’aide d’un agitateur vortex. 1. Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une pince et d’un scalpel stériles. 2. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu (finement haché) : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7,4 : 1 ml • PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes 3. Vortexer vigoureusement. 4. Centrifuger à 1 000 × g pendant 2 minutes. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. Préparer les échantillons de tissus ou d’organes à l’aide d’une méthode manuelle. 1. Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une pince et d’un scalpel stériles. 2. Ajouter 20 à 30 mg de tissu haché dans un tube de 2 ml, puis passer à la section suivante. Papier buvard 1. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • 5 pièces du disque • PBS (1X), pH 7,4 : 1 ml 2. Vortexer vigoureusement et centrifuger brièvement. 3. Incuber pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. 4. Vortexer vigoureusement et centrifuger brièvement. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. Écouvillons 1. Éluer l'écouvillon dans 1 ml de PBS (1X), pH 7,4 dans un tube de 2 ml. 2. Agiter vigoureusement. 3. Presser l’écouvillon contre la paroi du tube pour en faire sortir le liquide, puis jeter l’écouvillon (en option). 4. Procéder avec 200 μl d’éluat. Chiffonnettes 1. Dans le sachet, ajouter 10 ml de PBS (1X), pH 7,4. 2. Mélanger et conserver le surnageant. 3. Procéder avec 200 μl d’éluat. 8 ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 4 Traitement des échantillons avec Lysis Solution et le mélange PK Nous recommandons d’effectuer cette procédure dans des tubes individuels pour réduire la contamination. Des plaques peuvent être utilisées. Suivre les “Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR” en page 12 pour réduire la contamination. 1. Ajouter le volume approprié de chaque échantillon au tube ou à la plaque (voir “Préparer l’échantillon” en page 8). ™ 2. Ajouter 200 µl de MagMAX CORE Lysis Solution. 3. Vortexer vigoureusement pendant 10 secondes. En cas d’utilisation d’une plaque, la sceller. 4. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu. 5. Ajouter 210 µl de Mélange PK au tube. 6. Incuber le tube avec l’échantillon. Action Type d’échantillon Incuber 10 minutes à 55°C Sang total Sérum Exsudat musculaire Écouvillons Papier buvard Chiffonnettes (échantillons environnementaux) Tissus Incuber 30 minutes à 70°C (recommandé) Organes Sinon, incuber l’échantillon pendant 2 heures à 55°C 7. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. 5 ™ 1. Vortexer soigneusement les MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. Combinaison des échantillons avec le mélange Binding / Beads / IPC 2. Préparer le mélange Binding / Beads / IPC : combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl MagMAX CORE Magnetic Beads 20 μl (En option)[1] 5 – IPC ASFV 2.0[2] 5 μl ™ Mélange Binding / Beads / IPC total [1] [2] 420 µl à 425 μl Obligatoire pour les chiffonnettes (échantillons environnementaux). Fourni avec le VetMAX™ African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 3. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon dans les puits appropriés de la plaque d’échantillon ou la barrette de tubes. Type d’échantillon Volume par échantillon Sang total Sérum Jusqu’à 510 μl Exsudat musculaire Tissus Organes Écouvillons Jusqu’à 610 µl Papier buvard Chiffonnettes ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 9 5 (suite) 4. Homogénéiser le mélange Binding / Beads / IPC par retournement jusqu’à ce que la solution soit homogène, puis ajouter 420 µl du mélange Binding / Beads / IPC dans chaque échantillon. 5. Procéder immédiatement à la mise en place des échantillons dans l’instrument (section suivante). 6 Traitement des échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ADN à partir de fluides oraux (méthode de travail Complexe) 1 Préparation des plaques ™ ™ 1. Préparer les plaques sur l’instrument KingFisher Flex ou MagMAX Express-96. Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. ID de plaque [1] Volume par puits Position sur l’instrument. Remarque : Pour préparer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument ™ ™ KingFisher Duo Prime ou KingFisher mL, voir page 12. 2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées pour le traitement avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient placées dans l’instrument. 2 Préparation du mélange Beads/PK ™ 1. Vortexer soigneusement les MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. 2. Combiner les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus jusqu’à 10 % d’excédent (recommandés). Composant 10 Volume par échantillon MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 µl MagMAX™ CORE Proteinase K 10 µl Mélange Beads/PK total 30 µl ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 3 1. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent. Préparation de la solution Lysis/IPC Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 450 µl (Facultatif) 5 – IPC ASFV 2.0[1] 5 µl Volume total de la solution Lysis/IPC [1] 450 µl à 455 μl Fourni avec VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0. ™ 2. Mélanger en retournant le tube ou la bouteille au moins 10 fois. 4 1. Mélanger brièvement l’échantillon de fluides oraux, puis procéder avec 300 µl d’échantillon. Préparation du lysat clarifié 2. Ajouter la solution Lysis / IPC, puis clarifier le broyat. Équipement de traitement Traitement dans des tubes Action a. Pour chaque échantillon, ajouter 450 µl de solution Lysis / IPC dans un nouveau tube de 2 ml. b. Ajouter 300 µl d’échantillon à la solution Lysis / IPC. c. Vortexer vigoureusement pendant 3 minutes. d. Centrifuger à 15 000 × g pendant 2 minutes. e. Procéder avec 600 μl de surnageant (lysat clarifié). Attention à ne pas perturber le culot. Traitement sur des plaques a. Pour chaque échantillon, ajouter 450 µl de solution Lysis / IPC dans les puits adéquats d’une plaque deep well. b. Ajouter 300 µl d’échantillon à la solution Lysis / IPC. c. Sceller la plaque avec une feuille adhésive. d. Agiter la plaque à une vitesse modérée pendant 5 minutes. e. Centrifuger à 3 000 × g pendant 5 minutes. f. Procéder avec 600 μl de surnageant (broyat clarifié). Attention à ne pas perturber le culot. 5 Combinaison du lysat clarifié avec le mélange Beads/PK et MagMAX™ CORE Binding Solution 1. Retourner plusieurs fois le tube de mélange Beads/PK pour resuspendre les billes, puis ajouter 30 µl de mélange Beads/PK dans les puits requis de la plaque ou de la barrette de tubes. 2. Transférer 600 µl de chaque échantillon de lysat clarifié (voir “Préparation du lysat clarifié”) dans un puits contenant le mélange Beads/PK. 3. Mélanger l’échantillon avec le mélange Beads/PK pendant 2 minutes à température ambiante selon la méthode de votre choix. • Utilisation d’un agitateur de plaques : agiter vigoureusement pendant 2 minutes (voir “Déterminer le réglage maximal de l’agitateur de plaques” en page 6). • Par pipetage : homogénéiser par plusieurs aspiration-refoulement, puis incuber 2 minutes à température ambiante. (Pour le traitement en aval sur l’instrument ™ KingFisher mL, vous devez mélanger en pipetant.) ™ 4. Ajouter 350 µl de MagMAX CORE Binding Solution. 5. Procéder immédiatement à la mise en place des échantillons dans l’instrument (section suivante). ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 11 6 Traitement des échantillons dans l’instrument 1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). 2. Démarrer le test, puis placer les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. • Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. Annexe A Purification de l’acide nucléique avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ™ Suivre cette procédure pour la purification avec le MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit à l’aide de l’instrument KingFisher ™ Duo Prime ou KingFisher mL. ™ Matériels requis non fournis Tableau 6 Matériels requis pour le traitement avec les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Source[1] Élément Consommables pour l’instrument KingFisher™ Duo Prime KingFisher™ Duo Pack Combi pour plaque Microtiter 96 Deepwell (peignes, plaques et barrettes d’élution pour 96 échantillons) 97003530 KingFisher™ Duo Elution Strip (40 pièces)[2] 97003520 KingFisher™ Duo 12-tip comb for Microtiter 96 deep-well plate (50 pièces)[2] 97003500 KingFisher™ Flex Microtiter Deep-Well 96 plates[2] 95040460 Consommables pour l’instrument KingFisher™ mL KingFisher™ mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141 KingFisher™ mL Peigne (800 unités) 97002111 KingFisher mL Tube (20 x 45 unités) 97002121 ™ [1] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. [2] Inclus dans le pack KingFisher™ Duo Combi (cat. n° 97003530). 12 ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 Procédure de purification ™ Remarque : Pour la réalisation de cette procédure pour un traitement sur l’instrument KingFisher mL, mélanger les échantillons par aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques pour mélanger les grandes barrettes de tubes utilisées avec l’instrument. 1. Suivre le protocole, de la préparation du lysat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution Lysis. Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons. ™ ™ ™ 2. Ajouter la MagMAX CORE Wash Solution 1, la MagMAX CORE Wash Solution 2 et le MagMAX CORE Elution Buffer aux positions indiquées, selon votre instrument. Tableau 7 Plan de plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime [1] [2] ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon A Deep Well Lysat d’échantillon/mélange Beads/Binding Varie selon l’échantillon ou la méthode Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution[1] Séparer la barrette de tubes[2] Barrette d’élution MagMAX CORE Elution Buffer 90 µl Peigne H Deep Well ™ Placer un peigne dans la plaque. S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution. Placer sur l’élément de chauffage. Tableau 8 Configuration de la barrette de tubes : instrument KingFisher™ mL ID de la position Position de la barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits Échantillon 1 Standard Lysat d’échantillon/mélange Beads/Binding Varie selon l’échantillon ou la méthode Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne s.o. s.o. Glisser le peigne dans le support pour peigne. 3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Télécharger et installer le script” en page 6). 4. Démarrer le test, puis placer en même temps les plaques ou les barrettes de tubes préparées dans l’instrument. L’instrument ne demande pas de placer les éléments individuellement. Conserver les acides nucléiques purifiés sur de la glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois au maximum ou à -80°C pour une conservation à long terme. Annexe B Documentation et support Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. ™ Guide complémentaire du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 13 Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0030046 B . Historique des révisions : Pub. nº MAN0030046 B Révision Date Description B 24 octobre 2024 De nouveaux types d’échantillons (écouvillons, papier buvard et chiffonnettes) ont été validés et ajoutés pour répondre aux exigences de l’ANSES pour ce kit. A.0 7 mars 2024 ™ Nouveau document pour VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2024-2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 6 janvier 2025 ">
Public link updated
The public link to your chat has been updated.
