Macherey-Nagel NucleoSpin Tissue, Mini kit Mode d'emploi

MACHEREY-NAGEL
Biologie
moléculaire
Bioanalysis
Manuel
d’utilisation
User manual
ADN génomique des tissus
n NucleoSpin® Tissue
Octobre 2024 / Rev. 21
www.mn-net.com
www.mn-net.com
ADN génomique des tissus
Résumé du protocole (Rev. 21)
NucleoSpin® Tissue
1
Préparer l’échantillon
Couper 25 mg en petits morceaux
180 μL T1
2
25 μL Protéinase K
Lyse de l’échantillon
56 °C,
1–3 h
200 μL B3
3
Lyse de l’échantillon
4
Ajustement des
conditions de fixation
70 °C,
10 min
210 μL 96–100 % d’éthanol
Charger les échantillons
5
Fixation de l’ADN
11,000 x g,
1 min
6
Lavage de la
membrane de silice
1er lavage
500 μL BW
lavage
600 μL B5
2
ème
1er et 2ème
7
Séchage de la
membrane de silice
11,000 x g,
1 min
11,000 x g,
1 min
100 μL BE
8
Elution d’ADN très pur
TA,
1 min
11,000 x g,
1 min
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany
Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com
ADN génomique des tissus
Sommaire
1 Composants
5
1.1
Contenu du kit
5
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par l’utilisateur
6
1.3
A propos de ce manuel
6
2 Description du produit
7
2.1
Principe général
7
2.2
Caractéristiques du kit
7
2.3
Procédures d’élution
8
3 Conditions de stockage et préparation des réactifs
10
4 Instructions de sécurité
11
4.1
11
Elimination des déchets
5 Protocole standard pour les tissus humains ou animaux et les cellules en culture
12
6 Protocoles additionnels
15
6.1
15
Protocole additionnel pour les queues de souris ou de rats
6.2
Protocole additionnel pour les bactéries
16
6.3
Protocole additionnel pour la levure
17
6.4
Protocole additionnel pour les taches de sang séché (p.e. NucleoCard®s, FTA® cards,
Guthrie cards)
18
6.5
Protocole additionnel pour l’ADN génomique et l’ADN viral à partir d’échantillons de
sang
19
6.6
Protocole additionnel pour les racines des cheveux
20
6.7
Protocole additionnel pour les tissus inclus en paraffine
21
6.8
Protocole additionnel pour l’ADN génomique provenant des fèces
22
6.9
Protocole additionnel pour la recherche d’ADN viral (p.e. CMV) dans les fèces
23
6.10 Protocole additionnel pour la détection de Mycobacterium tuberculosis ou de Legionella
pneumophila dans les expectorations ou les lavages broncho-alvéolaires
25
6.11 Protocole additionnel pour la détection des bactéries EHEC dans les aliments (p.e. lait
de vache frais)
26
6.12 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN bactérien (p.e. Chlamydia
trachomatis) à partir de cultures, de liquides biologiques ou d’échantillons cliniques.
27
6.13 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN bactérien (p.e. Borrelia burgdorferi) à
partir de l’urine
28
6.14 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN viral (p.e. CMV) à partir de l’urine
28
6.16 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN génomique à partir d’écouvillons
dentaires
31
6.17 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN génomique à partir d’écouvillons
buccaux
32
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
3
ADN génomique des tissus
6.18 Protocole additionnel pour la purification d’ADN génomique à partir du sperme
34
6.19 Protocole additionnel pour la purification d’ADN génomique des cyanobactéries
36
6.20 Utilisation du NucleoSpin® Tissue pour la purification d’ADN de Staphylococcus aureus
résistant à la méthicilline (MRSA)
37
8 Annexes
43
8.1
Guide de résolution des problèmes
43
8.2
Informations de commande
45
8.3
Restrictions d'utilisation / ​garantie
47
4
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
ADN génomique des tissus
1
Composants
1.1
Contenu du kit
NucleoSpin® Tissue
10 preps
740952.10
50 preps
740952.50
250 preps
740952.250
Tampon de lyse T1
5 mL
20 mL
100 mL
Tampon de lyse B3
10 mL
15 mL
75 mL
Tampon de lavage BW
6 mL
30 mL
150 mL
Tampon de lavage B5
(concentré)
6 mL
12 mL
50 mL
Tampon d’élution BE*
13 mL
13 mL
60 mL
Protéinase K (lyophilisée) **
6 mg
30 mg
2 × 75 mg
Tampon de protéinase PB
1,8 mL
1,8 mL
8 mL
Colonnes NucleoSpin®
Tissue (anneaux vert clair)
10
50
250
Tubes collecteurs (2 mL)
20
100
500
Manuel d’utilisation
1
1
1
REF
* Composition du tampon d’élution AE : 5 mM Tris/HCl, pH 8,5
** Pour la préparation des réactifs et les conditions de stockage, voir le chapitre 3.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
5
ADN génomique des tissus
1.2
Réactifs, consommables et équipements à fournir par
l’utilisateur
Réactifs
•
96 – 100 % d’éthanol
Consommables
•
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pour la lyse des échantillons et l’élution de
l’ADN
•
Elimination des déchets cônes jetables
Equipment
•
Pipettes manuelles
•
Centrifugeuse pour microtubes
•
Broyeur Vortex
•
Équipement pour le broyage et l’homogénéisation des échantillons
•
Équipements de protection individuelle (blouse, gants, lunettes)
Pour les protocoles additionnels (voir paragraph 6), du matériel supplémentaire peut être
nécessaire - voir les protocoles additionnels individuels pour plus d’informations.
1.3
A propos de ce manuel
Il est fortement recommandé de lire les paragraphes détaillés du protocole de ce
manuel d’utilisation si le kit NucleoSpin® Tissue est utilisé pour la première fois. Les
utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Le résumé
du protocole est conçu pour être utilisé uniquement comme un outil supplémentaire de
référence rapide pendant l’exécution de la procédure de purification.
Toute la documentation technique est disponible sur Internet à l’adresse suivante :
www.mn-net.com.
Veuillez contacter le service technique pour obtenir des informations sur les modifications
apportées au présent manuel d’utilisation par rapport aux révisions précédentes. Note :
Le tampon B3 est désormais livré mélangé au préalable.
6
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
ADN génomique des tissus
2
Description du produit
2.1
Principe général
La méthode NucleoSpin® Tissue permet de préparer de l’ADN génomique à partir de
tissus, de cellules (p.e., de bactéries) et de nombreuses autres sources. La lyse est
réalisée par incubation de l’échantillon dans une solution de protéinase K / ​SDS. Les
conditions appropriées pour la fixation de l’ADN sur la membrane de silice des colonnes
NucleoSpin® Tissue sont obtenues par l’ajout de sels chaotropiques et d’éthanol au
lysat. Le processus de liaison est réversible et spécifique aux acides nucléiques. Les
contaminations sont éliminées par un lavage ultérieur avec deux tampons différents.
L’ADN génomique pur est finalement élué dans des conditions de faible force ionique
dans un tampon d’élution légèrement alcalin.
2.2
Caractéristiques du kit
•
NucleoSpin® Tissue est conçu pour la préparation rapide et à petite échelle
d’ADN génomique très pur à partir de n’importe quel tissu, cellule, bactérie,
levure, échantillon médico-légal, sérum, plasma ou autre fluide corporel. Il convient
également à la préparation d’ADN à partir de sang humain ou animal. L’ADN purifié
peut être utilisé directement pour la PCR, le Southern blotting ou tout type de
réaction enzymatique.
•
Le kit permet de purifier jusqu’à 35 μg d’ADN génomique pur avec un rapport A260 / ​
A280 compris entre 1,7 et 1,9. La colonne NucleoSpin® Tissue est capable de fixer
jusqu’à 60 μg d’ADN génomique.
•
Pour la lyse de certaines souches bactériennes et de levure, des enzymes
supplémentaires peuvent être nécessaires, qui ne font pas partie de ce kit. Voir le
protocole additionnel correspondant pour plus de détails.
Table 1: Résumé des caractéristiques du kit
Paramètres
NucleoSpin® Tissue
Technologie
Technologie membrane de silice
Format
Mini colonne à centrifuger
Échantillon d’articles
< 25 mg de tissue
10² – ¹⁰⁷ cellules en culture
Rendement typique
20 – 35 μg
Volume d’élution
60 – 100 μL
Temps de préparation
20 min/preps (hors lyse)
Capacité de fixation
60 μg
Utilisation
Réserver à l’usage de la recherche
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
7
ADN génomique des tissus
•
Produit de qualité médico-légale :
NucleoSpin® Tissue is certified as forensic quality product. Consumables
used in forensics need to be treated carefully to prevent DNA contamination.
MACHEREY‑NAGEL therefore has a stringently controlled production process
to avoid DNA contamination of consumables. Further, MACHEREY‑NAGEL uses
ethylene oxide (EO) treatment to remove amplifiable DNA, which might still be
introduced during the manufacturing process. MACHEREY‑NAGEL products
carrying the forensic quality seal, contain plastic materials that are EO treated. This
means, DNA of any kind, which might still be introduced into plastic consumables
during the production process, is inactivated by means of the treatment with
ethylene oxide, in order to prevent the generation of accidental human profile by
PCR amplification. Ethylene oxide treatment has been shown to be the method of
choice to prevent DNA profiles due to DNA contamination (Shaw et al. 2008 ; Figure
1).
UV
Gamma
100%
30%
40%
30%
Full profile
Electron beam
Partial profile (loadable)
27%
Ethylene oxide
3%
13%
87%
70%
Partial profile (unloadable)
No profile
Figure 1 Selon Shaw et al, 2008, Comparaison des effets des techniques de stérilisation sur
les profilage d’ADN. Int J Legal Med 122 : 29 – 33.
2.3
Procédures d’élution
Outre la méthode standard (taux de récupération d’environ 70 à 90 %), plusieurs
modifications sont possibles pour augmenter le rendement et la concentration. Utiliser le
tampon d’élution pour l’une des procédures suivantes :
•
Rendement élevé : Effectuer deux étapes d’élution avec le volume indiqué dans le
protocole individuel. Environ 90 à 100 % de l’acide nucléique lié peut être élué.
•
Concentration élevée : Effectuer une étape d’élution avec 60 % du volume indiqué
dans le protocole individuel. La concentration d’ADN sera environ 30 % plus élevée
qu’avec l’élution standard. Le rendement de l’acide nucléique élué sera d’environ
80 %.
•
Rendement et concentration élevés : Appliquer la moitié du volume de tampon
d’élution comme indiqué dans le protocole individuel, incuber pendant 3 min et
centrifuger. Appliquer une deuxième aliquote de tampon d’élution, incuber et
centrifuger à nouveau. Ainsi, environ 85 à 100 % de l’acide nucléique lié est élué
dans le volume d’élution standard à une concentration élevée.
•
Élution à 70 °C : Pour certains types d’échantillons, le chauffage du tampon
d’élution à 70 °C augmente le rendement en ADN. .
8
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
ADN génomique des tissus
L’élution peut également être effectuée avec un tampon Tris-EDTA (TE) de pH égal ou
supérieur à 8. Cela permet d’accroître la stabilité de l’ADN, en particulier lors d’un stockage
à long terme et/ou à usage multiple à 4 °C ou à température ambiante, grâce à l’inhibition
des DNases omniprésentes. Cependant, l’EDTA interfère, selon la concentration finale,
avec certaines applications en aval. Note : Le tampon d’élution BE (Tris/HCl 5 mM, pH
8,5) fourni avec le kit ne contient pas d’EDTA.
Pour une performance optimale de l’ADN isolé dans les applications en aval, nous
recommandons l’élution avec le tampon d’élution fourni et le stockage, en particulier
à long terme, à -20 °C. Les cycles de congélation-décongélation n’auront aucun effet
sur la plupart des applications en aval. Les exceptions possibles sont la détection de
traces d’ADN ou la PCR à longue portée (p.e., > 10 kbp). Des cycles multiples de
congélation-décongélation ou le stockage de l’ADN à 4 °C ou à température ambiante
peuvent influencer les sensibilités de détection ou les efficacités de réaction en raison du
cisaillement de l’ADN ou de l’adsorption sur les surfaces.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
9
3
Conditions de stockage et préparation des
réactifs
Attention : Les tampons B3 et BW contiennent du sel chaotropique ! Porter des gants et
des lunettes !
ATTENTION : Les tampons B3 et BW contiennent du chlorhydrate de guanidine qui
peut former des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel
(hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides
directement aux déchets de préparation des échantillons.
•
Tous les composants du kit peuvent être conservés à une température comprise
entre 15 et 25 °C et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette du kit.
•
Au cours du stockage, en particulier à basse température, un précipité blanc peut se
former dans le tampon T1 ou B3. Ces précipités peuvent être facilement dissous en
incubant le flacon à 50 – 70 °C avant utilisation.
Avant de débuter une procédure NucleoSpin® Tissue, préparer les éléments suivants :
•
Tampon de lavage B5 : ajouter le volume indiqué d’éthanol (96 – 100 %) au
tampon de lavage B5 concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que
de l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage B5 peut être conservé à 15 – 25 °C
pendant au moins un an.
•
Protéinase K : ajouter le volume indiqué de tampon protéinase PB pour dissoudre
la protéinase K lyophilisée. La solution de protéinase K est stable à -20 °C pendant
au moins 6 mois.
NucleoSpin® Tissue
10 preps
50 preps
250 preps
REF
740952.10
740952.50
740952.250
Tampon de
lavage B5
(concentré)
6 mL
Ajouter 24 mL
d’éthanol
12 mL
Ajouter 48 mL
d’éthanol
50 mL
Ajouter 200 mL
d’éthanol
Protéinase
6 mg
Ajouter 260 μL de
tampon protéinase
30 mg
Ajouter 1,35 mL de
tampon protéinase
2 × 75 mg
Ajouter 3,35 mL
de tampon pour
protéinase dans
chaque flacon
ADN génomique des tissus
4
Instructions de sécurité
Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® Tissue, portez des vêtements de protection
appropriés (p.e., blouse de laboratoire, gants jetables et lunettes de protection). Pour plus
d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles
en ligne sur www.mn-net.com/msds).
Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon B3 et le tampon BW peut former
des composés très réactifs lorsqu’il est combiné avec de l’eau de Javel ! Par conséquent,
ne pas ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de
préparation d’échantillons.
Les déchets générés par le kit NucleoSpin® Tissue n’ont pas été testés pour détecter
la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par
du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse
fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K, mais elle ne peut être totalement
exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et
doivent être manipulés et éliminés conformément aux règlementations de sécurité locales.
4.1
Elimination des déchets
Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du
matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
11
NucleoSpin® Tissue
5
Protocole standard pour les tissus humains ou
animaux et les cellules en culture
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Set un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Tissus
Couper 25 mg de tissu humain ou animal en petits
morceaux. Placer l’échantillon dans un tube de
microcentrifugation (non fourni). Passer à l’étape 2.
Les échantillons difficiles à lyser peuvent être broyés
sous azote liquide ou traités dans un homogénéisateur
mécanique (Polytron®, Ultra-Turrax®) : Ajouter 25 mg de
tissu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non
fourni), ajouter 50 – 75 μL de solution saline tamponnée
au phosphate (PBS) et homogénéiser.
Cellules en culture
Remettre en suspension jusqu’à 10⁷ cellules dans un
volume final de 200 μL de tampon T1. Ajouter 25 μL
de solution de protéinase K et 200 μL de tampon B3.
Vortexer pour mélanger et incuber l’échantillon à 70 °C
pendant 10 à 15 min. Passer à l’étape 4.
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 180 μL de tampon T1 et 25 μL de solution de
protéinase K. Vortexer pour mélanger. Veiller à ce que les
échantillons soient complètement recouverts de solution
de lyse.
En cas de procédure sur plusieurs échantillons, la
protéinase K et le tampon T1 peuvent être mélangés au
préalable, directement avant l’utilisation. Ne pas mélanger
le tampon T1 et la protéinase K plus de 10 à 15 min avant
de les ajouter à l’échantillon : La protéinase K a tendance
à s’autodigérer dans le tampon T1 en l’absence de
substrat.
12
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
+180 μL T1
+25 μL
Protéinase K
Mélanger
NucleoSpin® Tissue
Incuber à 56 °C jusqu’à obtention d’une lyse complète
(au moins 1 à 3 h). Vortex de temps en temps pendant
l’incubation ou utiliser un incubateur à paritation.
Les échantillons peuvent également être incubés pendant
la nuit. Si l’ADN sans ARN est crucial pour les applications
en aval, une digestion RNase peut être effectuée : Ajouter
20 μL de solution de RNase A (10 mg/mL) (non inclus ;
voir les informations de commande) et incuber pendant
5 min supplémentaires à température ambiante.
3
Lyse de l’échantillon
Vortexer les échantillons. Ajouter 200 μL de tampon
B3, vortexer vigoureusement et incuber à 70 °C pendant
10 min. Vortexer brièvement.
56 °C,
1–3 h
ou
56 °C,
pendant une
nuit
+200 μL B3
70 °C,
10 min
Si des particules insolubles sont visibles, centrifuger
pendant 5 min à grande vitesse (par exemple, 11 000 × g)
et transférer le surnageant dans un nouveau tube de
microtubes (non fourni).
4
Ajustement des conditions de fixation
Ajouter 210 μL ethanol (96 – 100 %)à l’échantillon et
vortexer vigoureusement.
Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut
devenir visible. Cela n’affectera pas l’extraction de l’ADN.
Veillez à charger tout le précipité sur la colonne à l’étape
suivante.
5
Fixation de l’ADN
Pour chaque échantillon, placer une colonne NucleoSpin®
Tissue dans un tube collecteur. Appliquer l’échantillon
sur la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 11,000 × g.
Jeter le tube collecteur avec le filtrat et placer la colonne
dans un nouveau tube collecteur (fourni).
Si l’échantillon n’est pas aspiré complètement à travers
la matrice, répéter l’étape de centrifugation à 11 000 × g.
Jeter le filtrat.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
+210 μL
d’éthanol
Vortex
Charger les
échantillons
11,000 × g,
1 min
13
NucleoSpin® Tissue
6
Lavage de la membrane de silice
1er lavage
Ajouter 500 μL de tampon BW. Centrifuger pendant
1 min à 11,000 × g. Jeter le filtrat et replacer la colonne
dans le tube collecteur.
+500 μL BW
11,000 × g,
1 min
2ème lavage
+600 μL B5
Add 600 μL Buffer B5 to the column and centrifuge for
1 min at 11,000 × g. Discard flowthrough and place the
column back into the Collection Tube.
11,000 × g,
1 min
Ajouter 500 μL de tampon BW. Centrifuger pendant
1 min à 11,000 × g Jeter le filtrat et replacer la colonne
dans le tube collecteur.
7
Séchage de la membrane de silice
Centrifuger la colonne pendant 1 min à 11,000 × g.
11,000 × g,
1 min
L’éthanol résiduel est éliminé au cours de cette étape.
8
Élution d’ADN très pur
Placer la colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube de
microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni) et ajouter
100 μL de tampon BE. Incuber à température ambiante
pendant 1 min. Centrifuger 1 min à 11,000 × g.
Pour d’autres procédures d’élution, voir le chapitre 2.3.
14
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
+100 μL BE
TA,
1 min
11,000 × g,
1 min
NucleoSpin® Tissue
6
Protocoles additionnels
6.1
Protocole additionnel pour les queues de souris ou de
rats
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Set un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Couper deux morceaux de 0,6 cm de queue de souris et les placer dans un tube à
centrifuger de 1,5 mL (non fourni).
Si l’on procède à la transformation de queues de rats, un morceau de 0,6 cm suffit.
2
Lyse de l’échantillon
Ajouter 180 μL de tampon T1 et 25 μL de protéinase K et vortexer. Incuber à 56 °C
pendant une nuit ou jusqu’à obtention d’une lyse complète. Le temps de lyse peut
être considérablement réduit jusqu’à environ une heure si le tissu est fragmenté
mécaniquement (p.e., si le tissu est coupé en très petits morceaux avant la lyse).
Vortex occasionnellement pendant l’incubation ou utiliser un bain-marie à agitation.
Pour éliminer les os ou les poils résiduels, centrifuger pendant 5 min à vitesse
élevée (p.e., 11 000 × g). Transférer 200 μL de surnageant dans un nouveau tube.
En cas de procédure sur plusieurs échantillons, la protéinase K et le tampon T1
peuvent être mélangés au préalable directement avant l’utilisation. Ne jamais
mélanger le tampon T1 et la protéinase K plus de 10 à 15 min avant de les ajouter
à l’échantillon : La protéinase K a tendance à s’autodigérer dans le tampon T1 en
l’absence de substrat.
3
Lyse de l’échantillon
Ajouter 200 μL de tampon B3 au lysat et vortexer vigoureusement.
Le tampon B3 et l’éthanol (voir étape 4) peuvent être mélangés au préalable avant
d’être ajoutés au lysat.
Fixation de l’ADN aux...
Ajouter 210 μL d’éthanol au lysat et vortexer vigoureusement.
Passez à l’étape 5 du protocole standard (voir paragraphe5).
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
15
NucleoSpin® Tissue
6.2
Protocole additionnel pour les bactéries
Avant de débuter la procédure :
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au chapitre 3.
•
1
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
Préparer l’échantillon
Jusqu’à 1 mL de culture bactérienne peut être utilisé pour la préparation en
fonction, par exemple, de la densité de la culture, du milieu de culture et de la
souche bactérienne.
Centrifuger jusqu’à 1 mL de culture pendant 5 min à 8 000 x g. Retirer le
surnageant.
2
Pré-lyse de l’échantillon
Remettre en suspension le culot dans 180 μL de tampon T1 par pipetages
successifs. Ajouter 25 μL de protéinase K. Vortexer vigoureusement et incuber
à 56 °C jusqu’à lyse complète (au moins 1 à 3 h). Vortexer de temps en temps
pendant l’incubation ou utiliser un incubateur à agitation.
Les échantillons peuvent également être incubés pendant la nuit.
Si l’ADN sans ARN est crucial pour les applications en aval, une digestion RNase
peut être effectuée : ajouter 20 μL de solution de RNase A (20 mg / ​mL) (non inclus ;
voir les informations de commande) et incuber pendant 5 min supplémentaires à
température ambiante.
Bactéries difficiles à lyser : certaines souches, en particulier les bactéries Grampositives, sont plus difficiles à lyser. Dans ce cas, une préincubation avec une
enzyme lytique est nécessaire : remettre en suspension les cellules en culot dans
20 mM Tris/HCl ; 2 mM EDTA ; 1 % Triton X-100 ; pH 8 (au lieu du tampon T1)
additionné d’une concentration finale de 20 mg/mL de lysozyme ou de 0,2 mg/mL
de lysostaphine et incuber pendant 30 à 60 min à 37 °C. Ajouter 25 μL de protéinase
K, incuber à 56 °C jusqu’à obtention d’une lyse complète.
Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5).
16
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
6.3
Protocole additionnel pour la levure
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Vérifier que du tampon sorbitol et de la lyse ou de la zymolase (non fournis avec le
kit) sont disponibles pour la prélyse des échantillons.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 30 °C et 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Récolter 3 mL de culture de levure YPD (OD600 ≤ 10) par centrifugation pendant
10 min à 5 000 x g. Laver les cellules une fois avec 1 mL d’EDTA 10 mM, pH 8.
Retirer le surnageant et culotter les cellules par centrifugation (5 000 x g, 10 min).
2
Pré-lyse de l’échantillon
Remettre le culot en suspension dans 600 μL de tampon sorbitol (1,2 M de
sorbitol ; 10 M de CaCl2 ; 0,1 M de Tris/HCl pH 7,5 ; 35 M de ß-mercaptoéthanol).
Ajouter 50 U de lyticase ou de zymolase*. Incuber à 30 °C pendant 30 min.
Cette étape permet de dégrader la paroi cellulaire de la levure et de créer des
sphéroplastes. La formation des sphéroplastes peut être vérifiée au microscope.
Centrifuger le mélange pendant 10 min à 2 000 x g, éliminer le surnageant et
remettre en suspension les sphéroplastes en culot dans 180 μL de tampon T1.
Ajouter 25 μL de solution de protéinase K et vortexer vigoureusement. Incuber à
56 °C jusqu’à obtention d’une lyse complète (au moins 1 à 3 h). Vortexer de temps
en temps pendant l’incubation ou utiliser un bain-marie à agitation.
Les échantillons peuvent également être incubés pendant la nuit.
Si l’ADN sans ARN est crucial pour les applications en aval, une digestion RNase
peut être effectuée : Ajouter 20 μL de solution de RNase A (20 mg / ​mL) (non inclus ;
voir les informations de commande) et incuber pendant 5 min supplémentaires à
température ambiante.
Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5).
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17
NucleoSpin® Tissue
6.4
Protocole additionnel pour les taches de sang séché (p.e.
NucleoCard®s, FTA® cards, Guthrie cards)
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Découper une ou deux taches de sang séché aussi précisément que
possible. Couper les taches en petits morceaux et les placer dans un tube de
microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni).
La surface des taches de sang séché doit être comprise entre 15 et 30 mm².
2
Pré-lyse de l’échantillon
Ajouter 180 μL de tampon T1 et mélanger en vortexant. Placer les échantillons
dans un bain-marie ou un bloc chauffant et chauffer pendant 10 min à 94 °C.
Laisser l’échantillon refroidir. Ajouter 25 μL de solution de protéinase K. Centrifuger
brièvement les échantillons, vortexer et incuber à 56 °C pendant 1 h. Vortexer de
temps en temps pendant l’incubation ou utiliser un bain-marie d’agitation.
Veiller à ce que les échantillons soient complètement recouverts de tampon de lyse
pendant l’incubation.
3
Lyse de l’échantillon
Ajouter 200 μL de tampon B3, mélanger vigoureusement au vortex et incuber à
56 °C pendant 10 min.
Passer à l’étape 4 du protocole standard (voir paragraphe 5).
* Other protocols use 5 – 200 U lyticase or zymolase depending on enzyme quality or brand. Increasing the enzyme
concentration may be required if spheroplasts are not formed.
18
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
6.5
Protocole additionnel pour l’ADN génomique et l’ADN viral
à partir d’échantillons de sang
Avant de débuter la procédure :
•
1
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
Préparer l’échantillon
Pas nécessaire
2
Pré-lyse de l’échantillon
Pas nécessaire
3
Lyse de l’échantillon de sang
Pipeter 25 μL de protéinase K et jusqu’à 200 μL de sang, de couche leucoplaquettaire ou d’échantillon de fluide corporel (équilibré à température ambiante)
dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (non fournis).
Pour les volumes d’échantillons inférieurs à 200 μL, ajouter du PBS pour ajuster
le volume à 200 μL. Si vous purifiez des virus ADN, nous vous recommandons
de commencer avec 200 μL de sérum ou de plasma. Si des cellules en culture
sont utilisées, remettre en suspension jusqu’à 5 × 106 cellules dans un volume
final de 200 μL de PBS.
Ajouter 200 μL de tampon B3 aux échantillons et vortexer vigoureusement le
mélange (10 – 20 s).
Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min. Mélanger.
Incuber les échantillons à 70 °C pendant 10 à 15 min.
Le lysat doit devenir brunâtre pendant l’incubation avec le tampon B3. Augmenter
le temps d’incubation avec la protéinase K (jusqu’à 30 min) et vortexer une ou
deux fois vigoureusement pendant l’incubation en cas de procédure sur des
échantillons de sang plus anciens ou coagulés.
4
Ajustement des conditions de fixation de l’ADN
Ajouter 210 μL d’éthanol (96 – 100 %) à chaque échantillon et vortexer à
nouveau.
5
Fixation de l’ADN
Pour chaque préparation, prendre une colonne NucleoSpin® Tissue placée
dans un tube collecteur et charger l’échantillon. Centrifuger 1 min à 11 000
x g. Si les échantillons ne traversent pas complètement la matrice, répéter la
centrifugation à une force g plus élevée (< 15 000 x g). Jeter le tube collecteur
avec le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (fourni).
Procéder à l’étape 6 (Lavage de la membrane de silice) du protocole standard
(voir paragraphe 5).
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19
NucleoSpin® Tissue
6.6
Protocole additionnel pour les racines des cheveux
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Coupez les racines des cheveux de l’échantillon de cheveux (jusqu’à 100) et
collectez-les dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL (non fourni).
2
Pré-lyse de l’échantillon
Ajouter 180 μL de tampon T1 aux racines des cheveux et congeler les échantillons
dans l’azote liquide. Décongeler les échantillons dans un bain-marie à 56 °C.
Répétez cette procédure 4 fois. Ajouter 25 μL de solution de protéinase K,
mélanger en vortexant et incuber 6 – 8 h ou une nuit à 56 °C. Utiliser un bain-marie
à agitation ou vortexer de temps en temps.
Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5).
20
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NucleoSpin® Tissue
6.7
Protocole additionnel pour les tissus inclus en paraffine
Avant de débuter la procédure :
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
Vérifier si du xylène ou du n-octane est disponible.
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 37 °C et 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Préparer de petites sections (jusqu’à 25 mg) à partir de blocs de tissus fixés et
inclus. Si possible, enlever l’excès de paraffine du bloc avant de le découper.
Manipuler les sections avec des pinces ou des cure-dents et placer les échantillons
dans des tubes de microcentrifugation.
Ajouter 1 mL de n-octane ou de xylène dans chaque tube. Vortexer
vigoureusement et incuber à température ambiante pendant environ 30 min.
Vortexer de temps en temps.
Centrifuger à 11 000 x g pendant 3 min. Prélever le surnageant à la pipette.
Ajouter 1 mL d’éthanol (96 – 100 %) dans chaque tube. Fermer et mélanger
en inversant plusieurs fois. Centrifuger à 11 000 x g pendant 3 min. Prélever le
surnageant à la pipette.
Répéter l’étape de lavage à l’éthanol. Prélever à la pipette la plus grande quantité
possible d’éthanol.
Incuber le tube ouvert à 37 °C jusqu’à évaporation de l’éthanol (~ 15 min).
Passer à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5).
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21
NucleoSpin® Tissue
6.8
Protocole additionnel pour l’ADN génomique provenant
des fèces
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Vérifier si le tampon TE est disponible.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Ajouter 250 mg de matières fécales à 1 mL de tampon TE (10 mM Tris / ​Cl ; 1
mM EDTA, pH 8). Remettre l’échantillon en suspension par vortex vigoureux (30 s).
Centrifuger l’échantillon pendant 15 min à 4 000 x g. Jeter le surnageant.
Remettre le culot en suspension dans 0,2 à 1 mL de tampon T1. Utiliser autant de
tampon que nécessaire pour une bonne resuspension de l’échantillon.
Le culot préparé contient, entre autres constituants, des cellules du tube digestif
et des bactéries.
Transférer 200 μL de l’échantillon remis en suspension dans un nouveau tube
de microcentrifugation.
Procéder à l’ajout de 25 μL de protéinase K à l’étape 2 du protocole standard (voir
paragraphe 5).
Les cellules humaines, les cellules bactériennes et les cellules d’agents pathogènes
présentes dans les fèces se lysent au cours de l’étape d’incubation à 56 °C avec la
protéinase K avec une efficacité différente. Pour la détection de cellules difficiles à
lyser (p.e., certaines bactéries et certains parasites), il peut être bénéfique d’effectuer
une incubation supplémentaire à une température plus élevée (jusqu’à 95 °C ;
5 – 10 min). Le rendement en ADN sera souvent plus élevé avec une telle étape
d’incubation supplémentaire à haute température. Il convient toutefois de noter
que le rapport entre l’ADN humain et l’ADN non humain changera généralement en
raison de la libération accrue d’ADN bactérien/pathogène.
22
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
6.9
Protocole additionnel pour la recherche d’ADN viral (p.e.
CMV) dans les fèces
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Préparer du NaCl à 0,9 %.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Suspendre l’échantillon de fèces dans du NaCl à 0,9 % (environ 0,5 g dans 4 mL
au maximum).
Centrifuger des aliquotes de l’échantillon de selles pendant 5 min à 800 x g à
TA (par exemple, 4 mL : 4 × 1 mL dans un tube de microtubes de 1,5 mL). Réunir
soigneusement le surnageant (ne pas toucher le culot).
Filtrer le surnageant à travers un filtre stérile de 0,22 – 0,45 μm. Fractionner le filtrat
et centrifuger pendant 1 min à 11 000 x g.
2
Pré-lyse de l’échantillon
Retirer soigneusement le surnageant par décantation. Ajouter 400 μL de tampon
T1 et 35 μL de protéinase K et mélanger en vortexant.
3
Lyse de l’échantillon
Ajouter 400 μL de tampon B3 et mélanger en vortexant. Incuber pendant au
moins 30 min à 70 °C.
4
Ajustement des conditions de fixation de l’ADN
Ajouter 420 μL d’éthanol (96 – 100 %) et mélanger en vortexant.
5
Fixation de l’ADN
Pour chaque échantillon, placer une NucleoSpin® Tissue dans un tube collecteur.
Charger successivement les colonnes NucleoSpin® Tissue. Centrifuger pendant
1 min à 4 500 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
Si l’échantillon n’est pas aspiré complètement à travers la matrice, répéter l’étape
de centrifugation à 11 000 x g. Jeter le filtrat.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
23
NucleoSpin® Tissue
6
Lavage de la membrane de silice
1er lavage
Ajouter 600 μL de tampon BW. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Jeter le
filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
2ème lavage
Ajouter 600 μL de tampon B5 à la colonne et centrifuger pendant 1 min à 4 500 x
g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
3ème lavage
Ajouter 600 μL de tampon B5 à la colonne et centrifuger pendant 2 min à 11 000
x g. Jeter le filtrat.
7
Séchage de la membrane de silice
Placer la NucleoSpin® Tissue dans un nouveau tube collecteur et incuber à
couvercle ouvert pendant 1 à 2 min à 70 °C.
L’éthanol résiduel est éliminé au cours de cette étape.
8
Élution d’ADN très pur
Placer la colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube de microcentrifugation de
1,5 mL (non fourni) et ajouter 100 μL de tampon BE. Incuber avec le couvercle
fermé pendant 3 – 5 min. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g.
Pour d’autres procédures d’élution, voir le chapitre 3.
Utiliser 10 μL d’extrait d’ADN pour un mélange de réaction PCR de 20 μL.
Ajouter le mélange de contrôle d’inhibition (10 μL d’extrait d’ADN avec de l’ADN
humain) et amplifier avec par exemple actine- / ​
ß-globine- / ​ou autre amorce
spécifique à l’homme.
24
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
6.10 Protocole additionnel pour la détection de
Mycobacterium tuberculosis ou de Legionella
pneumophila dans les expectorations ou les lavages
broncho-alvéolaires
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
•
Préparer N-acétyl cystéine / ​NaOH (2 g de NaOH ; 1,45 g de citrate de sodium ;
0,5 g de N-acétyl cystéine. Ajouter de l’eau à 100 mL).
1
Préparer l’échantillon
Ajouter 200 – 500 μL d’expectoration ou de lavage bronchoalvéolaire à un volume
égal de N-acétylcystéine / ​NaOH. Vortexer doucement pour mélanger.
Incuber le mélange pendant 25 min à température ambiante avec agitation.
Ajuster le volume à 25 mL avec de l’eau stérile.
Centrifuger pendant 30 min à 4 000 x g. Jeter le surnageant.
Remettre le culot en suspension dans 0,5 – 1 mL de tampon T1 (en fonction de la
viscosité de l’échantillon).
Transférer 200 μL de l’échantillon remis en suspension dans un nouveau tube
de microcentrifugation (non fourni).
Procéder à l’étape 2 du protocole standard, voir paragraphe 5 (ajout de la protéinase
K et incubation).
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25
NucleoSpin® Tissue
6.11 Protocole additionnel pour la détection des bactéries
EHEC dans les aliments (p.e. lait de vache frais)
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Préparer le mTSB et l’acétate de sodium 3,2 M.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Dans un bouteille stérile de 1 litre, ajouter 25 mL de lait et 225 mL de milieu
mTSB préchauffé (37 °C) (fourni avec Novobiocin). Incuber le mélange dans un
bain-marie à agitation pendant 5 – 6 h ou toute une nuit à 37 °C.
Préparation du milieu mTSB : 30 g de Tryptic Soy Broth (Gibco), 1,5 g de sels
biliaires n° 3 (Oxoid), 1,5 g de KH2PO4. Ajouter 900 mL de H2O. Filtrer le milieu et
ajuster le pH à 7,4 avec 2 M NaOH. Ajouter de l’eau jusqu’à 1 litre et autoclaver
pendant 15 min à 121 °C.
Centrifuger 100 mL de culture pendant 40 min à 6 000 x g.
Verser doucement le surnageant et remettre le culot en suspension dans 2 mL
d’eau stérile. Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g.
2
Pré-lyse de l’échantillon
Remettre le culot en suspension dans 180 μL de tampon T1 et ajouter 25 μL de
solution de protéinase K.
Suivre le protocole standard, en commençant par l’étape 3 (voir paragraphe 5).
Après élution de l’ADN, procéder à l’étape suivante.
Précipiter l’ADN en ajoutant 20 μL d’acétate de sodium 3,2 M et 400 μL d’éthanol
à 200 μL d’éluat. Centrifuger pendant 30 min à 11 000 x g. Jeter le surnageant
et laver le culot avec 1 mL d’éthanol à 70 % et le remettre en suspension dans
10 μL d’eau stérile.
26
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
6.12 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN
bactérien (p.e. Chlamydia trachomatis) à partir de
cultures, de liquides biologiques ou d’échantillons
cliniques.
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Extraction de l’ADN bactérien à partir de cultures bactériennes ou de liquides
biologiques : culotter les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 13 000 xg
et procéder à l’étape 2 du protocole standard, voir paragraphe 5.
Extraction d’ADN bactérien à partir d’écouvillons oculaires, nasaux ou
pharyngés : prélever les échantillons, ajouter 2 mL de PBS contenant un fongicide
courant et incuber pendant plusieurs heures à température ambiante. Culotter
les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 13 000 x g. Jeter le surnageant.
Passer à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5).
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27
NucleoSpin® Tissue
6.13 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN
bactérien (p.e. Borrelia burgdorferi) à partir de l’urine
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Centrifuger 1 mL d’échantillon d’urine à 13 000 x g pendant 30 min. Jeter le
surnageant, ajouter à nouveau 1 mL d’échantillon d’urine au culot et centrifuger à
13 000 x g pendant 30 min. Cette étape peut être répétée jusqu’à trois fois.
L’échantillon doit être frais. Un stockage à une température comprise entre - 20 °C
et - 80 °C n’est recommandé que pour quelques jours. Après décongélation,
incuber l’échantillon à 40 °C jusqu’à ce que tous les précipités soient dissous.
L’urine a tendance à former des précipités lorsqu’elle est conservée à basse
température.
Passer à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5).
6.14 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN viral
(p.e. CMV) à partir de l’urine
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier que le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 70 °C.
1
Préparer l’échantillon
Centrifuger des aliquotes de l’échantillon d’urine pendant 10 min à pleine vitesse
(p.e., 4 mL : 4 × 1 mL dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL). Décanter
soigneusement le surnageant.
Si des échantillons d’urine congelés sont utilisés, des précipités peuvent apparaître
après la décongélation, qui doivent être dissous avant l’étape de centrifugation.
Ceci peut être fait par une étape d’incubation de 30 min à 37 – 40 °C. Si une
solution complète n’est pas obtenue, laisser le précipité sédimenter et passer à
l’étape 1 du protocole additionnel en utilisant uniquement le surnageant.
28
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
2
Pré-lyse de l’échantillon
Remettre le culot en suspension dans 180 μL de tampon T1 et 25 μL de
protéinase K.
Remettre en suspension le premier culot dans 180 μL de tampon T1 et 25 μL de
protéinase K. Transférer la solution remise en suspension du premier tube dans
le deuxième tube et la solution remise en suspension du deuxième tube dans le
troisième tube et ainsi de suite. Enfin, passer à l’étape 3.
3
Lyse de l’échantillon
Ajouter 200 μL de tampon B3, vortexer et incuber au moins pendant 20 min à
70 °C.
4
Ajustement des conditions de fixation de l’ADN
Ajouter 210 μL d’éthanol (96 – 100 %) à l’échantillon et vortexer vigoureusement.
5
Fixation de l’ADN
Pour chaque échantillon, placer une colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube
collecteur. Appliquer l’échantillon sur la colonne. Centrifuger pendant 1 min à 4
500 x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
6
Lavage de la membrane de silice
1er lavage
Ajouter 500 μL de tampon BW. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g. Jeter le
filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
2ème lavage
Ajouter 600 μL de tampon B5 à la colonne et centrifuger pendant 2 min à 11 000
x g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur.
7
Séchage de la membrane de silice
Incuber à couvercle ouvert pendant 1 à 2 min à 70 °C.
L’éthanol résiduel est éliminé au cours de cette étape.
8
Élution d’ADN très pur
Ajouter 70 μL de tampon BE, fermer le couvercle et incuber pendant 3 à 5 min
supplémentaires. Centrifuger pendant 1 min à 4 500 x g.
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29
NucleoSpin® Tissue
6.15 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN
génomique des insectes
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Homogénéiser au maximum 50 mg d’insectes sous azote liquide et transférer la
poudre dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni).
Procéder à l’étape 2 du protocole standard (voir paragraphe 5) en ajoutant la
protéinase K.
30
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
6.16 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN
génomique à partir d’écouvillons dentaires
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Placer les écouvillons (papier, coton, brosses, plastique) dans un tube de
microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni).
2
Pré-lyse de l’échantillon
Ajouter 180 μL de tampon T1 et 25 μL de protéinase K à chaque échantillon.
Fermer le tube de microcentrifugation et centrifuger brièvement pendant 15 s à
1 500 x g afin de submerger complètement le matériau de l’écouvillon. Incuber à
température ambiante pendant 5 min. Vortexer vigoureusement le tube pendant
15 s et centrifuger brièvement pendant 15 s à 1 500 x g.
Incuber les tubes à 70 °C dans un incubateur pendant 10 min. Placer un poids sur
le tube afin d’éviter que les bouchons ne s’ouvre. Passer à 95 °C pendant 5 min.
Centrifuger brièvement pendant 15 s à 1 500 x g pour recueillir tout échantillon sur
les couvercles. Ouvrir les tubes de microcentrifugation.
Supprimer l’étape d’incubation à 95 °C, en fonction de la souche bactérienne à
détecter.
2a Séparer la solution de lyse des écouvillons dentaires
Alternative A :
Transférer l’écouvillon dans un NucleoSpin® Forensic Filter (non fourni ; voir
informations de commande). Couper la tige de l’écouvillon. Centrifuger le
NucleoSpin® Forensic Filter pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le NucleoSpin®
Forensic Filters. Continuer avec le filtrat.
Alternative B :
Placer un NucleoSpin® Filter(non fourni ; voir les informations de commande)
dans un tube collecteur (2 mL). Transférer l’écouvillon (couper la tige de l’écouvillon)
et la solution restante sur le NucleoSpin® Filter. Centrifuger pendant 1 min à 11 000
x g. Jeter le NucleoSpin® Filter. Continuer avec le filtrat.
Alternative C :
Transférer autant que possible la solution de lysat dans un tube de microcentrifugation
de 1,5 mL (non fourni). Jeter l’écouvillon et continuer avec la solution récupérée.
Passer à l’étape 3 du protocole standard (voir le paragraphe 5).
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
31
NucleoSpin® Tissue
6.17 Protocole additionnel pour la purification de l’ADN
génomique à partir d’écouvillons buccaux
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Vérifier si le PBS est disponible.
•
Mettre un incubateur ou un bain-marie à 56 °C.
1
Préparer l’échantillon
Prélever les échantillons avec des écouvillons en coton, en dacron® (Daigger) ou
en C.E.P. (Gibco BRL). Gratter fermement l’intérieur de chaque joue à plusieurs
reprises et laisser les écouvillons sécher à l’air.
La personne concernée ne doit pas avoir consommé de nourriture ou de boisson
dans les 30 min précédant le prélèvement de l’échantillon.
2
Pré-lyse de l’échantillon
Placer le matériau sec des écouvillons dans des tubes de microcentrifugation
de 2 mL (non fournis). Ajouter 400 – 600 μL de PBS et 25 μL de solution de
protéinase K aux écouvillons.
Le volume de PBS dépend du type d’écouvillon utilisé : pour les écouvillons en
coton et en dacron, 400 μL suffisent ; pour les écouvillons en C.E.P., 600 μL sont
nécessaires.
Mélanger en vortexant 2 × 5 s et incuber 10 min à 56 °C.
32
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
2a Séparer la solution de lyse des écouvillons buccaux
Alternative A :
Transférer l’écouvillon dans un NucleoSpin® Forensic Filter (non fourni ; voir
informations de commande). Couper la tige de l’écouvillon. Centrifuger le
NucleoSpin® Forensic Filter pendant 1 min à 11 000 x g. Jeter le NucleoSpin®
Forensic Filters. Continuer avec le filtrat.
Alternative B :
Placer un NucleoSpin® Filter (non fourni ; voir les informations de commande)
dans un tube collecteur (2 mL). Transférer l’écouvillon (couper la tige de l’écouvillon)
et la solution restante sur le NucleoSpin® Filter. Centrifuger pendant 1 min à 11 000
x g. Jeter le NucleoSpin® Filtre. Continuer avec le filtrat.
Alternative C :
Transférer autant que possible la solution de lysat dans un tube de microcentrifugation
de 1,5 mL (non fourni). Jeter l’écouvillon et continuer avec la solution récupérée.
3
Lyse de l’échantillon
Ajouter un volume de tampon B3 (400 ou 600 μL ; selon le type d’écouvillon / ​le
volume de tampon PBS utilisé) et vortexer vigoureusement. Incuber les échantillons
à 70 °C pendant 10 min.
Note : En fonction du nombre de préparations, du tampon B3 supplémentaire peut
être nécessaire (voir informations de commande).
4
Ajustement des conditions de fixation de l’ADN
Ajouter un volume d’éthanol à 96 – 100 % (400 ou 600 μL, selon le type
d’écouvillon) à chaque échantillon et mélanger en vortexant.
5
Fixation de l’ADN
Transférer 600 μL des échantillons des tubes de microcentrifugation de 2 mL
dans les colonnes NucleoSpin® Tissue. Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min.
Si les échantillons ne sont pas passés complètement, répéter la centrifugation.
Jeter le filtrat.
Remettre les colonnes dans les tubes collecteurs et répéter l’étape 5 une ou deux
fois, selon le volume de lyse.
Lorsque tout le lysat a été appliqué sur les colonnes, jeter le tube collecteur et
placer la colonne dans un nouveau tube collecteur. Passer à l’étape 6 du protocole
standard (paragraphe 5).
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
33
NucleoSpin® Tissue
6.18 Protocole additionnel pour la purification d’ADN
génomique à partir du sperme
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Le tampon d’élution BE peut être préchauffé à 70 °C avant l’élution.
1
Préparer 200 mL de tampon GuEX (2 mL de solution stérile de chlorhydrate de
guanidine 5 M, 2.1 mL de solution Tris-Cl 1 M (pH 8), 1.05 mL de solution NaCl
2 M, 4.2 mL de solution EDTA 0.5 M, 0.2 mL de solution NaOH 1 M, ajouter de
l’eau pour obtenir un volume de 200 mL, le pH doit être compris entre 8 et 8.5).
2
Transférer 20 µL à 60 µL d’échantillon dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
Ajouter 950 µL de tampon GuEX et 50 µL de protéinase K.
Incuber le mélange pendant 15 minutes au maximum à 37 °C.
Centrifuger le mélange pendant 5 minutes à 12 000 × g à température
ambiante. Le culot contient les spermatozoïdes (échantillon A) tandis que l’ADN
libre des cellules épithéliales et des leucocytes (échantillon B) se trouve dans le
surnageant.
3
Le surnageant (échantillon B) est prélevé avec précaution et transféré dans un
nouveau tube et traité séparément (étape 6).
4
Ajouter 700 µL de tampon GuEX au culot (échantillon A), centrifuger pendant
5 minutes à 12 000 × g et jeter le surnageant. Répéter cette étape de lavage 2
à 3 fois.
5
Le culot (échantillon A) est remis en suspension dans un minimum de 300 µL de
tampon T1.
6
Échantillon A : Ajouter 25 µL de solution mère de protéinase K, mélanger en
vortexant et incuber de 60 °C à 65 °C pendant une nuit.
Échantillon B : ajouter 10 µL de solution mère de protéinase K, mélanger en
vortexant et incuber entre 60 °C et 65 °C pendant une nuit.
7
34
Centrifuger les échantillons pendant 5 minutes à 12 000 × g à température ambiante
pour éliminer tout matériel cellulaire insoluble. Procéder avec le surnageant clarifié.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
8
Échantillon A : Ajouter 300 µL de tampon et 300 µL d’isopropanol au
surnageant clarifié et appliquer l’échantillon successivement sur la colonne
NucleoSpin® Tissue. Centrifuger 1 minute à 6 000 × g (TA). Si l’échantillon n’est
pas complètement aspiré à travers la matrice, répéter l’étape de centrifugation.
Échantillon B : ajouter 400 µL d’isopropanol au surnageant clarifié et appliquer
l’échantillon successivement sur la colonne NucleoSpin® Tissue. Centrifuger
1 minute à 6 000 × g (TA). Si l’échantillon n’est pas complètement aspiré à travers
la matrice, répéter l’étape de centrifugation.
9
Ajouter 500 µL de tampon B5 à la colonne de centrifugation et centrifuger
1 minute à 6 000 × g à température ambiante. Jeter le filtrat et répéter cette étape
de lavage.
10
Après les deux étapes de lavage avec le tampon B5, jeter le filtrat, placer à
nouveau la colonne NucleoSpin® Tissue dans la centrifugeuse et centrifuger
2 minutes à 6 000 × g à température ambiante pour éliminer complètement le
tampon B5.
11
Placer la colonne NucleoSpin® Tissue dans un tube à centrifuger propre
de 1,5 mL et éluer l’ADN avec 100 µL à 200 µL de tampon BE préchauffé.
Après deux minutes d’incubation, centrifuger pendant 1 minute à 6 000 × g à
température ambiante.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
35
NucleoSpin® Tissue
6.19 Protocole additionnel pour la purification d’ADN
génomique des cyanobactéries
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Le tampon d’élution BE peut être préchauffé à 70 °C avant l’élution.
1
Préparer la quantité requise de tampon EX, contenant 50 mM de Tris HCl (pH 8),
50 mM d’EDTA, complété par 1 % (v/v) de Triton X-100, 20 mg/mL de lysozyme
et 12 mg/mL de RNase.
2
Centrifuger un volume approprié de culture à pleine vitesse pendant 5 minutes.
La teneur finale en chlorophylle A du culot doit être comprise entre 30 µg et 40 µg.
3
Remettre soigneusement en suspension le culot dans 170 µL de tampon EX en
pipetant de haut en bas. Incuber pendant 30 à 60 minutes à 37 °C en mélangeant
doucement.
Note : Le lysat devient clarifié à ce stade.
Ajouter 25 µL de protéinase K (22 mg/ml) et poursuivre l’incubation à 56 °C
pendant 60 minutes. Inverser les échantillons plusieurs fois pour les mélanger
pendant l’incubation.
Passer à l’étape 3 du protocole standard.
36
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
NucleoSpin® Tissue
6.20 Utilisation du NucleoSpin® Tissue pour la purification
d’ADN de Staphylococcus aureus résistant à la
méthicilline (MRSA)
Avant de débuter la procédure :
•
Vérifier si le tampon B5 et la protéinase K ont été préparés conformément au
chapitre 3.
•
Le tampon d’élution BE peut être préchauffé à 70 °C avant l’élution.
1
Vortexer vigoureusement les écouvillons dans le milieu de Stuart
pendant 1 minute pour libérer toutes les cellules bactériennes.
Retirer l’écouvillon et centrifuger l’échantillon pendant 5 minutes à 8 000 × g.
Retirer et jeter le surnageant.
2
Remettre en suspension le culot dans 160 µL d’EDTA 50 mM (pH 8) par pipetages
successifs. Pour une lyse efficace, ajouter 20 µL de 10 mg/ml de lysozyme et
20 µL de 10 mg/ml de lysostaphine. Vortexer vigoureusement et incuber pendant
40 à 60 minutes à 37 °C. Vortexer de temps en temps.
3
200 µL de tampon B3, vortexer vigoureusement et incuber à 70 °C pendant
10 minutes. Vortexer brièvement. Passer à l’étape 4 du protocole standard.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
37
ADN génomique des tissus
7
Références concernant les protocoles
additionnels
Protocoles
additionels
Références
Queues de souris
et de rats
•
Colvin, S. et al., 341 repeats is not enough for methylation
in a new fragile X mouse model. eNeuro 2022, 9 (5),
ENEURO.0142 – 22.2022.
https ://doi.org/10.1523/eneuro.0142 – 22.2022.
•
Mimouni, N. E. H. et al., Fertilization, but not postimplantation development, can occur in the absence of
sperm and oocyte Beta1 integrin in mice. International
Journal of Molecular Sciences 2022, 23 (22), 13812.
https ://doi.org/10.3390/ijms232213812.
•
Garcia-Fernandez, A. et al., Producing Escherichia coli
Sequence Type 167 High-Risk Clone. mSphere 2020, 5 (2).
https ://doi.org/10.1128/msphere.00269 – 20.
•
Kempf, F et al., Genome Sequences of Two Bovine MastitisCausing Escherichia coli Strains. Genome Announcements
2015, 3 (2).
https ://doi.org/10.1128/genomea.00259 – 15.
•
Dzanaeva, L. S. et al., Riboflavin overproduction on
lignocellulose hydrolysate by the engineered yeast Candida
famata. FEMS Yeast Research 2024.
https ://doi.org/10.1093/femsyr/foae020.
•
Dmytruk, K. V. et al., Efficient production of bacterial
antibiotics aminoriboflavin and roseoflavin in eukaryotic
microorganisms, yeasts. Microbial Cell Factories 2023, 22
(1).
https ://doi.org/10.1186/s12934‑023‑02129 – 8.
•
Glapa-Nowak, A. et al., Leukocyte Telomere Length Is Not
Reduced in Children and Adults with Cystic Fibrosis but
Associates with Clinical Characteristics—A Cross-Sectional
Study. Journal of Clinical Medicine 2021, 10 (4), 590.
https ://doi.org/10.3390/jcm10040590.
•
Tadesse, H. et al., Epidemiological Survey on Tick-Borne
Pathogens with Zoonotic Potential in Dog Populations of
Southern Ethiopia. Tropical Medicine and Infectious Disease
2023, 8 (2), 102.
https ://doi.org/10.3390/tropicalmed8020102.
Bactéries
Levure
Tâches de sang
séché
38
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
ADN génomique des tissus
Protocoles
additionels
Références
ADN génomique
et ARN viral
d’échantillon de
sang
•
Godler, D. E. et al., Detection of skewed X-chromosome
inactivation in Fragile X syndrome and X chromosome
aneuploidy using quantitative melt analysis. Expert Reviews
in Molecular Medicine 2015, 17.
https ://doi.org/10.1017/erm.2015.11.
•
Costantini, D. et al., Physiological costs of infection :
herpesvirus replication is linked to blood oxidative stress in
equids. Scientific Reports 2018, 8 (1).
https ://doi.org/10.1038/s41598‑018‑28688 – 0.
•
Lippold, S. et al., Whole mitochondrial genome sequencing
of domestic horses reveals incorporation of extensive wild
horse diversity during domestication. BMC Evolutionary
Biology 2011, 11 (1), 328.
https ://doi.org/10.1186/1471‑2148‑11 – 328.
•
Van Den Hoven, R. et al., Putative regulation mechanism
for the MSTN gene by a CpG island generated by the SINE
marker Ins227bp. BMC Veterinary Research 2015, 11 (1).
https ://doi.org/10.1186/s12917‑015‑0428 – 3.
•
Campo, I. et al., A large kindred of pulmonary fibrosis
associated with a novel ABCA3 gene variant. Respiratory
Research 2014, 15 (1).
https ://doi.org/10.1186/1465‑9921‑15 – 43.
•
Grbavac, L. et al., Comprehensive Diagnosis, Treatment,
and Outcome of Taenia crassiceps Cysticercosis in a RingTailed Lemur (Lemur catta) from a Croatian Zoo : No Longer
Unusual? Pathogens 2024, 13 (4), 283.
https ://doi.org/10.3390/pathogens13040283.
•
Fernández-Soto, P. et al., A Loop-Mediated Isothermal
Amplification (LAMP) Assay for Early Detection of
Schistosoma mansoni in Stool Samples : A Diagnostic
Approach in a Murine Model. PLoS Neglected Tropical
Diseases 2014, 8 (9), e3126.
https ://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003126.
•
Fernández-Soto, P. et al., A. Strong-LAMP : A LAMP Assay
for Strongyloides spp. Detection in Stool and Urine Samples.
Towards the Diagnosis of Human Strongyloidiasis Starting
from a Rodent Model. PLoS Neglected Tropical Diseases
2016, 10 (7), e0004836.
https ://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004836.
Racines des
cheveux
Tissu inclus en
paraffine
ADN génomique
des fèces
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
39
ADN génomique des tissus
Protocoles
additionels
Références
ADN Viral (ex.,
CMV) dans les
fécès
•
Balboni, A. et al., Canine circovirus and Canine adenovirus
type 1 and 2 in dogs with parvoviral enteritis. Veterinary
Research Communications 2021, 46 (1), 223 – 232.
https ://doi.org/10.1007/s11259‑021‑09850-y.
Détection de
Mycobacterium
tuberculosis ou
de Legionella
pneumophila dans
les expectorations
ou le lavage
broncho-alvéolaire
•
Doughty, E. L. et al., Culture-independent detection and
characterisation of Mycobacterium tuberculosisand & M.
africanumin sputum samples using shotgun metagenomics
on a benchtop sequencer. PeerJ 2014, 2, e585.
https ://doi.org/10.7717/peerj.585.
Détection des
bactéries EHEC
dans les aliments
•
Galia, W. et al., Strand-specific transcriptomes of
Enterohemorrhagic Escherichia coli in response to
interactions with ground beef microbiota : interactions
between microorganisms in raw meat. BMC Genomics
2017, 18 (1).
https ://doi.org/10.1186/s12864‑017‑3957 – 2.
Purification de
l’ADN bactérien
•
Jalkh, A. P. et al., Chlamydia trachomatis in human
immunodeficiency virus-infected men treated at a referral
hospital for sexually transmitted diseases in the Amazonas,
Brazil. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 2013, 18
(2), 158 – 163.
https ://doi.org/10.1016/j.bjid.2013.06.007.
Purification de
l’ADN bactérien
(p.e. Borrelia
burgdorferi) à partir
de l’urine
•
Mazlina, M. et al., Pathological changes and bacteriological
assessments in the urinary tract of pregnant goats
experimentally infected with Brucella melitensis. BMC
Veterinary Research 2018, 14 (1).
https ://doi.org/10.1186/s12917‑018‑1533-x.
Purification de
l’ADN viral (p.e.
CMV) à partir de
l’urine
•
Balboni, A. et al., Integrated Use of Molecular Techniques to
Detect and Genetically Characterise DNA Viruses in Italian
Wolves (Canis lupus italicus). Animals 2021, 11 (8), 2198.
https ://doi.org/10.3390/ani11082198.
40
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
Protocoles
additionels
Références
Purification de
l’ADN génomique
d’insectes
•
Pittermannová, P. et al., Wild Small Mammals and Ticks
in Zoos—Reservoir of Agents with Zoonotic Potential?
Pathogens 2021, 10 (6), 777.
https ://doi.org/10.3390/pathogens10060777.
•
Kranzfelder, P. et al., Trace DNA from insect skins : a
comparison of five extraction protocols and direct PCR on
chironomid pupal exuviae. Molecular Ecology Resources
2015, 16 (1), 353 – 363.
https ://doi.org/10.1111/1755 – 0998.12446.
Purification de
•
l’ADN génomique à
partir d’écouvillons
dentaires
Frerejacques, M. et al., Human Skin Bacterial Community
Response to Probiotic (Lactobacillus reuteri DSM 17938)
Introduction. Microorganisms 2020, 8 (8), 1223.
https ://doi.org/10.3390/microorganisms8081223.
Purification de
•
l’ADN génomique à
partir d’écouvillons
buccaux
Eipel, M. et al., Epigenetic age predictions based on buccal
swabs are more precise in combination with cell typespecific DNA methylation signatures. Aging 2016, 8 (5),
1034 – 1048.
https ://doi.org/10.18632/aging.100972.
Purification de
•
l’ADN génomique à
partir du sperme
Bongiorni, S. et al., Identification of a short region on
chromosome 6 affecting direct calving ease in piedmontese
cattle breed. PLoS ONE 2012, 7 (12), e50137.
https ://doi.org/10.1371/journal.pone.0050137.
Purification de
l’ADN génomique
de cyanobactéries
•
Capra, E. et al., Epigenetic analysis of high and low
motile sperm populations reveals methylation variation in
satellite regions within the pericentromeric position and in
genes functionally related to sperm DNA organization and
maintenance in Bos taurus. BMC Genomics 2019, 20 (1).
https ://doi.org/10.1186/s12864‑019‑6317 – 6.
•
Walter, J. M. et al., Occurrence of Harmful Cyanobacteria in
Drinking Water from a Severely Drought-Impacted Semi-arid
Region. Frontiers in Microbiology 2018, 9.
https ://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00176.
•
Grubišić, M. et al., Bioprospecting of Microalgae Isolated
from the Adriatic Sea : Characterization of Biomass,
Pigment, Lipid and Fatty Acid Composition, and Antioxidant
and Antimicrobial Activity. Molecules 2022, 27 (4), 1248.
https ://doi.org/10.3390/molecules27041248.
Protocoles
additionels
Références
Purification
de l’ADN de
Staphylococcus
aureus résistant
à la méthicilline
(SARM)
•
Kwon, S.-J. et al., Quantitative PCR for Etiologic Diagnosis
of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Pneumonia
in Intensive care unit. Tuberculosis & Respiratory Diseases
2012, 72 (3), 293.
https ://doi.org/10.4046/trd.2012.72.3.293.
•
Conrad, C. C. et al., Zoonotic fecal pathogens and
antimicrobial resistance in Canadian petting zoos.
Microorganisms 2018, 6 (3), 70.
https ://doi.org/10.3390/microorganisms6030070.
ADN génomique des tissus
8
Annexes
8.1
Guide de résolution des problèmes
Problème
Causes possibles et suggestions
Lyse incomplète
•
L’échantillon n’a pas été complètement homogénéisé et
mélangé avec le tampon T1 / ​protéinase K. Le mélange doit être
vigoureusement vortexé immédiatement après l’ajout du tampon
T1.
•
Diminution de l’activité de la protéinase K : Conserver la
protéinase K dissoute à - 20 °C pendant 6 mois.
Réactifs mal utilisés
•
Faible ou
inexistant
rendement en
ADN
Préparer le tampon B5 et la solution de protéinase K selon les
instructions (voir chapitre 3). Ajouter de l’éthanol aux lysats avant
de les charger sur les colonnes.
Elution sous-optimale de l’ADN de la colonne
•
Pour certains types d’échantillons, préchauffer le tampon BE à
70 °C avant l’élution. Appliquer le tampon BE directement au
centre de la membrane de silice.
•
L’efficacité de l’élution diminue considérablement si l’élution
est effectuée avec des tampons dont le pH est inférieur à 7,0.
Utiliser des tampons d’élution légèrement alcalins comme le
tampon BE (pH 8,5).
•
En particulier lorsque l’on s’attend à des rendements élevés à
partir de grandes quantités de matériel, nous recommandons
l’élution avec 200 μL de tampon BE et l’incubation des colonnes
fermées dans un incubateur à 70 °C pendant 5 min avant la
centrifugation.
Lyse incomplète
Mauvaise
qualité de
l’ADN
•
L’échantillon n’a pas été complètement homogénéisé et
mélangé avec le tampon T1 / ​protéinase K. Le mélange doit être
vigoureusement vortexé immédiatement après l’ajout du tampon
T1.
•
Diminution de l’activité de la protéinase K : Conserver la
protéinase K dissoute à - 20 °C pendant 6 mois.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
43
ADN génomique des tissus
Problème
Causes possibles et suggestions
Réactifs mal utilisés
•
Mauvaise
qualité de
l’ADN
(suite)
Préparer le tampon B5 et la solution de protéinase K selon les
instructions (voir chapitre 3). Ajouter de l’éthanol aux lysats avant
de les charger sur les colonnes.
ARN dans l’échantillon
•
Si l’on souhaite obtenir un ADN exempt d’ARN, ajouter 20 μL de
solution de RNase A (10 mg / ​mL ; non fournie avec le kit) avant
l’ajout du tampon B3 et incuber à 37 °C pendant 5 min.
Trop d’échantillons utilisés
•
Colonnes
bouchées
Ne pas utiliser plus d’échantillon que la quantité recommandée
(25 mg pour la plupart des types de tissus). Si du matériel
insoluble comme des os ou des cheveux reste dans le lysat,
centrifuger les débris et transférer le surnageant clarifié dans un
nouveau tube de microcentrifugation avant de procéder à l’ajout
du tampon B3 et de l’éthanol. L’utilisation du filtre NucleoSpin®
avant le chargement de la colonne permet d’éviter le colmatage
de la colonne.
Lyse incomplète
•
L’échantillon n’est pas complètement homogénéisé et
mélangé avec le tampon T1/protéinase K. Le mélange doit être
vigoureusement vortexé immédiatement après l’ajout du tampon
T1.
•
Diminution de l’activité de la protéinase K : Conserver la
protéinase K dissoute à -20 °C pendant 6 mois.
Réactifs mal utilisés
•
Préparer le tampon B5 et la solution de protéinase K selon les
instructions (voir chapitre 3). Ajouter de l’éthanol aux lysats avant
de les charger sur les colonnes.
Elimination de l’éthanol ou du sel
Performance
sous-optimale
de l’ADN
génomique
dans les
réactions
enzymatiques
44
•
Veiller à centrifuger ≥ 1 min à 11 000 x g afin d’éliminer la totalité
du tampon éthanolique B5 avant d’éluer l’ADN. Si, pour une
raison quelconque, le niveau de Buffer B5 a atteint la sortie de la
colonne après séchage, répéter la centrifugation.
•
Ne pas refroidir le tampon B5 avant de l’utiliser. Un tampon froid
n’éliminera pas efficacement le sel. Équilibrer le tampon B5 à la
température ambiante avant de l’utiliser.
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
ADN génomique des tissus
Problème
Causes possibles et suggestions
Contamination de l’ADN par des substances inhibitrices
Performance
sous-optimale
de l’ADN
génomique
dans les
réactions
enzymatiques
(suite)
8.2
•
Ne pas éluer l’ADN avec le tampon TE. L’EDTA peut inhiber
les réactions enzymatiques. Repurifier l’ADN et l’éluer dans le
tampon BE.
•
Si le rapport A260 / ​A280 de l’éluat est inférieur à 1,6, répéter la
procédure de purification : Ajouter 1 volume de tampon B3 plus
1 volume d’éthanol (96 – 100 %) à l’éluat. Charger le mélange sur
une colonne NucleoSpin® Tissue Column et procéder à l’étape 5
du protocole standard (voir paragraphe 5).
Informations de commande
Produit
REF
Conditionnement
NucleoSpin® Tissue
740952.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250 preps
NucleoSpin® Tissue XS
740901.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250 preps
NucleoSpin® DNA RapidLyse
740100.10/.50/.250
10/50/250 preps
NucleoSpin® Blood
740951.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250 preps
Tampon T1
740940.25
50 mL
Tampon B3
740920
100 mL
Concentré de tampon B5
(pour 100 mL de tampon B5)
740921
20 mL
Tampon BW
740922
100 mL
Protéinase K
740506
100 mg
RNase A
740505.50
740505
50 mg
100 mg
NucleoSpin® Microbial DNA
740235.10 / .50
10 / 50 preps
MN Bead Tube Holder
740469
1 piece
MN Bead Tubes Type A
(billes en céramique de
0,6 – 0,8 mm ; recommandé
pour les sols et les sédiments)
740786.50
50 pièces
MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
45
ADN génomique des tissus
Produit
REF
Conditionnement
MN Bead Tubes Type B
(40 – 400 μm μm billes de
verre ; recommandé pour les
bactéries)
740812.50
50 pièces
MN Bead Tubes Type C
(1 – 3 mm de corindon ;
recommandé pour les levures)
740813.50
50 pièces
MN Bead Tubes Type D
(billes d’acier de 3 mm ;
recommandé pour les
insectes)
740814.50
50 pièces
MN Bead Tubes Type E
(billes de verre de 40 à
400 μm et billes d’acier de
3 mm ; recommandé pour
les bactéries difficiles à
tolérer dans les échantillons
d’insectes ou de tissus)
740815.50
50 pièces
MN Bead Tubes Type F
(1 – 3 mm de corindon
+ 3 mm de billes d’acier ; à
utiliser uniquement avec MN
Bead Tube Holder !)
740816.50
50 pièces
NucleoSpin® DNA FFPE XS
740980.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250 pièces
NucleoSpin® Forensic Filters
740988.10 / .50 / .250
10 / 50 / 250 pièces
NucleoSpin® Forensic Filters
(en vrac)
740988.50B / .250B / ​1000B
50 / 250 / ​1000 pièces
Collection Tubes (2 mL)
740600
1000
NucleoSpin® Filters
740606
50
NucleoCard®
740403.10 / .100
10 / 100 cartes
Visitez le site www.mn‑net.com pour obtenir des informations plus détaillées sur le
produit.
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MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
ADN génomique des tissus
8.3
Restrictions d'utilisation / ​garantie
Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils
sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description
de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits
MACHEREY‑NAGEL.
Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes
de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit.
Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications
et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du
produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et
descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL.
Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants
de MACHEREY‑NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par
un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et
elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie.
La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits
est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente
deMACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la
société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie.
Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent,
veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus
récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre
revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les
descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre
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MACHEREY-NAGEL – 10/2024, Rev. 21
47
Plasmid DNA
Clean up
RNA
DNA
Viral RNA and DNA
Protein
High throughput
Accessories
Auxiliary tools
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