ESTRIOL SALIVA pour analyses de routine Détermination immunoenzymatique directe d'œstriol dans la salive LOT IVD Voir l’étiquette externe USAGE PRÉVU Méthode immunoenzymatique colorimétrique par compétition pour la détermination quantitative d'œ striol dans la salive. Le kit Estriol Saliva est destiné exclusivement à un usage en laboratoire. 1. SIGNIFICATION CLINIQUE L'œ striol est l'un des trois œ strogènes principaux produits par le corps humain. Il est produit avant tout pendant la grossesse à partir s'une unité maternoplacento-fœ tale. La production fœ to-placentaire d'œ striol entraîne une augmentation progressive des niveaux circulants maternels atteignant un pic en fin de gestation, considérablement supérieurs aux niveaux des femmes non enceintes. Dans la circulation maternelle, l'œ striol est rapidement conjugué dans le foie et excrété par voie urinaire avec une demi-vie de 20 minutes environ. Puisque la production normale de l'œ striol dépend d'une circulation materno-placentofœ tale intacte et d'un métabolisme fœ tal fonctionnel, les taux maternels d'œ striol servent à contrôler l'état du fœ tus pendant la grossesse, en particulier pendant le troisième trimestre. La DHEA-S produite par le cortex de la surrénale du fœ tus est converti en œ striol par le placenta. Les niveaux anormalement bas peuvent indiquer, chez une femme enceinte, un problème dans le développement de l'enfant. Les taux d'œ striol sont comparables chez les femmes non enceintes ou en ménopause et chez les hommes. 2. PRINCIPE DE LA MÉTHODE L'œ striol (antigène) présent dans l'échantillon rentre en compétition avec l'antigène marqué à la peroxydase par rapport à l'anticorps anti-œ striol adsorbé sur microplaque (phase solide). Après une période donnée d'incubation, la séparation libre-lié est obtenue par simple lavage de la phase solide. L’ enzyme présent dans la réaction liée catalyse la réaction entre le substrat (H2O2) et le substrat TMB (TMB) en développant une coloration bleue qui vire au jaune après ajout de la solution d'arrêt (H2SO4). L’ intensité de la couleur développée est inversement proportionnelle à la concentration d'œ striol dans l'échantillon. Σ = 96 tests RÉF DKO026 La concentration d'œ striol dans l'échantillon est calculée sur la base d'une série de Étalons. 3. REACTIFS, MATERIAUX ET INSTRUMENTS 3.1. Réactifs et matériaux fournis dans le coffret 1. Étalons d'œ striol (6 flacons, 1 mL chaque) STD0 RÉF DCE002/2606-0 STD1 RÉF DCE002/2607-0 STD2 RÉF DCE002/2608-0 STD3 RÉF DCE002/2609-0 STD4 RÉF DCE002/2610-0 STD5 RÉF DCE002/2611-0 2. Contrôles (2 flacons, 1 mL chaque) Contrôle L RÉF DCE045/2601-0 Contrôle M RÉF DCE045/2602-0 3. Tampon d'incubation (1 flacon, 30 mL) Tampon phosphate pH 7,5; BSA 1 g/L; agents de conservation RÉF DCE010-0 4. Conjugué (1 flacon, 1 mL) Conjugué d'œ striol avec peroxydase de raifort (HRP) RÉF DCE002/2602-0 5. Microplaque coatée (1 microplaque sécable) Anticorps anti-œ striol adsorbée sur microplaque RÉF DCE002/2603-0 6. Solution de lavage conc. 50X (1 flacon, 20 mL) NaCl 45 g/L, Tween-20 55 g/L RÉF DCE006-0 7. Substrat TMB (1 flacon, 15 mL) H2O2-TMB (0,26 g/L) (éviter tout contact avec la peau) RÉF DCE004-0 8. Solution d'arrêt (1 flacon, 15 mL) Acide sulfurique 0,15M (éviter le contact avec la peau) RÉF DCE005-0 3.2. Réactifs nécessaires non fournis dans le coffret Eau distillée. 3.3. Matériaux et instruments auxiliaires Distributeurs automatiques. Lecteur pour microplaques (450 nm). Dispositif de prélèvement de salive RÉF DKO063 Salivette Sarstedt RÉF 51.1534.500 Remarques Conserver tous les réactifs à 2÷8°C, à l'abri de la lumière. N'ouvrir le sachet du Réactif 5 (Microplaque Coatée) qu'après l'avoir ramené à température ambiante et refermez-le tout de suite après avoir prélevé les bandes à utiliser; une fois ouvert, il est stable jusqu'à la date d'échéance du coffret. Éviter de détacher la feuille adhésive des bandes qui ne sont pas utilisées pendant l'analyse en cours. 4. AVERTISSEMENTS • Ce coffret est exclusivement pour usage in vitro et l'essai doit être exécuté par un personnel expert. • Utilisez les dispositifs de protection individuelle prévus pendant toute opération avec les réactifs fournis. • Certains réactifs contiennent de petites quantités R de Proclin 300 comme conservateur. Eviter tout contact avec peau et les muqueuses. • Le Chromogène TMB contient un irritant qui peut être nocif si inhalé, ingéré ou absorbé à travers la peau. Pour empêcher des lésions, éviter toute inhalation ou ingestion par la peau ou les yeux et tout contact cutané ou oculaire. • La solution d'arrêt est constituée d'une solution d'acide sulfurique dilué. L'acide sulfurique est poison et corrosif et peut être toxique s'il est ingéré. Pour prévenir toute brûlure chimique possible, éviter le contact avec la peau et les yeux. • Éviter l'exposition du réactif TMB/H2O2 à la lumière directe du soleil, aux métaux et aux substances oxydantes. Ne pas congeler la solution. • Cette méthode permet de déterminer des concentrations d'œ striol de 2,5 à 4000 pg/mL. • L'administration de stéroïdes naturels ou synthétiques peut altérer les taux salivaires d'œ striol. 5. PRÉCAUTIONS D'USAGE • Observer rigoureusement l'ordre des passages indiqué dans le présent protocole. • Tous les réactifs doivent être conservés à une température contrôlée de 2-8°C dans leurs conteneurs originaux. Les exceptions sont clairement marqués. • Avant usage, laisser reposer tous les éléments des coffrets et les échantillons à température ambiante (22-28°C) et mélanger avec soin. • Ne pas échanger des éléments du coffret provenant de lots différents. Les dates d'échéance rapportées sur les étiquettes des récipients d'expédition et sur celles de tous les ampoules doivent être observées. Ne pas utiliser d'éléments au-delà de leur date d'échéance. • Si vous utilisez des équipements automatisés est de la responsabilité de l'utilisateur de s'assurer que le kit a été correctement validées. • Un lavage incomplet ou peu soigné et une aspiration insuffisante du liquide dans les puits des tests ELISA peuvent provoquer un manque de précision et/ou un arrière-plan élevé. • Il est important de maintenir constants les temps de réaction dans chaque puits afin d'obtenir les • • • • • résultats susceptibles d'être répétés. Le pipetage des échantillons ne doit pas durer plus de 10 minutes afin d'éviter tout résultat incorrect. S'il se prolonge au-delà des 10 minutes, il est recommandé de suivre l'ordre de distribution. Si vous devez utiliser plus d’ une microplaque, il est conseillé de répéter la courbe dose-réponse. L’ ajout de la solution de substrat donne lieu à une réaction cinétique qui est interrompue par l'ajout de la solution de blocage. Par conséquent, il est nécessaire d'ajouter le substrat et la solution bloquante dans la séquence même afin d'éliminer toute variation temporelle pendant la réaction. Observer les instructions relatives à l'exécution du contrôle de qualité dans les laboratoires cliniques en testant les contrôles et/ou les groupes de sérum. Observer la plus grande précision dans la reconstitution et la distribution des réactifs. Ne pas utiliser des échantillons microbiologiquement contaminés ou des échantillons hautement lipémiques ou hémolysés. Les lecteurs de microplaques mesurent dans le sens vertical. Ne pas toucher le fond des puits. 6. PROCÉDURE 6.1. Préparation des étalons (S0… .S5) Avant utilisation, laisser sur l'agitateur rotatif pendant au moins 5 minutes. Les concentrations suivantes d'œ striol correspondent aux étalons : S0 S1 S2 S3 S4 S5 pg/mL 0 2,5 15 100 600 4000 Stables 6 mois à 2÷8 °C à compter de l'ouverture des flacons. Pour Unites SI : pg/mL x 3,5 = pmol/L 6.2. Préparation de la solution de lavage Avant l'usage, diluer le contenu de chaque flacon de solution de lavage concentrée et tamponnée (50x) avec de l'eau distillée jusqu'à un volume de 1000 mL. Pour préparer des volumes moindres, respecter le rapport de dilution de 1:50. La solution de lavage diluée est stable à 2÷8°C pendant au moins 30 jours. 6.3. Préparation du conjugué dilué Préparer immédiatement avant l'usage. Diluer 10 μL de Conjugué (réactif 4) à 1 mL de Tampon d'incubation (réactif 3). Mettre à agiter délicatement sur un agitateur rotatif. Stables pendant 3 heures à température ambiante (22÷28°C). 6.4. Préparation de l'échantillon Ce kit permet la détermination de œ striol dans les échantillons de salive. Il est conseillé, pour le prélèvement de l'échantillon, d'utiliser les tubes des Dispositifs de prélèvement de salive Diametra ou des Salivette Sarstedt (RÉF. 51.1534.500). 6.4.1. Méthode et limites Recueillir les échantillons de salive dans les temps prescrits. Pour une meilleure reproductibilité et précision, il est conseillé de prélever au moins 3 échantillons dans un intervalle de temps non inférieur à 2 heures et de constituer un pool avec ces spécimens avant de les tester. En l'absence d'indications spécifiques aux fins du prélèvement de la salive, il est possible de recueillir les échantillons à tout moment en tenant toutefois en compte les facteurs suivants : a) Si le prélèvement de la salive doit être effectué le matin, il faut le faire avant de se laver les dents. b) Pendant la journée, attendre au moins une heure après avoir mangé ou bu avant de recueillir les échantillons de salive. c) Il est très important d'obtenir un échantillon liquide – non contaminé par la nourriture, des produits cosmétiques, du sang, du chewinggum ou d'autres matières étrangères. 6.4.2. Traitement de la salive A) Dispositif de prélèvement de salive Diametra Faire passer la salive à travers la paille et jusque dans l'éprouvette en verre. 1) Centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à 3000 t/min. 2) Le déposer à –20°C pendant au moins 1 heure. 3) Décongeler l'échantillon. 4) Centrifuger encore pendant 15 minutes à 3000 t/min. 5) L'échantillon de salive est alors près pour être testé. 6) Conserver l'échantillon à 2÷8°C pendant une semaine ou à –20°C pendant une période de temps plus longue. B) Salivette Sarstedt (voir ifu) 6.5. Procédure Puisqu'il faut opérer en double, préparer deux puits pour chaque point de la courbe d'étalonnage (S0-S5), deux pour chaque contrôle, deux pour chaque échantillon et un pour le blanc. Réactif Étalon/ contrôle Échantillon Échantillon Blanc 50 µL Étalon S0-S5, Contrôle L-M 50 µL Conjugué dilué 100 µL 100 µL Laisser incuber 1h à température ambiante (22÷28°C). Retirer le contenu de chaque puits, laver les puits trois fois avec 300 µL de solution de lavage diluée. Substrat TMB 100 µL 100 µL 100 µL Laisser incuber 15 minutes à température ambiante (22÷28°C), à l'abri de la lumière. Solution d'arrêt 100 µL 100 µL 100 µL Agiter doucement la microplaque. Lire l'absorbance (E) à 450 nm en mettant à zéro avec le blanc. 7. CONTRÔLE DE QUALITÉ Chaque laboratoire devrait analyser les échantillons dans la gamme des niveaux élevés, normaux et bas d'œ striol pour vérifier les prestations de l'analyse. Ces échantillons devraient être traités comme inconnus et les valeurs déterminées devraient être dans chaque test effectué. Les tableaux de contrôle de la qualité devraient être observés afin de suivre les prestations des réactifs fournis. Des méthodes statistiques appropriées devraient être employées pour vérifier la tendance. Le laboratoire devrait définir des limites d'acceptabilité des prestations d'analyse. Les autres paramètres qui devraient être contrôlés incluent les interceptions de 80, 50 et 20% de la courbe d'étalonnage pour évaluer la reproductibilité. De plus, la capacité d'absorption maximale devrait être constante avec l'expérience précédente. La déviation significative par rapport aux prestations établies peut indiquer un changement non observé des états ou une dégradation expérimentale des réactifs du coffret. Des réactifs frais doivent être utilisés pour déterminer le motif des variations. 7.1. Interprétation des résultats Si un ordinateur a été utilisé pour calculer les résultats, il faut impérativement que les valeurs des calibrateurs tombent dans les 10% des concentrations assignées. 8. RÉSULTATS 8.1. Extinction moyenne Calculer l'extinction moyenne (Em) de chaque point de la courbe d'étalonnage (S0–S5) et de chaque échantillon. 8.2. Courbe d'étalonnage Sur un graphique des valeurs d'absorbance, tracer les valeurs calculées des extinctions moyennes (Em) de chaque étalon (S0–S5) en fonction des concentrations. Tracer la meilleur courbe passant par les points d'étalonnage (par ex. : logistique à quatre paramètres). 8.3. Calcul des résultats Sur le graphique, faire une interpolation des valeurs d'absorbance relatives à chaque échantillon et en lire la concentration correspondante en pg/mL. 9. VALEURS DE RÉFÉRENCE Du fait que les valeurs d'œ striol salive ont un rythme circadien, nous suggérons de recueillir les échantillons à la même heure (8 h A.M.). Les valeurs suivantes peuvent servir d'indication préliminaire jusqu'à ce que chaque laboratoire établisse sa propre fourchette de valeurs normales : Groupe Heure N Femmes Pré-ménopause 8 AM 5 AM 21 21 Semaine de grossesse 22° 24° 26° 28° 30° 32° 34° 36° 37° 38° 39° 40° Fourchette +/- SD (pg/mL) 0 - 21.0 0 - 6.8 Fourchette absolue (pg/mL) 0 - 32.0 0 - 8.9 Salive (pg/mL) (700 ± 500) (900 ± 600) (1200 ± 700) (1500 ± 800) (1800 ± 800) (2200 ± 1100) (3200 ± 1300) (4100 ± 1600) (4500 ± 1700) (5000 ± 2000) (5300 ± 2000) (5700 ± 2000) 10. PARAMÈTRES CARACTÉRISTIQUES 10.1. Précision 10.1.1. Intra-essai La variabilité à l'intérieur du même coffret a été déterminée en répliquant (16x) la mesure de deux contrôles salivaires différents. La variabilité intraessai est ≤ 9,7%. 10.1.2. Inter-essai La variabilité entre coffrets différents a été déterminée en répliquant (10x) la mesure de deux sérums de contrôle différents avec des coffrets appartenant à des lots différents. La variabilité interessai est ≤ 13,7%. 10.2. Exactitude L'épreuve de récupération conduite sur un échantillon de salive enrichi avec 50 – 300 – 2000 pg/mL d'œ striol a donné une valeur moyenne (±SD) de 100,6% ± 14,6%. 10.3. Sensibilité La concentration minimale d'œ striol mesurable qui pouvant être distinguées par l'étalon zéro est de 1,0 pg/mL avec une limite de confiance de 95%. 10.4. Spécificité L'anticorps employé présente les réactions croisées suivantes, calculées à 50% selon Abraham : Œ striol salive 16 épi-œ striol 15 α-OH-œ striol Œ striol 3-sulfate Œ stradiol 17 épi-œ striol Œ striol 3α-glucoronate Œ striol 16α-glucoronate Prednisone Estrone 100 % 10,5 % 7,0 % 2,0 % 0,1 % -2 < 1x10 % -2 < 1x10 % -2 < 1x10 % -2 < 1x10 % -4 < 1x10 % 10.5. Corrélation Le coffret d'œ striol salive (Diametra) a été comparé à un coffret disponible en commerce. 30 échantillons de salive ont été testés. La courbe de régression est : y = 1,03x + 0,68 2 r = 0,988 y = Coffret Diametra Elisa pou l'œ striol salive x = Coffret Salimetrics Elisa pou l'œ striol salive 11. DISPOSITIONS RELATIVES À L'ÉLIMINATION DES DÉCHETS Les réactifs doivent être jetés conformément aux lois en vigueur. BIBLIOGRAPHIE 1. Fisher-Rasmussen W., et al Acta Obstet. Gynecol Scand 60: 417 -420 (1981) 2. Truran, P. L., et al Clin. Chem. 28/12, 2393 (1982) 3. Vining R.F., et al J. Clin. Endoc. Metab. 56,454 (1983) 4. Bagger P.V., et al Acta Obstet Gynec Scand 60:187 (1981) 5. Osterman, T. M., et al Clin. Chem. 25 (5) 716 (1979) 6. Wisdom, G.B.Clin Chem. 22 (8) 1243-1255 (1976) Éd. 10/2011 DCM026-10 DiaMetra S.r.l. - Siège social : Via Garibaldi, 18 – 20090 SEGRATE (MI) Italie Tél. 0039-02-2139184 – 02-26921595 Fax 0039–02–2133354 Fabricant : Via Giustozzi 35/35a – Z.I. Paciana – 06034 FOLIGNO (PG) Italie Tél. 0039–0762–24851 Fax 0039–0762–316197 Courriel : [email protected] DIA.METRA SRL Mod. PIS IT NOTICE D'INFORMATION Spiegazione dei simboli DE Verwendete Symbole RÉF yyyy-mm-dd Σ = xx Max Min GB Explanation of symbols FR ES Explication des symboles Significado de los simbolos PT Explicaçao dos simbolos DE ES FR GB IT PT In vitro Diagnostikum Producto sanitario para diagnóstico in vitro Dispositif médical de diagnostic in vitro In vitro Diagnostic Medical Device Dispositivo medico-diagnostico in vitro Dispositivos medicos de diagnostico in vitro DE ES FR GB IT PT Hergestellt von Elaborado por Fabriqué par Manufacturer Produttore Produzido por DE ES FR GB IT PT Bestellnummer Nûmero de catálogo Références du catalogue Catalogue number Numero di Catalogo Número do catálogo DE ES FR GB IT PT Herstellungs datum Fecha de fabricacion Date de fabrication Date of manufacture Data di produzione Data de produção DE ES FR GB IT PT Verwendbar bis Establa hasta (usar antes de último día del mes) Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué) Use by (last day of the month) Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese) Utilizar (antes ultimo dia do mês) DE ES FR GB IT PT Biogefährdung Riesgo biológico Risque biologique Biological risk Rischio biologico Risco biológico DE ES FR GB IT PT Gebrauchsanweisung beachten Consultar las instrucciones Consulter le mode d’emploi Consult instructions for use Consultare le istruzioni per l’uso Consultar instruções para uso DE ES FR GB IT PT Chargenbezeichnung Codigo de lote Numéro de lot Batch code Codice del lotto Codigo do lote DE ES FR GB IT PT Ausreichend für “n”Tests Contenido suficiente para ”n”tests Contenu suffisant pour “n”tests Contains sufficient for “n”tests Contenuto sufficiente per “n”saggi Contém o suficiente para “n”testes DE ES FR GB IT PT Inhalt Contenido del estuche Contenu du coffret Contents of kit Contenuto del kit Conteúdo do kit DE ES FR GB IT PT Temperaturbereich Límitaciôn de temperatura Limites de température de conservation Temperature limitation Limiti di temperatura Temperaturas limites de conservação yyyy-mm Cont. DIA.METRA SRL Mod. PIS NOTICE D'INFORMATION SUGGESTIONS POUR LA RÉSOLUTION DES PROBLÈMES / DÉPANNAGE ERREUR CAUSES POSSIBLES / SUGGESTIONS Aucune réaction colorimétrique du dosage - non distribution du conjugué - contamination du conjugué et/ou du substrat - erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs dans le mauvais ordre ou en provenance des mauvais flacons, etc.) Réaction trop faible (DO trop basse) - conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse Réaction trop intense (DO trop élevée) - conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée - mauvaise qualité de l'eau utilisée pour la solution de lavage (bas degré de déionisation) - lavages insuffisants (conjugué non entièrement aspiré) Valeurs inexplicablement hors plage - contamination des pipettes, embouts ou récipients - lavages insuffisants (conjugué non entièrement aspiré) CV% intra-essai élevé - les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage - le dispositif de lavage pour microplaques ne lave pas correctement (suggestion : nettoyer la tête du dispositif de lavage) CV% inter-essai élevé - conditions d'incubation non constantes (temps ou température) - contrôles et échantillons non distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (contrôler l'ordre de distribution) - variabilité intrinsèque des opérateurs ">
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