FICHE TECHNIQUE IRIS SALMONELLA® DETECTION DES SALMONELLES MOBILES ET IMMOBILES 1 BM16008 BM16108 BS07808 BS07708 BT01108 DOMAINE D’UTILISATION ® IRIS Salmonella constitue une méthode alternative de recherche des salmonelles dans les produits d’alimentation humaine et animale, ainsi que dans les échantillons de l’environnement (à l’exclusion des échantillons de production primaire). Les analyses peuvent être déclarées négatives dès 37 heures après les étapes d’enrichissement (Salmonella ® Enrichissement) et de différenciation (IRIS Salmonella Agar). La méthode permet la détection de toutes les salmonelles, mobiles et immobiles. La confirmation d’éventuels échantillons présomptivement positifs sera réalisée à l’aide d’un test Latex (CONFIRM’ Salmonella) ou par les tests classiques décrits dans les méthodes normalisées. ® La méthode IRIS Salmonella est également validée pour les prises d’essai de 50 g à 375 g pour les poudres de lait (incluant les poudres de lait infantile avec et sans probiotiques) et de 50 g à 125 g pour les farines et les croquettes utilisées dans l’alimentation animale. ® IRIS Salmonella est officiellement certifié NF VALIDATION, sous Attestation N° BKR 23/07 - 10/11, dont le terme de validité est fixé au 07 octobre 2015. BKR 23/07-10/11 METHODES ALTERNATIVES D’ANALYSE POUR L’AGROALIMENTAIRE Certifié par AFNOR Certification www.afnor-validation.org 2 PRINCIPES ème 3 • L’étape de dilution au 1/10 du produit à analyser est réalisée conformément aux recommandations de la norme NF EN ISO 6579 dans le bouillon Salmonella Enrichissement. La formule de Salmonella Enrichissement est conforme à celle de l’eau peptonée tamponnée. • L’étape d’enrichissement est réalisée en ajoutant le supplément sélectif IRIS Salmonella au bouillon préalablement mélangé avec l’échantillon à analyser. Le bouillon obtenu, Salmonella Enrichissement, est alors incubé pendant 18 heures ± 2 heures à 41,5 ± 1,0 °C pour le protocole général 25 g et 18 à 24 heures pour les protocoles 125 g et 375 g. • L’étape de différenciation est mise en œuvre par ensemencement de 10 μL sur IRIS Salmonella Agar et incubation pendant 24 heures ± 3 heures à 37 °C. Les salmonelles donnent des colonies magenta tandis que les colonies des autres espèces sont bleues, violacées ou incolores. • L’éventuelle étape de confirmation peut être réalisée par les tests classiques décrits dans les méthodes normalisées ou par CONFIRM’ Salmonella (test au latex), directement à partir d’une colonie magenta isolée ® sur IRIS Salmonella Agar. ® ® FOCUS SUR IRIS SALMONELLA® AGAR ® Les études réalisées avec IRIS Salmonella Agar démontrent sa grande spécificité pour la détection des salmonelles, y compris les espèces et les sérovars atypiques, sources de confusions sur d’autres milieux. Ainsi, la mise en évidence des Salmonella Typhi et Paratyphi, des Salmonella lactose-positif (Salmonella Senftenberg et sous-espèces S. arizonae et S. diarizonae), des souches saccharose-positif est assurée. Le milieu permet la détection des sérovars immobiles (S. Pullorum et S. Gallinarum) ou des souches monophasiques. Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – 60002 Beauvais Cedex – France Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr Page 1 sur 7 ® IRIS Salmonella Agar permet également de détecter les souches présentant une activité estérasique faible à nulle sur d’autres milieux (Salmonella bongori, Salmonella Dublin et Atento, quelques unes des sous-espèces S. enterica S. houtenae et S. diarizonae). Les agents sélectifs assurent l’inhibition des bactéries à Gram positif et de certaines bactéries à Gram négatif. ® IRIS Salmonella Agar peut également être utilisée dans les méthodes normalisées pour la recherche de Salmonella, comme second milieu d’isolement. 4 PREPARATION Préparation du milieu déshydraté Salmonella Enrichissement : • Mettre en solution 20,0 g de milieu déshydraté (BK194) dans 1 litre d’eau distillée ou déminéralisée. • Agiter lentement, jusqu’à dissolution complète. • Répartir en tubes ou en flacons. • Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. 5 Reconstitution: 20,0 g/L Stérilisation: 15 min à 121°C M ODE D ’ EMPLOI Respecter les bonnes pratiques de laboratoire (se référer à la norme NF EN ISO 7218). Protocole général pour les prises d’essai de 25 g : Enrichissement • Introduire aseptiquement (x) g de produit à analyser dans 9 (x) mL de Salmonella Enrichissement (se référer à la fiche technique BK194, BM136, BM137 et BM144). • Homogénéiser parfaitement. • Introduire le supplément liquide IRIS Salmonella à raison de 0,1 mL/g d’échantillon (soit 2,5 mL pour 25 g) pour le supplément liquide (BS078). Enrichissement avec supplément Incubation : 18 h à 41,5 °C ® ou ® ème • Introduire un comprimé de supplément IRIS Salmonella (BS077) pour 25 g d’échantillon (dilué au 1/10 dans Salmonella Enrichissement). • Homogénéiser. • Incuber le bouillon à 41,5 ± 1,0 °C pendant 18 heures ± 2 heures. Notes : • Pour des raisons d’organisation des laboratoires, l’incubation peut être poursuivie jusqu’à 24 heures. • De la même façon, les bouillons peuvent ensuite être conservés 3 jours à 2-8°C avant repiquage sur IRIS ® Salmonella Agar • Dans le cadre de la marque NF VALIDATION, les prises d’essai supérieures à 25 g n’ont pas été testées. Isolement • Repiquer 10 μL de l’enrichissement obtenu sur IRIS Salmonella Agar. • Incuber à 37 ± 1 °C pendant 24 heures ± 3 heures. ® Repiquage 10 µL Incubation : 24 h à 37 °C Note : Pour des raisons d’organisation des laboratoires, les géloses peuvent ensuite être conservées 3 jours à 2-8 °C avant d’être lues et de réaliser les éventuelles confirmations. Protocole 50 g à 375 g pour les poudres de lait : Enrichissement • Introduire aseptiquement (x) g de produit à analyser dans 9 (x) mL de Salmonella Enrichissement préalablement préchauffé à 41,5 °C ± 1,0 °C. • Homogénéiser parfaitement. Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – 60002 Beauvais Cedex – France Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr Page 2 sur 7 • ® Introduire le supplément liquide IRIS Salmonella à raison de 0,1 mL/g d’échantillon (soit 37,5 mL pour 375 g d’échantillon) pour le supplément liquide (BS078). ou ® • Introduire un comprimé de supplément IRIS Salmonella (BS077) pour 25 g ème dans Salmonella Enrichissement). d’échantillon (dilué au 1/10 • Homogénéiser. • Incuber le bouillon à 41,5 ± 1,0 °C pendant 18 à 24 heures. Enrichissement avec supplément Incubation : 18 à 24 h à 41,5 °C Notes : • Pour des raisons d’organisation des laboratoires, les bouillons peuvent être conservés 3 jours à 2-8°C ® avant repiquage sur IRIS Salmonella Agar. • Dans le cadre de la marque NF VALIDATION, seules les prises d’essai comprises entre 50 g et 375 g ont été testées pour les poudres de lait (incluant les poudres de lait infantile avec et sans probiotiques). Isolement Repiquage 10 µL • Repiquer 10 μL de l’enrichissement obtenu sur IRIS Salmonella Agar. • Incuber à 37 ± 1 °C pendant 24 heures ± 3 heures. ® Incubation : 24 h à 37 °C Note : Pour des raisons d’organisation des laboratoires, les géloses peuvent ensuite être conservées 3 jours à 2-8 °C avant d’être lues et de réaliser les éventuelles confirmations. Protocole 50 g à 125 g pour les farines ou croquettes dans l’alimentation animale : Enrichissement • Introduire aseptiquement (x) g de produit à analyser dans 9 (x) mL de Salmonella Enrichissement préalablement préchauffé à 41,5°C ± 1,0 °C. • Homogénéiser parfaitement. • Introduire le supplément liquide IRIS Salmonella à raison de 0,1 mL/g d’échantillon (soit 12,5 mL pour 125 g d’échantillon) pour le supplément liquide (BS078). ® ou ® • Introduire un comprimé de supplément IRIS Salmonella (BS077) pour 25 g ème dans Salmonella Enrichissement). d’échantillon (dilué au 1/10 • Homogénéiser. • Incuber le bouillon à 41,5 ± 1,0 °C pendant 18 à 24 heures. Enrichissement avec supplément Incubation : 18 à 24 h à 41,5 °C Notes : • Dans le cadre de la marque NF VALIDATION, seules les prises d’essai comprises entre 50 g et 125 g ont été testées pour les farines ou croquettes dans l’alimentation animale. Isolement Repiquage 10 µL • Repiquer 10 μL de l’enrichissement obtenu sur IRIS Salmonella Agar. • Incuber à 37 ± 1 °C pendant 24 heures ± 3 heures. ® Incubation : 24 h à 37 °C Note : Pour des raisons d’organisation des laboratoires, les géloses peuvent ensuite être conservées 3 jours à 2-8 °C avant d’être lues et de réaliser les éventuelles confirmations. Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – 60002 Beauvais Cedex – France Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr Page 3 sur 7 6 LECTURES L’aspect des colonies est le suivant : Microorganismes Caractéristiques des colonies Salmonella spp. (y compris Salmonella Typhi, Paratyphi, lactose-positif, saccharose-positif, immobile, monophasique, Dublin, bongori) Escherichia coli Enterobacter spp., Klebsiella spp. Rosé à Magenta Incolores Bleu-vert à violet Proteus spp. Incolores à brunâtres Gram positif Inhibés Voir ANNEXE 1 : SUPPORT PHOTO. 7 CONFIRMATIONS Dans le cadre de la marque NF VALIDATION, tous les résultats positifs doivent être confirmés de l’une des manières suivantes : • Option 1 : Mise en œuvre des tests classiques décrits dans les méthodes normalisées par le CEN ou l’ISO (en ® incluant l’étape de purification), en repartant d’une colonie magenta isolée sur IRIS Salmonella Agar. • Option 2 : Mise en œuvre de CONFIRM’ Salmonella (test au latex) à partir d’une colonie isolée. En cas de résultats discordants (positifs par la méthode alternative, non confirmés par l’une des options décrites cidessus, et en particulier par le(s) test(s) Latex), le laboratoire devra mettre en œuvre les moyens suffisants pour s’assurer de la validité du résultat rendu. Il est possible par exemple de procéder à des tests biochimiques ou encore d’utiliser des sondes nucléiques tels que décrit dans la norme NF EN ISO 7218. 8 FORMULES-TYPES Ces formules-types peuvent être ajustées de façon à obtenir des performances optimales. Salmonella Enrichissement (BK194, BM136, BM137 ou BM144), pour 1 litre de milieu : - Peptone ................................................................................................................... 10,00 g - Chlorure de sodium ................................................................................................... 5,00 g - Tampon phosphates ............................................................................................... 5,06 g ® IRIS Salmonella Supplément (1 comprimé) : - Système sélectif ......................................................................................................... 0,1 g - Colorant ................................................................................................................... 0,005 g ® IRIS Salmonella Supplément Liquide (flacon de 50 mL) : - Système sélectif ............................................................................................................ 2 g - Colorant ....................................................................................................................... 0,1 g ® IRIS Salmonella Agar, pour 1040 mL de gélose : - Peptone .................................................................................................................... 10,0 g - Extrait de levure .......................................................................... ................................5,0 g - Chlorure de sodium .................................................................................................... 5,0 g - Tampon phosphate ..................................................................................................... 7,0 g - Agents inhibiteurs ...................................................................................................... 10,2 g - Mélange chromogène ................................................................................................. 1,0 g - Agar agar bactériologique ....................................................................................... 16,0 g - Opacifiant .................................................................................................................. 30 mL pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,0 ± 0,2. Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – 60002 Beauvais Cedex – France Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr Page 4 sur 7 9 CONTROLE QUALITE Aspect du milieu en boîte : gélose blanche, opaque. Réponse culturale de croissance après 24 heures d’incubation à 37°C (XP CEN ISO/TS 11133) : Microorganismes Salmonella Typhimurium Salmonella Enteritidis Enterobacter aerogenes Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa 10 Croissance WDCM 00031 WDCM 00030 WDCM 00175 WDCM 00013 WDCM 00034 WDCM 00025 Bonne, colonies magenta Bonne, colonies magenta Bonne, colonies bleues Partiellement inhibée, colonies incolores Inhibée Inhibée CONSERVATION Salmonella Enrichissement : Milieu déshydraté : 2-30 °C. Milieu préparé en flacons ou en tubes : Se référer à la norme XP CEN ISO/TS 11133-1. Milieux prêts-à-l’emploi en flacons ou en poches : 2-25 °C. ® ® Supplément IRIS Salmonella Liquide, Supplément IRIS Salmonella Comprimés : 2-8 °C. ® IRIS Salmonella Agar : Milieu pré-coulé en boîtes de Petri (Ø 90 mm) : 2-8 °C. Kit CONFIRM’ Salmonella : 2-8 °C. Les dates de péremption sont mentionnées sur les étiquettes. 11 PRESENTATION Salmonella Enrichissement : Flacon de 500 g ................................................................................................................................................. Fût de 5 kg ......................................................................................................................................................... 10 flacons de 225 mL ......................................................................................................................................... 3 poches souples de 3 litres .............................................................................................................................. 2 poches souples de 5 litres .............................................................................................................................. BK194HA BK194GC BM13608 BM13708 BM14408 ® IRIS Salmonella Supplément : 10 flacons de 50 mL ............................................................................................................................................ BS07808 120 comprimés ................................................................................................................................................... BS07708 ® IRIS Salmonella Agar : 20 boîtes de Petri (Ø 90 mm) ............................................................................................................................. BM16008 120 boîtes de Petri (Ø 90 mm) .......................................................................................................................... BM16108 CONFIRM’ Salmonella : Kit d’agglutination au Latex ................................................................................................................................. BT01108 12 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES NF EN ISO 6579. Décembre 2002. Microbiologie des aliments - Méthode horizontale pour la Recherche des Salmonella spp.. Modifiée en Octobre 2007 par l’amendement A1 : annexe D : recherche de Salmonella spp. dans les matières fécales des animaux et dans des échantillons environnementaux au stade de la production primaire. NF EN ISO 16140. Octobre 2003. Microbiologie des aliments. Protocole pour la validation des méthodes alternatives. Modifiée en Octobre 2011 par l’amendement A1. NF EN ISO 7218. Octobre 2007. Microbiologie des Aliments. Exigences générales et recommandations. Modifiée en Décembre 2013 par l’amendement A1. Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – 60002 Beauvais Cedex – France Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr Page 5 sur 7 13 AUTRES INFORMATIONS ® IRIS Salmonella est une marque déposée de SOLABIA S.A.S. Les mentions portées sur les étiquettes sont prédominantes sur les formules ou les instructions décrites dans ce document. Elles sont susceptibles d’être modifiées à tout moment, sans préavis. Code document Date création Date de révision Motif de révision : : : : BM160/FR/2011-02 : 3. 02-2011 03-2014 Extension de validation. Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – 60002 Beauvais Cedex – France Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr Page 6 sur 7 ANNEXE 1 : SUPPORT PHOTO IRIS Salmonella® Agar Détection des Salmonelles Croissance obtenue après 24 heures d’incubation à 37 °C. Enterobacter spp. Aspect non caractéristique De couleur bleue Salmonella spp. Aspect caractéristique De couleur magenta Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – 60002 Beauvais Cedex – France Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr Page 7 sur 7 ">
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