Biokar diagnostics CONFIRM' L. mono Agar Manuel utilisateur

COMPASS® Listeria Agar
DOMAINE D’UTILISATION
COMPASS® Listeria Agar est un milieu sélectif utilisé pour les différenciation, isolement et
dénombrement de Listeria monocytogenes dans les produits alimentaires, les échantillons de
l’environnement et les prélèvements pathologiques d’origine animale, même fortement contaminés.
Sa formulation correspond à celles préconisées dans les protocoles de recherche et de
dénombrement des normes internationales EN ISO 11290-1 et 11290-2 incluant l’amendement A1.
COMPASS® Listeria Agar est également employé dans le cadre d’une méthode alternative rapide de
recherche de L. monocytogenes, dans les produits d’alimentation humaine et échantillons de
l’environnement, raccourcie à une seule étape préalable d’enrichissement sélectif : elle est
officiellement certifiée par AFNOR Certification, sous Attestation N° BKR 23/2-11/02, dont le terme de
validité est fixé au 28 novembre 2010.
COMPASS® Listeria Agar peut aussi être employé dans le cadre d’une méthode alternative rapide
de dénombrement de L. monocytogenes dans les produits d’alimentation humaine et échantillons de
l’environnement, par ensemencement d’une seule boîte en surface ou en profondeur : elle est
officiellement certifiée par AFNOR Certification, sous Attestation N° BKR 23/05-12/07, dont le terme
de validité est fixé au 4 décembre 2011.
HISTORIQUE
En 1991, MENGAUD et al. ont identifié une phospholipase C phosphatidyl-inositol spécifique (PIPLC) produite par les deux espèces de Listeria pathogènes, L. ivanovii et L. monocytogenes, seule
cette dernière l’étant pour l’Homme. Ils ont suggéré que cette enzyme pouvait constituer un facteur
de virulence. La même année, NOTERMANS et al. développèrent une méthode en double couche
pour détecter la PI-PLC en milieu gélosé à l’aide de L--phosphatidylinositol. Dans ces conditions, les
deux espèces de Listeria pathogènes forment des colonies entourées d’un halo opaque, alors que les
colonies des espèces non pathogènes n’en présentent pas. Par ailleurs, l’utilisation d’un substrat
chromogène, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside, permet de remplacer l’esculine qui
était utilisée dans les milieux Oxford et PALCAM. La présence d’esculinase (β-glucosidase) peut ainsi
être mise en évidence par la formation d’un précipité bleu sur la colonie. Le mélange sélectif contenu
dans le milieu, permet l’inhibition de la presque totalité des bactéries contaminantes.
En associant ces trois principes, COMPASS® Listeria Agar permet la mise en évidence de colonies
bleues entourées d’un halo opaque, bien typiques de Listeria monocytogenes.
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Biokar Diagnostics – Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 – F60002 Beauvais Cedex – France
Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 – www.biokar-diagnostics.fr
PRINCIPES
- Les peptones et les facteurs de croissance (extrait de levure, pyruvate de sodium et sulfate de
magnésium) favorisent la croissance de Listeria monocytogenes.
- L’extrait de levure est une source du complexe vitaminique B.
- Le chlorure de sodium maintient l’équilibre osmotique du milieu.
- Les Listeria hydrolysent le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside (ou X--glucoside). Le
produit résultant subit une dimérisation oxydative qui se traduit par la formation d’un précipité bleu
sur les colonies.
- Le phosphatidyl-inositol est utilisé comme substrat pour la détection de la phospholipase C de
Listeria monocytogenes. Lorsqu’il est dégradé, un précipité opaque apparaît autour des colonies.
- Le chlorure de lithium et le mélange sélectif constitué de plusieurs antibiotiques et d’un
antifongique assurent l’inhibition de la microflore secondaire.
PREPARATION DU MILIEU COMPLET A PARTIR DU DESHYDRATE (BK192) ET DE SES
SUPPLEMENTS (BS070 + BS071)
- Mettre en suspension 71,9 g de milieu de base déshydraté (BK192) dans 1 litre d’eau distillée ou
déminéralisée.
- Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps
nécessaire à sa dissolution.
- Répartir en flacons de 1 L.
- Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes
- Refroidir et maintenir à 44-47°C.
- Reprendre le lyophilisat du supplément sélectif (BS071) en y ajoutant aseptiquement 10 mL d’eau
distillée stérile.
- Dans le flacon de 1 L de milieu de base, ajouter stérilement d’abord les 10 mL de supplément
sélectif et ensuite les 30 mL de supplément d’enrichissement (BS070).
- Homogénéiser parfaitement après l’introduction de chaque supplément.
- Couler en boîtes de Petri stériles, ceci dans le cadre de l’utilisation de COMPASS® Listeria Agar
dans un protocole de recherche ou de dénombrement par ensemencement en surface.
- Faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert.
PREPARATION DU MILIEU COMPLET A PARTIR DU KIT BT008
-
-
Faire fondre le milieu de base (réactif R1 (BM12800) du kit BT008) pendant le minimum de temps
nécessaire à sa reliquéfaction totale.
Refroidir et maintenir à 44-47°C.
Reprendre le lyophilisat du supplément sélectif (réactif R2 (BS06700) du kit BT008) en y ajoutant
aseptiquement 2 mL d’eau distillée stérile.
Dans chaque flacon de 200 mL de milieu de base, ajouter stérilement d’abord 2 mL de
supplément sélectif et ensuite 6 mL de supplément d’enrichissement (réactif R3 (BS06800) du kit
BT008).
Homogénéiser parfaitement après l’introduction de chaque supplément.
Couler en boîtes de Petri stériles, ceci dans le cadre de l’utilisation de COMPASS® Listeria Agar
dans un protocole de recherche ou de dénombrement par ensemencement en surface.
Faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert.
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MODE D’EMPLOI (méthode alternative rapide de recherche)
- Préparer une suspension mère de l’échantillon à analyser dans un bouillon de Fraser-demi
[BK133 + (BS030 ou BS032) ou BK173 + (BS059 ou BS062) ou BM016 par exemple] en
respectant un rapport prise d’essai/milieu d’enrichissement de 1/10ème.
- Incuber la suspension mère à (30 ± 1)°C pendant (24 ± 2) heures.
- Déposer 100 µL de la culture obtenue sur une boîte de COMPASS® Listeria Agar préparée ou
pré-coulée (BM123 ou BM124) et réaliser un isolement à l’aide d’une anse bouclée ou d’une
pipette Pasteur.
- Incuber à (37 ± 1)°C pendant (24 ± 2) heures. Il est possible de prolonger l’incubation jusqu’à 48
heures.
NOTA 1 :
Lors de l'étude de validation, pour deux échantillons de produits laitiers, les halos sont apparus à 48
heures d'incubation
MODE D’EMPLOI (méthode alternative rapide de dénombrement)
- Préparer une suspension mère de l’échantillon à analyser dans de l’eau peptonée tamponnée
[BK018, BK131 ou BM010, BM056, BM057 par exemple].
- Incuber la suspension à (20 ± 2)°C pendant (60 ± 5) minutes.
- Transférer 0,1 mL de la suspension et, si nécessaire, de ses dilutions décimales successives à la
surface d’une seule boîte (par dilution) de COMPASS® Listeria Agar préparée ou pré-coulée
(BM123 ou BM124).
- Etaler l’inoculum en surface à l’aide d’un étaleur stérile.
- ou
- Transférer 1 mL de la suspension et, si nécessaire, de ses dilutions décimales successives dans
une seule boîte de Petri stérile (par dilution).
- Couler environ 15 mL de milieu complet.
- Homogénéiser parfaitement et laisser solidifier sur une surface froide.
- Incuber à (37 ± 1)°C pendant (24 ± 2) heures.
- En l’absence de colonies caractéristiques (c’est à dire absence de colonies ou colonies bleues
avec halos encore peu visibles à 24 heures), prolonger l’incubation de 24 heures
supplémentaires.
- L’expression des résultats se fera conformément aux recommandations établies dans la norme
ISO 7218 (août 2007).
NOTA 2 :
COMPASS® Listeria Agar s’inscrit également comme premier milieu d’isolement obligatoire du
protocole opératoire de recherche de L. monocytogenes tel que décrit dans le texte normatif EN ISO
11290-1/A1, ainsi que comme milieu unique du protocole opératoire de dénombrement de L.
monocytogenes selon l’EN ISO 11290-2/A1.
NOTA 3 :
Dans le cadre de la marque AFNOR VALIDATION, les prises d‘essai supérieures à 25 g n’ont pas été
testées.
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LECTURE
Les colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes apparaissent bleues à bleu vert et sont
entourées d’un halo opaque. Les autres espèces de Listeria forment des colonies bleues à bleu vert,
sans halo. Il est à noter que des souches de Listeria ivanovii peuvent présenter des colonies
caractéristiques, de tailles néanmoins plus réduites.
CONFIRMATION
Dans le cadre de la marque AFNOR VALIDATION, tous les résultats positifs doivent être confirmés
de la (l’une des) manière(s) suivante(s) :
Option 1 : Mise en œuvre des tests classiques décrits dans les méthodes normalisées par le
CEN ou l’ISO (en incluant l’étape de purification), en repartant des colonies
caractéristiques isolées sur COMPASS® Listeria Agar.
Pour les modalités de confirmation se reporter à la norme NF EN ISO 7218.
Option 2 : Mise en œuvre de CONFIRM’ L. mono Agar ®.
Option 3 : Utilisation de toute autre méthode certifiée AFNOR VALIDATION, de principe
différent. Le protocole validé de la seconde méthode devra être respecté dans son
ensemble, c’est à dire que toutes les étapes antérieures à l’étape intermédiaire de
laquelle on repart pour la confirmation doivent être communes aux deux méthodes.
Les deux méthodes validées (l’une utilisée en détection et l’autre en confirmation) doivent
donc avoir un tronc commun.
En cas de résultats discordants (positifs par la méthode alternative, non confirmés par l’une des
options décrites ci-dessus), le laboratoire devra mettre en œuvre les moyens suffisants pour
s’assurer de la validité du résultat rendu.
NOTA 4 :
Lorsque la présence de Listeria monocytogenes a déjà été confirmée lors de la recherche, il est
possible de s’affranchir de l’étape de confirmation à l’issue du dénombrement, en cas de résultat
positif.
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FORMULE – TYPE du milieu complet
(pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales)
Pour 1 litre de milieu :
- Peptone pepsique de viande .......................................................18,00 g
- Tryptone .........................................................................................6,00 g
- Extrait de levure ...........................................................................10,00 g
- Pyruvate de sodium .......................................................................2,00 g
- Glucose ..........................................................................................2,00 g
- Glycérophosphate de magnésium .................................................1,00 g
- Sulfate de magnésium anhydre .....................................................0,50 g
- Chlorure de sodium........................................................................5,00 g
- L--phosphatidyl-inositol................................................................2,00 g
- Hydrogénophosphate disodique anhydre ......................................2,50 g
- Chlorure de lithium .......................................................................10,00 g
- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucopyranoside...........................0,05 g
- Acide nalidixique ............................................................................0,02 g
- Ceftazidime ....................................................................................0,02 g
- Polymyxine B (sulfate) .............................................................. 76700 UI
- Cycloheximide................................................................................0,05 g
- Agar agar bactériologique ............................................................12,00 g
pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.
CONTRÔLE QUALITE
- Aspect, couleur milieu de base déshydraté : poudre beige, fluide et homogène.
- Aspect, couleur milieu préparé (complet) et prêt-à-l’emploi (complet): gélose ambrée, opalescente.
- Réponse culturale typique après 24-48 heures d’incubation à 37°C :
Croissance
Microorganismes
(Rapport de productivité :
PR)
Caractéristiques
colonies bleu vert
entourées d'un halo opaque
colonies bleu vert
entourées d'un halo opaque
Listeria monocytogenes
CIP 59.53
PR  50%
Listeria monocytogenes
CIP 78.31
PR  50%
Listeria innocua
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
®
ATCC 33090
ATCC 29212
ATCC 25922
Bonne, score 2
inhibée, score 0
inhibée, score 0
colonies bleu vert sans halo
STOCKAGE / CONSERVATION
Milieu de base déshydraté :
- Stocker entre 2 et 30°C, à l’abri de la lumière.
- La date de péremption est mentionnée sur l’étiquette
Milieu complet préparé en boîtes, avec suppléments : 15 jours à 2-8°C (à titre indicatif).
Milieu pré-coulé en boîtes de Petri et Kit, Supplément d’enrichissement et supplément sélectif
:
- Stocker entre 2 et 8°C, à l’abri de la lumière.
- La date de péremption est mentionnée sur l’étiquette.
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Code
PRESENTATION
Milieu de base déshydraté:
- Flacon de 500 g
BK192HA
Supplément d’enrichissement :
- Pack de 8 flacons pour 8 x 1 L de milieu de base
BS07008
Supplément sélectif :
- Coffret de 8 flacons pour 8 x 1 L de milieu de base
BS07108
Milieu pré-coulé en boîtes de Petri (Ø 90 mm) :
- Coffret de 20 boîtes
- Coffret de 120 boîtes
BM12308
BM12408
Kit :
- Coffret composé de 6 flacons de 200 mL de milieu de base (R1),
de 6 flacons qsp 200 mL de supplément sélectif lyophilisé (R2)
et de 6 flacons qsp 200 mL de supplément d’enrichissement liquide (R3)
BT00808
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SUPPORT PHOTO :
Référence : BK192HA + [BS07008 + BS07108], BM12308/12408, BT00808
Domaine d’utilisation : Recherche et dénombrement des Listeria monocytogenes.
Listeria monocytogenes
Colonie caractéristique
Couleur bleu-vert entourée
d’un halo opaque
Listeria sp.
Colonie non caractéristique
Si croissance, couleur bleuvert sans halo
COMPASS® Listeria Agar
Réf : BM12308
Incubation 24 heures à 37°C (surface)
Colonies caractéristiques bleu-vert entourées d’un halo opaque
(hydrolyse du X--glucoside et dégradation du L--phosphatidyl-inositol)
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
MENGAUD, J., BRAUN-BRETON, C., and COSSART, P.. 1991. Identification of phosphatidylinositol-specific phospholipase
C activity in Listeria monocytogenes: a novel type of virulence factor ? Molecular Microbiology, 5(2) : 367-372.
NOTERMANS, S.H., DUFRENNE, J., LEIMESTER-WÄCHTER, M., DOMANN, E., and CHAKRABORTY, T.. 1991.
Phosphatidylinositol-specific phospholipase C activity as a marker to distinguish between pathogenic and nonpathogenic
Listeria species. Applied and Environmental Microbiology, 57(9) : 2666-2670.
OTTAVIANI, F., OTTAVIANI, M., AGOSTI, M.. 1997. Esperienza su un agar selettivo e differenziale per Listeria
monocytogenes. Industrie Alimentari, 36 : 1-3
OTTAVIANI, F., OTTAVIANI, M., and AGOSTI, M.. 1997. Differential agar medium for Listeria monocytogenes. Quimper
Froid Symposium Proceedings p6. ADRIA Quimper France. 16-18 June 1997.
NF EN ISO 16140 (V 08-103). Octobre 2003. Microbiologie des aliments. Protocole pour la validation des méthodes
alternatives.
XP CEN ISO/TS 11133-2 (V 08-104-2). Janvier 2004. Microbiologie des aliments. Guide pour la préparation et la production
des milieux de culture. Partie 2 : Guide général pour les essais de performance des milieux de culture.
NF EN ISO 11290-1/A1 (V 08-028-1/A1). Février 2005. Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et
le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1 : Méthode de recherche - Amendement 1 : Modification des milieux
d’isolement, de la recherche de l’hémolyse et introduction de données de fidélité.
NF EN ISO 11290-2/A1 (V 08-028-2/A1). Février 2005. Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et
le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 2 : Méthode de dénombrement - Amendement 1 : Modification du
milieu d’isolement.
NF EN ISO 7218 (V 08-002). Octobre 2007. Microbiologie des Aliments. Exigences générales et recommandations.
NF V45-008. Mars 2009. Poissons transformés. Méthode pour le dénombrement de Listeria monocytogenes aux faibles
niveaux de contamination dans le saumon fumé et la truite fumée.
BKR 23/2-11/02 et BKR 23/05-12/07
METHODES ALTERNATIVES D’ANALYSE POUR L’AGROALIMENTAIRE
Certifié par AFNOR Certification
www.afnor-validation.org
COMPASS® et CONFIRM’ L. mono Agar® sont des marques de SOLABIA S.A.S.
Les mentions portées sur les étiquettes sont prédominantes sur les formules ou les instructions décrites dans ce document.
Les informations et les spécifications contenues dans cette fiche technique ont été établies à la date du 2009-06-08.
Elles sont susceptibles d’être modifiées à tout moment, sans préavis.
Code document : BM123/F/2007-05 : 6
8/8
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