Biokar diagnostics BK049HA Manuel utilisateur

FICHE TECHNIQUE
GELOSE AU CETRIMIDE
DETECTION ET DENOMBREMENT DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA
1
BK049HA
BM18408
DOMAINE D’UTILISATION
La gélose au cétrimide est un milieu sélectif destiné à l’isolement et au dénombrement de Pseudomonas aeruginosa
dans les produits biologiques d’origine animale, les produits pharmaceutiques et cosmétiques.
La gélose au cétrimide est conforme à la formule décrite dans les chapitres harmonisés de la Pharmacopée
européenne et américaine.
2
HISTORIQUE
La formule du milieu est dérivée de celle du milieu de King A qui favorise la production de pyocyanine par
Pseudomonas aeruginosa. En 1951, Lowbury préconisa l’utilisation de cétrimide dans un milieu sélectif pour
l’isolement des Pseudomonas. En raison de l’amélioration de la pureté de l’agent inhibiteur, sa concentration fut
réduite par Lowbury et Collins en 1955.
3
PRINCIPES
Le cétrimide (bromure de cétyl-triméthyl-ammonium), composé ammonium quaternaire, agit comme inhibiteur d’une
grande variété de germes, y compris les espèces de Pseudomonas autres que Pseudomonas aeruginosa.
La production de pyocyanine (pigment bleu, non fluorescent, soluble dans l’eau et le chloroforme) est stimulée en
présence de chlorure de magnésium et de sulfate de potassium.
Le milieu favorise également la production de pigments fluorescents (pyoverdines) par certaines souches de
Pseudomonas aeruginosa.
La plupart des Pseudomonas aeruginosa sont identifiables à leur odeur d’aminoacétophénone.
4
PREPARATION
Préparation du milieu déshydraté :
• Mettre en suspension 45,3 g de milieu déshydraté (BK049) dans 1 litre d’eau
distillée ou déminéralisée.
•
Ajouter 10 mL de glycérol.
 Reconstitution :
45,3 g/L
+ 10 mL de glycérol
•
Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir
durant le temps nécessaire à sa dissolution.
 Stérilisation :
15 min à 121 °C
•
Répartir en tubes ou en flacons.
•
Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
Préparation du milieu en boîtes de Petri :
• Faire fondre le milieu prêt-à-liquéfier (BM184) ou le milieu en flacon préparé à l’avance pendant le temps
minimum nécessaire à sa reliquéfaction.
•
Refroidir et maintenir le milieu à 44-47 °C.
•
Couler en boîtes de Petri stériles et laisser solidifier sur une surface froide.
•
Faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert.
Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 - 60002 Beauvais Cedex – France
Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 - www.biokar-diagnostics.fr
Page 1 sur 3
5
MODE D’EMPLOI
•
Après enrichissement, ensemencer l’inoculum en stries à l’aide d’une anse
stérile à la surface du milieu ainsi préparé.
•
Incuber à 30-35°C pendant 24 heures à 48 heures.
Note : Dans le cadre de la pharmacopée, incuber de 18 heures à 72 heures.
6
 Ensemencement :
En surface
 Incubation :
24 h à 48 h à 30-35 °C
LECTURE
Considérer comme suspectes :
• les colonies présentant une pigmentation caractéristique jaune à vert fluo et une fluorescence sous ultra-violets
à 254 nm,
• les colonies muqueuses, grisâtres, pigmentées ou non.
Les colonies isolées doivent subir les trois essais de confirmation suivants :
• recherche de l’oxydase par la technique de Kovacs (solution à 1% de chlorhydrate de tétra-méthyl-pphénylène-diamine),
• production de pyocyanine,
• Culture à 42 °C sur bouillon caséine-soja (BK046).
Un bacille à Gram négatif ayant cultivé sur gélose au cétrimide est considéré comme Pseudomonas aeruginosa
lorsqu’une colonie typique est caractérisée par les tests suivants :
• Oxydase : positive
• Pyocyanine : positive
• Culture à 42 °C : positive
Occasionnellement, des souches de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Providencia, Alcaligenes et
Aeromonas peuvent cultiver en provoquant un léger jaunissement du milieu. Cette coloration se distingue aisément
de la production de fluorescéine, car ce jaunissement ne fluoresce pas.
7
FORMULE-TYPE
Cette formule-type peut être ajustée de façon à obtenir des performances optimales.
Pour 1 litre de milieu (avec glycérol) :
- Peptone pancréatique de gélatine ............................................................................ 20,0 g
- Cétrimide ..................................................................................................................... 0,3 g
- Chlorure de magnésium .............................................................................................. 1,4 g
- Sulfate de potassium ................................................................................................. 10,0 g
- Agar agar bactériologique ......................................................................................... 13,6 g
- Glycérol .................................................................................................................. 10,0 mL
pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.
8
CONTROLE QUALITE
Milieu déshydraté : poudre blanc-crème, fluide et homogène.
Milieu préparé complet : gélose blanchâtre.
Réponse culturale typique après 48 heures d’incubation à 32,5 °C, inoculum ≤ 100 ufc (Pharmacopée européenne ;
NF EN ISO 22717) :
Microorganismes
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
WDCM 00026
WDCM 00024
WDCM 00025
WDCM 00013
WDCM 00034
Croissance théorique
(PR : Rapport de productivité)
PR ≥ 50 %
PR ≥ 50 %
PR ≥ 50 %
Inhibée
Inhibée
Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 - 60002 Beauvais Cedex – France
Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 - www.biokar-diagnostics.fr
Page 2 sur 3
9
CONSERVATION
Milieu déshydraté : 2-30 °C.
Milieu de base préparé en flacons : 6 mois à 2-8 °C (à titre indicatif)*.
Milieu complet préparé en boîtes, avec additif : 1 mois à 2-8 °C, à l’abri de la lumière (à titre indicatif)*.
Milieu en flacons : 2-8 °C.
La date de péremption est mentionnée sur l’étiquette.
10
PRESENTATION
Milieu prêt-à-liquéfier (avec glycérol) :
10 flacons de 100 mL........................................................................................................................................... BM18408
Milieu de base déshydraté :
Flacon de 500 g ................................................................................................................................................... BK049HA
11
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Lowbury, E.J.L., and Collins, A.G., 1955. The use of a new cetrimide product in a selective medium for Pseudomonas
aeruginosa., J. Clin. Pathol., 8: 47.
Brown, V.I., and Lowbury, E.J.L. 1965. Use of an improved Cetrimide Agar Medium and of culture methods for
Pseudomonas aeruginosa. J. Clin. Pathol.,18: 752.
Ministère de l’Agriculture. Commission XXX. Cosmétologie. Recherche de Pseudomonas aeruginosa dans les
produits cosmétiques.
NF EN ISO 22717 (T 75-603). Septembre 2009. Cosmétiques. Microbiologie. Recherche de Pseudomonas
aeruginosa.
United States Pharmacopeia. Microbial Limit Tests.
Pharmacopée européenne
microorganismes spécifiés.
12
2.6.13.
Contrôle
microbiologique
des
produits
non
stériles :
Recherche
de
AUTRES INFORMATIONS
* Valeur indicative obtenue dans les conditions standards du laboratoire et suivant les instructions du fabricant.
Les mentions portées sur les étiquettes sont prédominantes sur les formules ou les instructions décrites dans ce
document et sont susceptibles d’être modifiées à tout moment, sans préavis.
Code document
Date création
Date de révision
Motif de révision
:
:
:
:
BK049_BM184/FR/2003-01 : 6.
01-2003
10-2014
Révision générale (§ 4 : Préparation ; § 5 : Mode d’emploi ;
§ 7 : Formule-type ; § 8 : Contrôle qualité, § 10 : Présentation).
Rue des Quarante Mines – ZAC de Ther – Allonne – B.P. 10245 - 60002 Beauvais Cedex – France
Tél : + 33 (0)3 44 14 33 33 – Fax : + 33 (0)3 44 14 33 34 - www.biokar-diagnostics.fr
Page 3 sur 3
">