Novartis Kit de biotechnologie Manuel utilisateur

Editeurs
Novartis Pharma AG, CH-4002 Basel
Auteurs:
 Dr. Anja Messerschmitt
 Dr. Gesche Standke
 Dr. Christiane Röckl Michel
Illustrations:
 Fonds de l’industrie chimique, Francfort / Main
 Pharma Information, Bâle
 Dr. Marcus Baumann
Contact:
Novartis Pharma AG
Dr. Christiane Röckl Michel
Biotech Labor
WKL-122.2.26A
Postfach
CH-4002 Basel
Tel. 061/696 13 72
E-Mail: christiane.roeckl_michel
@novartis.com
Novartis Pharma AG
Dr. Gesche Standke
Biotech Labor
WKL-122.2.26A
Postfach
CH-4002 Basel
Tel. 061/696 13 72
E-Mail: [email protected]
Internet : www.novartis.ch/schullabor
Reproduction autorisée avec l’accord de l’éditeur et à condition d’indiquer les sources.
Copies destinées à l’usage scolaire souhaitées.
(Edition 2012; Stage au Biotech Labor)
Table des matières
Les bases .................................................................................................................................................... 5
Génie génétique .................................................................................................................................................... 5
Modèles d’organismes ........................................................................................................................................ 5
Bactéries, E.coli K12............................................................................................................................................ 6
Plasmides ................................................................................................................................................................ 6
Transformation ...................................................................................................................................................... 7
La résistance aux antibiotiques ........................................................................................................................ 7
Enzymes, enzymes de restriction .................................................................................................................... 7
Introduction aux travaux pratiques ...................................................................................................... 8
Matériel de laboratoire ........................................................................................................................................ 8
Glossaire spécialisé ............................................................................................................................................. 9
Mode d’emploi des micropipettes: ................................................................................................................ 10
Mode d’emploi de la centrifugeuse .............................................................................................................. 13
Expérience 1: Purification de l’ADN .................................................................................................. 14
Expérience 2: Caractérisation de l’ADN par analyse de restriction ......................................... 16
Expérience 3: Séparation et mise en évidence de fragments d’ADN par électrophorèse
sur gel ......................................................................................................................................................... 18
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3
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Expérimenter le génie génétique
Les chercheurs qui travaillent sur l’ADN ne sont généralement pas en mesure d’observer
directement la plupart de leurs expériences. En effet, la taille des macromolécules cellulaires
comme l’ADN ou les protéines est de l’ordre du nanomètre. Bien que le fil d’ADN dans une
cellule humaine atteindrait une longueur de près de 2 mètres, la molécule n’est pas visible au
microscope en raison de son petit diamètre de 1,1 nanomètres.
Afin de rendre visible l’ADN, il faut des millions voire des milliards de copies de la molécule.
Pour ce faire, des séquences plus courtes d’ADN sont intégrées dans des molécules d’ADN
circulaires appelées plasmides, qui se multiplient au sein des cellules des bactéries, indépendamment du cycle de la cellule. Lorsqu’on multiplie les bactéries, on obtient en peu de
temps le nombre de copies d’ADN souhaitées (amplification).
Des ADN différents (appartenant à des espèces différentes ou à des individus différents au
sein d’une même espèce par ex.) se différencient par leur séquence de nucléotides. Là aussi, les différences dans la séquence de bases ne pouvant s’observer directement sur la molécule, on peut en rendre compte indirectement par l’emploi d’enzymes de restriction (analyse de restriction).
Le but du cours consiste à différencier divers ADN par analyse de restriction. Vous travaillerez avec des cellules de bactéries qui contiennent soit les plasmides pGEM1, pUC18 ou
pBluescript. La première expérience consiste à isoler l’ADN de plasmide par analyse de restriction. Au cours de la seconde expérience vous « découperez » cet ADN de plasmide à
l’aide d’un enzyme de restriction afin de séparer au moyen de l’électrophorèse sur gel, au
cours de la troisième expérience, les morceaux d’ADN ainsi obtenus. A la fin du cours, vous
devriez être en mesure de déterminer quel est l’ADN de plasmide que votre groupe aura
analysé.
Vous allez réaliser pendant le cours des expériences avec des quantités très petites. Cela
demande un travail très précis et très concentré.
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Les bases
Génie génétique
Le génie génétique permet d’isoler des gènes du matériel
héréditaire et d’analyser les informations contenues dans
les gènes. Grâce au génie génétique, des gènes supplémentaires peuvent être introduits dans le matériel génétique
d’un être vivant, ou il est possible de modifier ou d’éliminer
des gènes de ce même matériel génétique. Cela permet
d’obtenir des micro-organismes, des plantes et des animaux possédant des propriétés déterminées. La nouveauté
du génie génétique réside dans les échanges de gènes
même entre différentes espèces. Ainsi, par exemple, le
gène d’une bactérie peut être activé dans une plante.
Le génie génétique est un domaine particulier de la biotechnologie moderne. Les premières expériences en génie
génétique ont été effectuées en Amérique en 1973.
Modèles d’organismes
En principe, chaque cellule peut servir de source d’ADN et
chaque organisme peut être modifié génétiquement. Mais dans la recherche, on n’utilise que
certaines espèces du monde des micro-organismes, des plantes et des animaux. Les modèles particulièrement prisés sont les bactéries Escherichia coli (abréviation E.coli) pour les
micro-organismes, l’Arabidopsis Thaliana pour les plantes le poisson-zèbre pour le monde
animal.
La cellule : le plus petit
élément constitutif du vivant.
(transparents du Fonds de
l’industrie chimique, Francfort/Main,;
Biotechnologie/Gentechnik,
1996)
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Bactéries, E.coli K12
Dans le cours nous utilisons la souche de bactérie E.coli K12. Les bactéries sont constituées
d’une seule cellule et peuvent contenir de l’ADN de plasmide en plus de leur ADN génomique (voir illustration: La cellule). E coli est une bactérie typique de la flore intestinale humaine. La souche de laboratoire utilisée depuis environ 50 ans, E. coli K-12, en raison de
différents défauts génétiques, ne provoque aucune maladie chez l’homme et ne colonise pas
la flore intestinale de manière durable. Dans les bonnes conditions de laboratoire ces bactéries se cultivent et se multiplient facilement. Ainsi elles remplissent deux critères importants
pour un modèle d’organismes. E. coli K-12 fait partie des organismes les mieux étudiés et les
mieux caractérisés dans le domaine de la biologie moléculaire, et actuellement, il est souvent
utilisé comme organisme-hôte fiable, dans la fabrication de protéines recombinantes.
Plasmides
Les plasmides sont des petites molécules d’ADN en forme d’anneau. On ne les trouve que
dans les bactéries où ils servent de réservoir supplémentaire d’information génétique. Toutes
les bactéries ne possèdent pas de plasmide. L’ADN de plasmide se multiplie indépendamment du chromosome de la bactérie et est, pendant la division de la cellule, distribué entre
les cellules filles. L’information génétique sur les plasmides peut donc très facilement être
modifiée, remplacée ou rajoutée. On peut alors observer les conséquences de ces modifications sur une bactérie qui ne possédait avant pas d’ADN de plasmide. Cette méthode
s’appelle la transformation des bactéries.
Les plasmides pGEM1, pUC18 et pBluescript qu’on utilise dans le cours, sont des molécules
d’ADN synthétique, fabriquées pour être employées dans la recherche. On appelle ces
plasmides de laboratoire des vecteurs, car ils servent de molécules de transport pour les
fragments d’ADN modifiés qui doivent être introduits dans des cellules. Les vecteurs pGEM1,
pUC18 et pBluescript ont des fonctions très importantes telles que : 1. La capacité de se
multiplier dans la cellule de la bactérie indépendamment du cycle de la cellule (origin of replication). 2. La capacité de se multiplier abondamment pour atteindre environ une centaine de
copies par cellule. 3. Contenir un gène de résistance aux antibiotiques permettant de sélectionner les bactéries transformées de celles qui ne le sont pas.
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Transformation
Comme, en principe, l’introduction d’ADN de plasmide pur dans des bactéries se révèle très
inefficace, les cellules bactériennes doivent être soumises à un traitement spécifique préalable. Ainsi, elles sont soumises à diverses solutions salines qui rendent leurs parois cellulaires poreuses et, jusqu’à un certain degré, perméables à l’ADN de plasmide. Les bactéries
ainsi traitées sont appelées „bactéries compétentes“. Lorsqu’on incube les bactéries compétentes avec de l’ADN de plasmide dans certaines conditions, une partie d’entre elles va incorporer l’ADN de plasmide. Afin de reconnaître ces bactéries, on les sélectionne en fonction
d’une caractéristique qu’elles ont acquise par l’incorporation d’ADN.
Bactérie sensible à l’ampicilline
Traitement par une solution saline
Bactérie compétente
ADN de plasmide
Bactérie transformée, résistante à l’ampicilline
Quand un plasmide génétiquement modifié est introduit dans une bactérie, la bactérie devient un organisme génétiquement modifié (OGM). La production et le maniement des OGM
sont strictement réglementés par la loi.
La résistance aux antibiotiques
Les plasmides pGEM1, pUC18 et pBluescript portent comme marqueur sélectif le gène de
l’enzyme -lactamase, responsable de la résistance à l’ampicilline. Chez l’humain, la résistance à l’ampicilline peut être contrée par l’ajout d’acide clavulanique qui agit comme inhibiteur de l’enzyme -lactamase. Le gène d’ampicilline peut donc être classé comme un risque
mineur.
Enzymes, enzymes de restriction
Les enzymes sont des protéines capables de catalyser des réactions chimiques (transformation métabolique). Les enzymes de restriction sont des endonucléases, qui n’hydrolysent,
donc «découpent» les liaisons désoxyribose-phosphore ester de la double chaine de l’ADN
lorsqu’elles reconnaissent une séquence spécifique de l’ADN. C’est pour cette raison que les
enzymes de restriction sont également appelés plus simplement gènes-ciseaux. Dans ce
cours, l’enzyme de restriction utilisé est le Nci1
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Introduction aux travaux pratiques
Matériel de laboratoire
1.5mL
2mL
11
Eprouvettes Eppendorf
Rack (portoir)
Centrifugeuse
Cuve à électrophorèse
Pointes de pipettes
Thermo-bloc
Générateur
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8
Micropipettes
Mélangeur Vortex
UV Transilluminator
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Glossaire spécialisé
Incuber
Conserver dans certaines conditions
Liquide de culture
milieu nutritif liquide dans lequel on réalise des cultures cellulaires.
Pipeter
Adjonction d’un volume de liquide défini à l’aide d’une pipette
Sédiment
Eléments d’un liquide récoltés par centrifugation (cf. surnageant)
Sélectionner
Rechercher, en fonction de critères particuliers
Surnageant
Liquide qui, après centrifugation, se trouve au-dessus du sédiment (cf. sédiment).
Suspendre
Répartir des éléments solides dans une solution
Suspension
Liquide contenant des éléments solides, répartis de manière
uniforme
TA
Température ambiante (env. 22°C)
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9
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Mode d’emploi des micropipettes:
Remarques générales:
 Ne réglez jamais une pipette à un volume pour lequel elle n’a pas été conçue! (Ne pas
forcer son mécanisme en le tournant!)
 Ne plongez jamais une pipette dépourvue de pointe dans une solution!
 N’utilisez jamais la même pointe de pipette pour différentes solutions!
Pipettes pour quatre catégories de volumes de référence:
0.5-10 l (Pipettes marquées de blanc)
 utiliser des pointes de pipettes blanches
2-20 l (Pipettes marquées de rouge)
 utiliser des pointes de pipettes jaunes
20-200 l (Pipettes marquées de jaune)  utiliser des pointes de pipettes jaunes
100-1000 l (Pipettes marquées de bleu)  utiliser des pointes de pipettes bleues
A
A: Bouton
B: Bouton d’éjection
B
C: Bague de réglage
C
D: Tige
E: Ejecteur de tige
D
E
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10
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Réglage du volume:
Le volume à pipeter est réglé à l’aide de la bague de réglage noir, cannelée (C). Le volume
réglé apparait sur le voyant à trois chiffres que l’on lit de haut en bas.
La signification des chiffres rouges ou noirs est expliquée ci-après au moyen d’exemples:
Pipettes 0.5-10 l et 2-20 µl:
chiffres rouges en bas = 1/10 µl
0
1
7
2
5
Pipette 20-200 µl:
que des chiffres noirs = µl
Pipette 100-1000 µl:
chiffres rouges en haut = ml
rouge
5
7.5 µl
12.5 µl
0
1
7
2
5
5
75 µl
125 µl
0
rouge
1
7
0
5
0
0.75 ml
1 ml
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Comment pipeter:
1. Placez la pointe de pipette correcte sur la tige de la pipette.
Attention: Ne jamais aspirer de liquide avec une micropipette sans pointe!
2. Presser le bouton (A) jusqu’à la première butée, avant de plonger la pointe dans le liquide
destiné à être aspiré.
3. Plonger la pointe verticalement dans le liquide et relâcher lentement la pression sur le
bouton (le liquide est aspiré). Attendre deux à trois secondes, puis retirer la pointe de la
pipette du liquide.
4. Placer la pointe de la pipette contre la paroi du second récipient en position oblique et
presser lentement le bouton jusqu’à la première butée. Le liquide est ainsi expulsé.
5. Ensuite, presser le bouton jusqu’à la seconde butée. L’air contenu ainsi comprimé expulse
alors l’éventuel liquide résiduel hors de la pointe. Retirer la pipette du récipient tout en
maintenant le bouton enfoncé et ne relâcher le bouton qu’une fois l’opération effectuée.
L’élimination de la pointe utilisée a lieu en pressant le bouton d’éjection (B)
2
3
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4
12
5
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Mode d’emploi de la centrifugeuse
Cet appareil permet de centrifuger des éprouvettes Eppendorf de 1,5 ml et 2 ml.
1. Ouvrez le couvercle de la centrifugeuse en appuyant sur le bouton « open ».
2. Répartissez les éprouvettes de manière symétrique dans le rotor.
Attention: Il faut toujours placer des éprouvettes de poids environ équivalent les unes en
face des autres dans le rotor, afin d’éviter tout déséquilibre lors de la centrifugation.
3. Mettez le couvercle du rotor et refermez le couvercle de la centrifugeuse.
4. Ajustez la durée de la centrifugation avec les boutons « ▼ » et « ▲ ». Maintenez la vitesse au maximum (13'400 rpm).
5. Actionnez la centrifugeuse en appuyant sur « start ».
6. Lorsque la centrifugation est terminée, le couvercle se déverrouille automatiquement.
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Expérience 1: Purification de l’ADN
Méthode:
Lorsque des bactéries transformées avec de l’ADN de plasmide sont multipliées dans un
milieu BL contenant un antibiotique (temps de doublement env. 30 minutes), l’ADN de plasmide qui y a été introduit se multiplie également. Dans l’expérience 1, la culture de bactéries
mise à votre disposition a été imprégnée par l’un des trois plasmides suivants : pGEM1,
PBluescript ou pUC18. Afin de pouvoir identifier « votre » plasmide à l’aide de l’analyse de
restriction, il vous faudra, dans un premier temps, l’isoler de la culture de bactéries.
Chromosome bactérien
Membrane cellulaire intacte
ADN de plasmide
Paroi cellulaire poreuse
Bactérie
Précipitation en ethanol
Sphéroblaste
Centrifugeuse
Lysat de bactéries avec
ADN de plasmide
Cellule bactérienne
fragmentée
Matériel:
Micropipette 100-1000 µl
Micropipette 5-50 µl
Micropipette 1-10 µl
Pointes de pipettes bleues, jaunes, blanches
Eprouvettes Eppendorf 2ml
Eprouvettes Eppendorf 1.5 ml
Mélangeur Vortex
Centrifugeuse
Rack
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Culture de bactéries liquide (4ml)
Tampon pour lyse
Solution de lysozyme
Solution de glycogène
Tampon TE
Ethanol 98%
Sachet pour déchets
Flacon pour déchet
Bain de glace
14
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Marche à suivre:
1. Pipetez 2ml de la culture de bactéries liquide dans une éprouvette Eppendorf de 2ml et
centrifugez-la pendant 2 minutes.
2. Eliminez soigneusement le surnageant, en le pipetant dans le flacon pour déchets.
3. Répétez les points 1 et 2 avec le reste de la culture de bactéries liquide (2 ml). Pipetez
dans la même éprouvette de 2ml qui contient les bactéries sédimentées de la première
centrifugation. (L’objectif consiste à obtenir toutes les bactéries de la culture liquide sous
forme de sédiment dans l’éprouvette Eppendorf de 2ml.)
4. Mettez en suspension les bactéries sédimentées avec 250l de tampon pour lyse sur le
mélangeur vortex.
5. Incubez la suspension 5 minutes sur de la glace.
6. Ajoutez 25l de solution au lysozyme à la suspension de bactéries.
7. Réchauffez l’échantillon 5 minutes à 95°C.
8. Centrifugez l’échantillon 10 minutes.
9. Pipetez le surnageant soigneusement dans un nouveau tube à 1.5ml.
10. Ajoutez au surnageant 1l de solution au glycogène.
11. Ajoutez-y 500l d’éthanol glacé (98%), mélangez bien l’échantillon et placez-le 10 minutes sur de la glace.
12. Centrifugez l’échantillon 10 minutes.
13. Éliminez entièrement le surnageant (pipetez le surnageant dans le flacon pour déchets!).
Attention: Le sédiment d’ADN est très petit et donc difficilement visible!!
14. Laissez le tube avec le sédiment d’ADN ouvert env. 5-10 minutes à TA (l’éthanol
s’évapore).
15. Le sédiment d’ADN est dissout dans 30l de tampon TE par aspiration et expulsion de la
pipette. Tâchez d'éviter la formation de mousse.
Evaluation:
Env. 16 l sont utilisés pour une analyse de restriction, tel que décrit dans l’expérience 2.
Déchets:
Les déchets solides issus de cette expérience doivent être collectés dans un sachet prévu à
cet effet et les déchets liquides doivent être collectés dans le flacon pour déchets.
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15
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Expérience 2: Caractérisation de l’ADN par analyse de restriction
Méthode:
Certaines enzymes sont capables de reconnaître certaines séquences spécifiques de nucléotides (suite de caractères) sur l’ADN et de découper l’ADN à ces endroits. Ces enzymes
proviennent de bactéries et sont appelées enzymes de restriction. Leur disponibilité représente une condition de base à l’élaboration de l’ADN.
Dans cette expérience, le plasmide (pGEM1, pBluescript ou pUC18, séquences de nucléotides page 22) obtenu au cours de l’expérience 1 (est découpé par l’enzyme de restriction
Nci1 (digestion). La séquence reconnue par cette enzyme de restriction est : CC(G/C)GG.
Enzyme de restriction Nci1
Matériel:
Eprouvette Eppendorf blanche de 1.5ml
Eprouvette Eppendorf rouge de 1.5ml
Eau double-distillée
Tampon de restriction
Enzyme de restriction Nci1 (-20°C)
ADN de plasmide issu de l’exp. 1
Bain de glace
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Sachet pour déchets
Rack
Thermo-bloc 37°C
Centrifugeuse
Micropipette 1-10 µl
Micropipette 5-50 µl
Pointes de pipettes blanches et
jaunes
16
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Marche à suivre:
1. Inscrivez votre nom sur les couvercles de chaque éprouvette Eppendorf blanche et rouge.
2. Pipetez d’après le schéma suivant:
Pipetez l’enzyme de restriction dans l’éprouvette rouge en dernier lieu, après avoir brièvement centrifugé les deux éprouvettes..
Eprouvette rouge
Eprouvette blanche
10 l
ADN de plasmide de l’exp. 1
2.5 l
eau double-distillée
7.5l
eau double-distillée
1.5l
tampon de restriction
1.5L
tampon de restriction
1 l
enzyme de restriction Nci1
6l
ADN de plasmide de l’exp. 1
3. Fermez les éprouvettes, centrifugez 1 minute et incubez les échantillons pendant 45-90
minutes à 37°.
Quelle est l’action du tampon de restriction ?
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Qu’est-ce qui sert de substrat (serrure) à l’enzyme (clé) dans cette analyse de restriction ?
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Pourquoi n’ajoute-t-on l’enzyme de restriction qu’à la fin ?
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Pourquoi utilise-t-on des échantillons sans enzyme de restriction?
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Evaluation:
La digestion par enzyme de restriction est analysée dans l’expérience 3.
Déchets:
Les déchets issus de cette expérience doivent être collectés dans un sachet prévu à cet
effet.
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Expérience 3: Séparation et mise en évidence de fragments
d’ADN par électrophorèse sur gel
Méthode:
Dans l’expérience 2 vous avez découpé de l’ADN de plasmide à l’aide d’une enzyme de restriction (digestion). Dans l’expérience suivante, les morceaux d’ADN ainsi obtenus (fragments) vont être séparés d’après leur taille. Cette séparation a lieu dans un champ électrique. L’ADN a une charge négative et migre donc vers le pôle positif du champ électrique.
Lors de l’électrophorèse sur gel, les fragments d’ADN sont amenés à traverser un gel
d’Agarose dans le champ électrique, que l’on peut comparer à une série de « grillages ».
Plus les fragments d’ADN sont petits, plus ils migrent avec facilité à travers ce « grillage ».
Au cours du même laps de temps, les petits fragments d’ADN traversent donc, une distance
plus longue que les fragments d’ADN de plus grande taille. Les fragments de taille identique
s’agglomèrent en bandes épaisses dans le gel.
Après cette séparation par électrophorèse, les fragments d’ADN doivent être rendus visibles
dans le gel. Un colorant fluorescent a été ajouté au gel, qui rend les bandes d’ADN visibles
sous la lumière UV directement après l’électrophorèse.
On obtient alors un motif de bande caractéristique. Si le nombre et la taille des fragments a
été déterminée théoriquement à l’aide de la carte de plasmide (voir page 20), on peut comparer celle-ci avec le motif de bande apparaissant sur le gel et ainsi identifier le plasmide.
Matériel:
Eprouvette Eppendorf blanche de l’expérience 2
Eprouvette Eppendorf rouge de l’expérience 2
Tampon de charge
Marqueur de poids moléculaire pour ADN
Générateur
Cuve à électrophorèse avec gel d’Agarose
Sachets pour déchets
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Lampe à UV
Rack
Micropipette 5-50 µl
Micropipette 1-10 µl
Pointes de pipettes jaunes
et blanches
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Marche à suivre:
1. Pipetez dans chacune des éprouvettes Eppendorf blanche et rouge, 2l de tampon de
charge.
Attention: le tampon de charge est très visqueux. Il est donc très difficile d’effectuer un
pipetage exact. Pipetez donc lentement.
Pourquoi faut-il ajouter du tampon de charge dans les échantillons?
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2. Centrifugez brièvement les échantillons.
3. Ecoutez l’explication du principe de fonctionnement de l’appareil à électrophorèse. La
responsable du cours pipette 8l du marqueur de poids moléculaire d’ADN dans la première poche (puits).
4. Pipetez lentement 15l d’un échantillon dans l’un des puits (= poche) du gel. Il faut veiller
à ce que la pointe de la pipette ne traverse pas le puits. Lors du pipetage, tenez la pipette à la verticale au-dessus de la poche.
5. Répétez ce processus avec tous les échantillons. Pour chaque échantillon, utilisez une
poche vide.
6. L’électrophorèse dure env. 60 minutes à 140V/120mA.
Attention: Seul le responsable du cours utilise les appareils!
7. Quand l’électrophorèse est terminée, la responsable du cours, portant des gants, ôte
soigneusement le support d’agarose de la cuve à électrophorèse. Le gel est évalué sous
la lampe UV.
Attention: La lumière UV peut endommager les yeux! Fermez toujours l’écran protecteur
avant d’enclencher l’appareil!
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Evaluation:
Pour chacun des trois plasmides utilisés, pGEM1, pBluescript et pUC18, la séquence
d’identification spécifique reconnue de Nci1 est présente plusieurs fois. Les positions de
cette séquence de reconnaissance sont indiquées ci-dessous dans les trois cartes de plasmides. Elles permettent de calculer la taille des fragments d’ADN.
Séquence de reconnaissance de l’enzyme de restriction Nci1: CC(G/C)GG
GG(C/G)CC
NciI (2203)
NciI (2238)
NciI (2460)
NciI (1702)
NciI (2663)
Ampr
pGEM1
MCS
2865 bp
NciI (1351)
lacZ
NciI (41 / 42)
unvollständig
ori
NciI (655)
NciI (2581)
lacZ
Ampr
pBluescript SK
2958 bp
NciI (659)
MCS
NciI (715 /716)
NciI (2230)
ori
NciI (1534)
NciI (49)
NciI (84)
NciI (2234)
Ampr
lacZ
pUC18
2686 bp
MCS
NciI (436 / 437)
NciI (1883)
ori
NciI (1187)
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20
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Marqueur pGEM 1 pBS
pUC18
rouge blanc rouge blanc rouge blanc
2176 bp
1766 bp
1230 bp
1033 bp
653 bp
517bp
453 bp
394 bp
289 bp
234/220 bp
154 bp
Calculez le nombre et la taille des fragments attendus pour tous les trois plasmides en utilisant les cartes de plasmides de la page 20.
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Marquez ce résultat théorique sur la photo du gel (page 19). A l’aide du marqueur on peut
estimer la position des bandes pour les fragments calculés.
Quel résultat obtiendra-t-on pour l’essai avec le plasmide non-fragmenté. Marquez également votre proposition sur la photo du gel.
Comparez le nombre et la position des fragments visibles sur le gel avec le résultat théorique
sur votre dessin. Lequel des trois plasmides a été isolé par votre groupe ?
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21
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Pourquoi ne voit-on pas tous les fragments produits par la digestion de restriction sur le gel ?
Dans quelle mesure l’analyse des fragments par électrophorèse sur gel est limitée.
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Séquence de pGEM1 (5’3’)
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
gaatacaagc
tctccctata
gcgcggggag
tgcgctcggt
tatccacaga
ccaggaaccg
agcatcacaa
accaggcgtt
ccggatacct
gtaggtatct
ccgttcagcc
gacacgactt
taggcggtgc
tatttggtat
gatccggcaa
cgcgcagaaa
agtggaacga
cctagatcct
cttggtctga
ttcgttcatc
taccatctgg
tatcagcaat
ccgcctccat
atagtttgcg
gtatggcttc
tgtgcaaaaa
cagtgttatc
taagatgctt
ggcgaccgag
ctttaaaagt
cgctgttgag
ttactttcac
gaataagggc
gcatttatca
aacaaatagg
ttattatcat
gtttcggtga
gtctgtaagc
ggtgtcgggg
tcgacgctct
gttgagcacc
ggccacgggg
agcccgatct
gccggtgatg
gattggttcg
gtccaaccaa
agccagatgc
acataacctt
ttgggctgca
gtgagtcgta
aggcggtttg
cgttcggctg
atcaggggat
taaaaaggcc
aaatcgacgc
tccccctgga
gtccgccttt
cagttcggtg
cgaccgctgc
atcgccactg
tacagagttc
ctgcgctctg
acaaaccacc
aaaaggatct
aaactcacgt
tttaaattaa
cagttaccaa
catagttgcc
ccccagtgct
aaaccagcca
ccagtctatt
caacgttgtt
attcagctcc
agcggttagc
actcatggtt
ttctgtgact
ttgctcttgc
gctcatcatt
atccagttcg
cagcgtttct
gacacggaaa
gggttattgt
ggttccgcgc
gacattaacc
tgacggtgaa
ggatgccggg
ctggcttaac
cccttatgcg
gccgccgcaa
cctgccacca
tccccatcgg
ccggccacga
ctgaccattt
accgactctg
tacacaatta
atgtatcata
ggtcgactct
ttaatttcga
cgtattgggc
cggcgagcgg
aacgcaggaa
gcgttgctgg
tcaagtcaga
agctccctcg
ctcccttcgg
taggtcgttc
gccttatccg
gcagcagcca
ttgaagtggt
ctgaagccag
gctggtagcg
caagaagatc
taagggattt
aaatgaagtt
tgcttaatca
tgactccccg
gcaatgatac
gccggaaggg
aattgttgcc
gccattgcta
ggttcccaac
tccttcggtc
atggcagcac
ggtgagtact
ccggcgtcaa
ggaaaacgtt
atgtaaccca
gggtgagcaa
tgttgaatac
ctcatgagcg
acatttcccc
tataaaaata
aacctctgac
agcagacaag
tatgcggcat
actcctgcat
ggaatggtgc
tacccacgcc
tgatgtcggc
tgcgtccggc
ccggggtgcg
acggcagttt
ggcttgtaca
cacatacgat
agaggatccc
taagccagct
gctcttccgc
tatcagctca
agaacatgtg
cgtttttcca
ggtggcgaaa
tgcgctctcc
gaagcgtggc
gctccaagct
gtaactatcg
ctggtaacag
ggcctaacta
ttaccttcgg
gtggtttttt
ctttgatctt
tggtcatgag
ttaaatcaat
gtgaggcacc
tcgtgtagat
cgcgagaccc
ccgagcgcag
gggaagctag
caggcatcgt
gatcaaggcg
ctccgatcgt
tgcataattc
caaccaagtc
tacgggataa
cttcggggcg
ctcgtgcacc
aaacaggaag
tcatactctt
gatacatatt
gaaaagtgcc
ggcgtatcac
acatgcagct
cccgtcaggg
cagagcagat
taggaagcag
atgcaaggag
gaaacaagcg
gatataggcg
gtagaggatc
gaacggcgtt
acgagagaga
tattgtcgtt
ttaggtgaca
cgggcgagct
gcattaatga
ttcctcgctc
ctcaaaggcg
agcaaaaggc
taggctccgc
cccgacagga
tgttccgacc
gctttctcat
gggctgtgtg
tcttgagtcc
gattagcaga
cggctacact
aaaaagagtt
tgtttgcaag
ttctacgggg
attatcaaaa
ctaaagtata
tatctcagcg
aactacgata
acgctcaccg
aagtggtcct
agtaagtagt
ggtgtcacgc
agttacatga
tgtcagaagt
tcttactgtc
attctgagaa
taccgcgcca
aaaactctca
caactgatct
gcaaaatgcc
cctttttcaa
tgaatgtatt
acctgacgtc
gaggcccttt
cccggagacg
cgcgtcagcg
tgtactgaga
cccagtagta
atggcgccca
ctcatgagcc
ccagcaaccg
tggctagcga
accagaaact
tgatagggtc
agaacgcggc
ctata
cgaattccgg
atcggccaac
actgactcgc
gtaatacggt
cagcaaaagg
ccccctgacg
ctataaagat
ctgccgctta
agctcacgct
cacgaacccc
aacccggtaa
gcgaggtatg
agaaggacag
ggtagctctt
cagcagatta
tctgacgctc
aggatcttca
tatgagtaaa
atctgtctat
cgggagggct
gctccagatt
gcaactttat
tcgccagtta
tcgtcgtttg
tcccccatgt
aagttggccg
atgccatccg
tagtgtatgc
catagcagaa
aggatcttac
tcagcatctt
gcaaaaaagg
tattattgaa
tagaaaaata
taagaaacca
cgtctcgcgc
gtcacagctt
ggtgttggcg
gtgcaccata
ggttgaggcc
acagtccccc
cgaagtggcg
cacctgtggc
tgaccctgct
cagaaggttc
tgcttcagta
tacaattaat
Combien de séquences de reconnaissance pouvez-vous trouver dans la première ligne ?
__________________________________________________________________________
______________________________________
22
____________________________________
Sequence de pBluescript (5‘ 3‘)
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
2581
2641
2701
2761
2821
2881
2941
cacctaaatt
ctcatttttt
cgagataggg
ctccaacgtc
accctaatca
gagcccccga
gaaagcgaaa
caccacaccc
gcgcaactgt
agggggatgt
ttgtaaaacg
gccccccctc
atccactagt
gagggttaat
atccgctcac
cctaatgagt
gaaacctgtc
gtattgggcg
ggcgagcggt
acgcaggaaa
cgttgctggc
caagtcagag
gctccctcgt
tcccttcggg
aggtcgttcg
ccttatccgg
cagcagccac
tgaagtggtg
tgaagccagt
ctggtagcgg
aagaagatcc
aagggatttt
aatgaagttt
gcttaatcag
gactccccgt
caatgatacc
ccggaagggc
attgttgccg
ccattgctac
gttcccaacg
ccttcggtcc
tggcagcact
gtgagtactc
cggcgtcaat
gaaaacgttc
tgtaacccac
ggtgagcaaa
gttgaatact
tcatgagcgg
catttccccg
gtaagcgtta
aaccaatagg
ttgagtgttg
aaagggcgaa
agttttttgg
tttagagctt
ggagcgggcg
gccgcgctta
tgggaagggc
gctgcaaggc
acggccagtg
gaggtcgacg
tctagagcgg
ttcgagcttg
aattccacac
gagctaactc
gtgccagctg
ctcttccgct
atcagctcac
gaacatgtga
gtttttccat
gtggcgaaac
gcgctctcct
aagcgtggcg
ctccaagctg
taactatcgt
tggtaacagg
gcctaactac
taccttcgga
tggttttttt
tttgatcttt
ggtcatgaga
taaatcaatc
tgaggcacct
cgtgtagata
gcgagaccca
cgagcgcaga
ggaagctaga
aggcatcgtg
atcaaggcga
tccgatcgtt
gcataattct
aaccaagtca
acgggataat
ttcggggcga
tcgtgcaccc
aacaggaagg
catactcttc
atacatattt
aaaagtgc
atattttgtt
ccgaaatcgg
ttccagtttg
aaaccgtcta
ggtcgaggtg
gacggggaaa
ctagggcgct
atgcgccgct
gatcggtgcg
gattaagttg
aattgtaata
gtatcgataa
ccgccaccgc
gcgtaatcat
aacatacgag
acattaattg
cattaatgaa
tcctcgctca
tcaaaggcgg
gcaaaaggcc
aggctccgcc
ccgacaggac
gttccgaccc
ctttctcata
ggctgtgtgc
cttgagtcca
attagcagag
ggctacacta
aaaagagttg
gtttgcaagc
tctacggggt
ttatcaaaaa
taaagtatat
atctcagcga
actacgatac
cgctcaccgg
agtggtcctg
gtaagtagtt
gtgtcacgct
gttacatgat
gtcagaagta
cttactgtca
ttctgagaat
accgcgccac
aaactctcaa
aactgatctt
caaaatgccg
ctttttcaat
gaatgtattt
______________________________________
23
aaaattcgcg
caaaatccct
gaacaagagt
tcagggcgat
ccgtaaagca
gccggcgaac
ggcaagtgta
acagggcgcg
ggcctcttcg
ggtaacgcca
cgactcacta
gcttgatatc
ggtggagctc
ggtcatagct
ccggaagcat
cgttgcgctc
tcggccaacg
ctgactcgct
taatacggtt
agcaaaaggc
cccctgacga
tataaagata
tgccgcttac
gctcacgctg
acgaaccccc
acccggtaag
cgaggtatgt
gaaggacagt
gtagctcttg
agcagattac
ctgacgctca
ggatcttcac
atgagtaaac
tctgtctatt
gggagggctt
ctccagattt
caactttatc
cgccagttaa
cgtcgtttgg
cccccatgtt
agttggccgc
tgccatccgt
agtgtatgcg
atagcagaac
ggatcttacc
cagcatcttt
caaaaaaggg
attattgaag
agaaaaataa
ttaaattttt
tataaatcaa
ccactattaa
ggcccactac
ctaaatcgga
gtggcgagaa
gcggtcacgc
tcccattcgc
ctattacgcc
gggttttccc
tagggcgaat
gaattcctgc
cagcttttgt
gtttcctgtg
aaagtgtaaa
actgcccgct
cgcggggaga
gcgctcggtc
atccacagaa
caggaaccgt
gcatcacaaa
ccaggcgttt
cggatacctg
taggtatctc
cgttcagccc
acacgactta
aggcggtgct
atttggtatc
atccggcaaa
gcgcagaaaa
gtggaacgaa
ctagatcctt
ttggtctgac
tcgttcatcc
accatctggc
atcagcaata
cgcctccatc
tagtttgcgc
tatggcttca
gtgcaaaaaa
agtgttatca
aagatgcttt
gcgaccgagt
tttaaaagtg
gctgttgaga
tactttcacc
aataagggcg
catttatcag
acaaataggg
gttaaatcag
aagaatagac
agaacgtgga
gtgaaccatc
accctaaagg
aggaagggaa
tgcgcgtaac
cattcaggct
agctggcgaa
agtcacgacg
tgggtaccgg
agcccggggg
tccctttagt
tgaaattgtt
gcctggggtg
ttccagtcgg
ggcggtttgc
gttcggctgc
tcaggggata
aaaaaggccg
aatcgacgct
ccccctggaa
tccgcctttc
agttcggtgt
gaccgctgcg
tcgccactgg
acagagttct
tgcgctctgc
caaaccaccg
aaaggatctc
aactcacgtt
ttaaattaaa
agttaccaat
atagttgcct
cccagtgctg
aaccagccag
cagtctatta
aacgttgttg
ttcagctccg
gcggttagct
ctcatggtta
tctgtgactg
tgctcttgcc
ctcatcattg
tccagttcga
agcgtttctg
acacggaaat
ggttattgtc
gttccgcgca
____________________________________
Sequence de pUC18 (5‘ 3‘)
tcgcgcgttt
cagcttgtct
ttggcgggtg
accatatgcg
attcgccatt
tacgccagct
tttcccagtc
actctagagg
gtgtgaaatt
aaagcctggg
gctttccagt
agaggcggtt
gtcgttcggc
gaatcagggg
cgtaaaaagg
aaaaatcgac
tttccccctg
ctgtccgcct
ctcagttcgg
cccgaccgct
ttatcgccac
gctacagagt
atctgcgctc
aaacaaacca
aaaaaaggat
gaaaactcac
cttttaaatt
gacagttacc
tccatagttg
ggccccagtg
ataaaccagc
atccagtcta
cgcaacgttg
tcattcagct
aaagcggtta
tcactcatgg
ttttctgtga
agttgctctt
gtgctcatca
agatccagtt
accagcgttt
gcgacacgga
cagggttatt
ggggttccgc
atgacattaa
cggtgatgac
gtaagcggat
tcggggctgg
gtgtgaaata
caggctgcgc
ggcgaaaggg
acgacgttgt
atccccgggt
gttatccgct
gtgcctaatg
cgggaaacct
tgcgtattgg
tgcggcgagc
ataacgcagg
ccgcgttgct
gctcaagtca
gaagctccct
ttctcccttc
tgtaggtcgt
gcgccttatc
tggcagcagc
tcttgaagtg
tgctgaagcc
ccgctggtag
ctcaagaaga
gttaagggat
aaaaatgaag
aatgcttaat
cctgactccc
ctgcaatgat
cagccggaag
ttaattgttg
ttgccattgc
ccggttccca
gctccttcgg
ttatggcagc
ctggtgagta
gcccggcgtc
ttggaaaacg
cgatgtaacc
ctgggtgagc
aatgttgaat
gtctcatgag
gcacatttcc
cctataaaaa
ggtgaaaacc
gccgggagca
cttaactatg
ccgcacagat
aactgttggg
ggatgtgctg
aaaacgacgg
accgagctcg
cacaattcca
agtgagctaa
gtcgtgccag
gcgctcttcc
ggtatcagct
aaagaacatg
ggcgtttttc
gaggtggcga
cgtgcgctct
gggaagcgtg
tcgctccaag
cggtaactat
cactggtaac
gtggcctaac
agttaccttc
cggtggtttt
tcctttgatc
tttggtcatg
ttttaaatca
cagtgaggca
cgtcgtgtag
accgcgagac
ggccgagcgc
ccgggaagct
tacaggcatc
acgatcaagg
tcctccgatc
actgcataat
ctcaaccaag
aatacgggat
ttcttcgggg
cactcgtgca
aaaaacagga
actcatactc
cggatacata
ccgaaaagtg
taggcgtatc
______________________________________
tctgacacat
gacaagcccg
cggcatcaga
gcgtaaggag
aagggcgatc
caaggcgatt
ccagtgccaa
aattcgtaat
cacaacatac
ctcacattaa
ctgcattaat
gcttcctcgc
cactcaaagg
tgagcaaaag
cataggctcc
aacccgacag
cctgttccga
gcgctttctc
ctgggctgtg
cgtcttgagt
aggattagca
tacggctaca
ggaaaaagag
tttgtttgca
ttttctacgg
agattatcaa
atctaaagta
cctatctcag
ataactacga
ccacgctcac
agaagtggtc
agagtaagta
gtggtgtcac
cgagttacat
gttgtcagaa
tctcttactg
tcattctgag
aataccgcgc
cgaaaactct
cccaactgat
aggcaaaatg
ttcctttttc
tttgaatgta
ccacctgacg
acgaggccct
24
gcagctcccg
tcagggcgcg
gcagattgta
aaaataccgc
ggtgcgggcc
aagttgggta
gcttgcatgc
catggtcata
gagccggaag
ttgcgttgcg
gaatcggcca
tcactgactc
cggtaatacg
gccagcaaaa
gcccccctga
gactataaag
ccctgccgct
atagctcacg
tgcacgaacc
ccaacccggt
gagcgaggta
ctagaaggac
ttggtagctc
agcagcagat
ggtctgacgc
aaaggatctt
tatatgagta
cgatctgtct
tacgggaggg
cggctccaga
ctgcaacttt
gttcgccagt
gctcgtcgtt
gatcccccat
gtaagttggc
tcatgccatc
aatagtgtat
cacatagcag
caaggatctt
cttcagcatc
ccgcaaaaaa
aatattattg
tttagaaaaa
tctaagaaac
ttcgtc
gagacggtca
tcagcgggtg
ctgagagtgc
atcaggcgcc
tcttcgctat
acgccagggt
ctgcaggtcg
gctgtttcct
cataaagtgt
ctcactgccc
acgcgcgggg
gctgcgctcg
gttatccaca
ggccaggaac
cgagcatcac
ataccaggcg
taccggatac
ctgtaggtat
ccccgttcag
aagacacgac
tgtaggcggt
agtatttggt
ttgatccggc
tacgcgcaga
tcagtggaac
cacctagatc
aacttggtct
atttcgttca
cttaccatct
tttatcagca
atccgcctcc
taatagtttg
tggtatggct
gttgtgcaaa
cgcagtgtta
cgtaagatgc
gcggcgaccg
aactttaaaa
accgctgttg
ttttactttc
gggaataagg
aagcatttat
taaacaaata
cattattatc
____________________________________
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2686
">