Editeurs Novartis Pharma AG, CH-4002 Basel Auteurs: Dr. Anja Messerschmitt Dr. Gesche Standke Dr. Christiane Röckl Michel Illustrations: Fonds de l’industrie chimique, Francfort / Main Pharma Information, Bâle Dr. Marcus Baumann Contact: Novartis Pharma AG Dr. Christiane Röckl Michel Biotech Labor WKL-122.2.26A Postfach CH-4002 Basel Tel. 061/696 13 72 E-Mail: christiane.roeckl_michel @novartis.com Novartis Pharma AG Dr. Gesche Standke Biotech Labor WKL-122.2.26A Postfach CH-4002 Basel Tel. 061/696 13 72 E-Mail: [email protected] Internet : www.novartis.ch/schullabor Reproduction autorisée avec l’accord de l’éditeur et à condition d’indiquer les sources. Copies destinées à l’usage scolaire souhaitées. (Edition 2012; Stage au Biotech Labor) Table des matières Les bases .................................................................................................................................................... 5 Génie génétique .................................................................................................................................................... 5 Modèles d’organismes ........................................................................................................................................ 5 Bactéries, E.coli K12............................................................................................................................................ 6 Plasmides ................................................................................................................................................................ 6 Transformation ...................................................................................................................................................... 7 La résistance aux antibiotiques ........................................................................................................................ 7 Enzymes, enzymes de restriction .................................................................................................................... 7 Introduction aux travaux pratiques ...................................................................................................... 8 Matériel de laboratoire ........................................................................................................................................ 8 Glossaire spécialisé ............................................................................................................................................. 9 Mode d’emploi des micropipettes: ................................................................................................................ 10 Mode d’emploi de la centrifugeuse .............................................................................................................. 13 Expérience 1: Purification de l’ADN .................................................................................................. 14 Expérience 2: Caractérisation de l’ADN par analyse de restriction ......................................... 16 Expérience 3: Séparation et mise en évidence de fragments d’ADN par électrophorèse sur gel ......................................................................................................................................................... 18 ______________________________________ 3 ____________________________________ Expérimenter le génie génétique Les chercheurs qui travaillent sur l’ADN ne sont généralement pas en mesure d’observer directement la plupart de leurs expériences. En effet, la taille des macromolécules cellulaires comme l’ADN ou les protéines est de l’ordre du nanomètre. Bien que le fil d’ADN dans une cellule humaine atteindrait une longueur de près de 2 mètres, la molécule n’est pas visible au microscope en raison de son petit diamètre de 1,1 nanomètres. Afin de rendre visible l’ADN, il faut des millions voire des milliards de copies de la molécule. Pour ce faire, des séquences plus courtes d’ADN sont intégrées dans des molécules d’ADN circulaires appelées plasmides, qui se multiplient au sein des cellules des bactéries, indépendamment du cycle de la cellule. Lorsqu’on multiplie les bactéries, on obtient en peu de temps le nombre de copies d’ADN souhaitées (amplification). Des ADN différents (appartenant à des espèces différentes ou à des individus différents au sein d’une même espèce par ex.) se différencient par leur séquence de nucléotides. Là aussi, les différences dans la séquence de bases ne pouvant s’observer directement sur la molécule, on peut en rendre compte indirectement par l’emploi d’enzymes de restriction (analyse de restriction). Le but du cours consiste à différencier divers ADN par analyse de restriction. Vous travaillerez avec des cellules de bactéries qui contiennent soit les plasmides pGEM1, pUC18 ou pBluescript. La première expérience consiste à isoler l’ADN de plasmide par analyse de restriction. Au cours de la seconde expérience vous « découperez » cet ADN de plasmide à l’aide d’un enzyme de restriction afin de séparer au moyen de l’électrophorèse sur gel, au cours de la troisième expérience, les morceaux d’ADN ainsi obtenus. A la fin du cours, vous devriez être en mesure de déterminer quel est l’ADN de plasmide que votre groupe aura analysé. Vous allez réaliser pendant le cours des expériences avec des quantités très petites. Cela demande un travail très précis et très concentré. ______________________________________ 4 ____________________________________ Les bases Génie génétique Le génie génétique permet d’isoler des gènes du matériel héréditaire et d’analyser les informations contenues dans les gènes. Grâce au génie génétique, des gènes supplémentaires peuvent être introduits dans le matériel génétique d’un être vivant, ou il est possible de modifier ou d’éliminer des gènes de ce même matériel génétique. Cela permet d’obtenir des micro-organismes, des plantes et des animaux possédant des propriétés déterminées. La nouveauté du génie génétique réside dans les échanges de gènes même entre différentes espèces. Ainsi, par exemple, le gène d’une bactérie peut être activé dans une plante. Le génie génétique est un domaine particulier de la biotechnologie moderne. Les premières expériences en génie génétique ont été effectuées en Amérique en 1973. Modèles d’organismes En principe, chaque cellule peut servir de source d’ADN et chaque organisme peut être modifié génétiquement. Mais dans la recherche, on n’utilise que certaines espèces du monde des micro-organismes, des plantes et des animaux. Les modèles particulièrement prisés sont les bactéries Escherichia coli (abréviation E.coli) pour les micro-organismes, l’Arabidopsis Thaliana pour les plantes le poisson-zèbre pour le monde animal. La cellule : le plus petit élément constitutif du vivant. (transparents du Fonds de l’industrie chimique, Francfort/Main,; Biotechnologie/Gentechnik, 1996) ______________________________________ 5 ____________________________________ Bactéries, E.coli K12 Dans le cours nous utilisons la souche de bactérie E.coli K12. Les bactéries sont constituées d’une seule cellule et peuvent contenir de l’ADN de plasmide en plus de leur ADN génomique (voir illustration: La cellule). E coli est une bactérie typique de la flore intestinale humaine. La souche de laboratoire utilisée depuis environ 50 ans, E. coli K-12, en raison de différents défauts génétiques, ne provoque aucune maladie chez l’homme et ne colonise pas la flore intestinale de manière durable. Dans les bonnes conditions de laboratoire ces bactéries se cultivent et se multiplient facilement. Ainsi elles remplissent deux critères importants pour un modèle d’organismes. E. coli K-12 fait partie des organismes les mieux étudiés et les mieux caractérisés dans le domaine de la biologie moléculaire, et actuellement, il est souvent utilisé comme organisme-hôte fiable, dans la fabrication de protéines recombinantes. Plasmides Les plasmides sont des petites molécules d’ADN en forme d’anneau. On ne les trouve que dans les bactéries où ils servent de réservoir supplémentaire d’information génétique. Toutes les bactéries ne possèdent pas de plasmide. L’ADN de plasmide se multiplie indépendamment du chromosome de la bactérie et est, pendant la division de la cellule, distribué entre les cellules filles. L’information génétique sur les plasmides peut donc très facilement être modifiée, remplacée ou rajoutée. On peut alors observer les conséquences de ces modifications sur une bactérie qui ne possédait avant pas d’ADN de plasmide. Cette méthode s’appelle la transformation des bactéries. Les plasmides pGEM1, pUC18 et pBluescript qu’on utilise dans le cours, sont des molécules d’ADN synthétique, fabriquées pour être employées dans la recherche. On appelle ces plasmides de laboratoire des vecteurs, car ils servent de molécules de transport pour les fragments d’ADN modifiés qui doivent être introduits dans des cellules. Les vecteurs pGEM1, pUC18 et pBluescript ont des fonctions très importantes telles que : 1. La capacité de se multiplier dans la cellule de la bactérie indépendamment du cycle de la cellule (origin of replication). 2. La capacité de se multiplier abondamment pour atteindre environ une centaine de copies par cellule. 3. Contenir un gène de résistance aux antibiotiques permettant de sélectionner les bactéries transformées de celles qui ne le sont pas. ______________________________________ 6 ____________________________________ Transformation Comme, en principe, l’introduction d’ADN de plasmide pur dans des bactéries se révèle très inefficace, les cellules bactériennes doivent être soumises à un traitement spécifique préalable. Ainsi, elles sont soumises à diverses solutions salines qui rendent leurs parois cellulaires poreuses et, jusqu’à un certain degré, perméables à l’ADN de plasmide. Les bactéries ainsi traitées sont appelées „bactéries compétentes“. Lorsqu’on incube les bactéries compétentes avec de l’ADN de plasmide dans certaines conditions, une partie d’entre elles va incorporer l’ADN de plasmide. Afin de reconnaître ces bactéries, on les sélectionne en fonction d’une caractéristique qu’elles ont acquise par l’incorporation d’ADN. Bactérie sensible à l’ampicilline Traitement par une solution saline Bactérie compétente ADN de plasmide Bactérie transformée, résistante à l’ampicilline Quand un plasmide génétiquement modifié est introduit dans une bactérie, la bactérie devient un organisme génétiquement modifié (OGM). La production et le maniement des OGM sont strictement réglementés par la loi. La résistance aux antibiotiques Les plasmides pGEM1, pUC18 et pBluescript portent comme marqueur sélectif le gène de l’enzyme -lactamase, responsable de la résistance à l’ampicilline. Chez l’humain, la résistance à l’ampicilline peut être contrée par l’ajout d’acide clavulanique qui agit comme inhibiteur de l’enzyme -lactamase. Le gène d’ampicilline peut donc être classé comme un risque mineur. Enzymes, enzymes de restriction Les enzymes sont des protéines capables de catalyser des réactions chimiques (transformation métabolique). Les enzymes de restriction sont des endonucléases, qui n’hydrolysent, donc «découpent» les liaisons désoxyribose-phosphore ester de la double chaine de l’ADN lorsqu’elles reconnaissent une séquence spécifique de l’ADN. C’est pour cette raison que les enzymes de restriction sont également appelés plus simplement gènes-ciseaux. Dans ce cours, l’enzyme de restriction utilisé est le Nci1 ______________________________________ 7 ____________________________________ Introduction aux travaux pratiques Matériel de laboratoire 1.5mL 2mL 11 Eprouvettes Eppendorf Rack (portoir) Centrifugeuse Cuve à électrophorèse Pointes de pipettes Thermo-bloc Générateur ______________________________________ 8 Micropipettes Mélangeur Vortex UV Transilluminator ____________________________________ Glossaire spécialisé Incuber Conserver dans certaines conditions Liquide de culture milieu nutritif liquide dans lequel on réalise des cultures cellulaires. Pipeter Adjonction d’un volume de liquide défini à l’aide d’une pipette Sédiment Eléments d’un liquide récoltés par centrifugation (cf. surnageant) Sélectionner Rechercher, en fonction de critères particuliers Surnageant Liquide qui, après centrifugation, se trouve au-dessus du sédiment (cf. sédiment). Suspendre Répartir des éléments solides dans une solution Suspension Liquide contenant des éléments solides, répartis de manière uniforme TA Température ambiante (env. 22°C) ______________________________________ 9 ____________________________________ Mode d’emploi des micropipettes: Remarques générales: Ne réglez jamais une pipette à un volume pour lequel elle n’a pas été conçue! (Ne pas forcer son mécanisme en le tournant!) Ne plongez jamais une pipette dépourvue de pointe dans une solution! N’utilisez jamais la même pointe de pipette pour différentes solutions! Pipettes pour quatre catégories de volumes de référence: 0.5-10 l (Pipettes marquées de blanc) utiliser des pointes de pipettes blanches 2-20 l (Pipettes marquées de rouge) utiliser des pointes de pipettes jaunes 20-200 l (Pipettes marquées de jaune) utiliser des pointes de pipettes jaunes 100-1000 l (Pipettes marquées de bleu) utiliser des pointes de pipettes bleues A A: Bouton B: Bouton d’éjection B C: Bague de réglage C D: Tige E: Ejecteur de tige D E ______________________________________ 10 ____________________________________ Réglage du volume: Le volume à pipeter est réglé à l’aide de la bague de réglage noir, cannelée (C). Le volume réglé apparait sur le voyant à trois chiffres que l’on lit de haut en bas. La signification des chiffres rouges ou noirs est expliquée ci-après au moyen d’exemples: Pipettes 0.5-10 l et 2-20 µl: chiffres rouges en bas = 1/10 µl 0 1 7 2 5 Pipette 20-200 µl: que des chiffres noirs = µl Pipette 100-1000 µl: chiffres rouges en haut = ml rouge 5 7.5 µl 12.5 µl 0 1 7 2 5 5 75 µl 125 µl 0 rouge 1 7 0 5 0 0.75 ml 1 ml ______________________________________ 11 ____________________________________ Comment pipeter: 1. Placez la pointe de pipette correcte sur la tige de la pipette. Attention: Ne jamais aspirer de liquide avec une micropipette sans pointe! 2. Presser le bouton (A) jusqu’à la première butée, avant de plonger la pointe dans le liquide destiné à être aspiré. 3. Plonger la pointe verticalement dans le liquide et relâcher lentement la pression sur le bouton (le liquide est aspiré). Attendre deux à trois secondes, puis retirer la pointe de la pipette du liquide. 4. Placer la pointe de la pipette contre la paroi du second récipient en position oblique et presser lentement le bouton jusqu’à la première butée. Le liquide est ainsi expulsé. 5. Ensuite, presser le bouton jusqu’à la seconde butée. L’air contenu ainsi comprimé expulse alors l’éventuel liquide résiduel hors de la pointe. Retirer la pipette du récipient tout en maintenant le bouton enfoncé et ne relâcher le bouton qu’une fois l’opération effectuée. L’élimination de la pointe utilisée a lieu en pressant le bouton d’éjection (B) 2 3 ______________________________________ 4 12 5 ____________________________________ Mode d’emploi de la centrifugeuse Cet appareil permet de centrifuger des éprouvettes Eppendorf de 1,5 ml et 2 ml. 1. Ouvrez le couvercle de la centrifugeuse en appuyant sur le bouton « open ». 2. Répartissez les éprouvettes de manière symétrique dans le rotor. Attention: Il faut toujours placer des éprouvettes de poids environ équivalent les unes en face des autres dans le rotor, afin d’éviter tout déséquilibre lors de la centrifugation. 3. Mettez le couvercle du rotor et refermez le couvercle de la centrifugeuse. 4. Ajustez la durée de la centrifugation avec les boutons « ▼ » et « ▲ ». Maintenez la vitesse au maximum (13'400 rpm). 5. Actionnez la centrifugeuse en appuyant sur « start ». 6. Lorsque la centrifugation est terminée, le couvercle se déverrouille automatiquement. ______________________________________ 13 ____________________________________ Expérience 1: Purification de l’ADN Méthode: Lorsque des bactéries transformées avec de l’ADN de plasmide sont multipliées dans un milieu BL contenant un antibiotique (temps de doublement env. 30 minutes), l’ADN de plasmide qui y a été introduit se multiplie également. Dans l’expérience 1, la culture de bactéries mise à votre disposition a été imprégnée par l’un des trois plasmides suivants : pGEM1, PBluescript ou pUC18. Afin de pouvoir identifier « votre » plasmide à l’aide de l’analyse de restriction, il vous faudra, dans un premier temps, l’isoler de la culture de bactéries. Chromosome bactérien Membrane cellulaire intacte ADN de plasmide Paroi cellulaire poreuse Bactérie Précipitation en ethanol Sphéroblaste Centrifugeuse Lysat de bactéries avec ADN de plasmide Cellule bactérienne fragmentée Matériel: Micropipette 100-1000 µl Micropipette 5-50 µl Micropipette 1-10 µl Pointes de pipettes bleues, jaunes, blanches Eprouvettes Eppendorf 2ml Eprouvettes Eppendorf 1.5 ml Mélangeur Vortex Centrifugeuse Rack ______________________________________ Culture de bactéries liquide (4ml) Tampon pour lyse Solution de lysozyme Solution de glycogène Tampon TE Ethanol 98% Sachet pour déchets Flacon pour déchet Bain de glace 14 ____________________________________ Marche à suivre: 1. Pipetez 2ml de la culture de bactéries liquide dans une éprouvette Eppendorf de 2ml et centrifugez-la pendant 2 minutes. 2. Eliminez soigneusement le surnageant, en le pipetant dans le flacon pour déchets. 3. Répétez les points 1 et 2 avec le reste de la culture de bactéries liquide (2 ml). Pipetez dans la même éprouvette de 2ml qui contient les bactéries sédimentées de la première centrifugation. (L’objectif consiste à obtenir toutes les bactéries de la culture liquide sous forme de sédiment dans l’éprouvette Eppendorf de 2ml.) 4. Mettez en suspension les bactéries sédimentées avec 250l de tampon pour lyse sur le mélangeur vortex. 5. Incubez la suspension 5 minutes sur de la glace. 6. Ajoutez 25l de solution au lysozyme à la suspension de bactéries. 7. Réchauffez l’échantillon 5 minutes à 95°C. 8. Centrifugez l’échantillon 10 minutes. 9. Pipetez le surnageant soigneusement dans un nouveau tube à 1.5ml. 10. Ajoutez au surnageant 1l de solution au glycogène. 11. Ajoutez-y 500l d’éthanol glacé (98%), mélangez bien l’échantillon et placez-le 10 minutes sur de la glace. 12. Centrifugez l’échantillon 10 minutes. 13. Éliminez entièrement le surnageant (pipetez le surnageant dans le flacon pour déchets!). Attention: Le sédiment d’ADN est très petit et donc difficilement visible!! 14. Laissez le tube avec le sédiment d’ADN ouvert env. 5-10 minutes à TA (l’éthanol s’évapore). 15. Le sédiment d’ADN est dissout dans 30l de tampon TE par aspiration et expulsion de la pipette. Tâchez d'éviter la formation de mousse. Evaluation: Env. 16 l sont utilisés pour une analyse de restriction, tel que décrit dans l’expérience 2. Déchets: Les déchets solides issus de cette expérience doivent être collectés dans un sachet prévu à cet effet et les déchets liquides doivent être collectés dans le flacon pour déchets. ______________________________________ 15 ____________________________________ Expérience 2: Caractérisation de l’ADN par analyse de restriction Méthode: Certaines enzymes sont capables de reconnaître certaines séquences spécifiques de nucléotides (suite de caractères) sur l’ADN et de découper l’ADN à ces endroits. Ces enzymes proviennent de bactéries et sont appelées enzymes de restriction. Leur disponibilité représente une condition de base à l’élaboration de l’ADN. Dans cette expérience, le plasmide (pGEM1, pBluescript ou pUC18, séquences de nucléotides page 22) obtenu au cours de l’expérience 1 (est découpé par l’enzyme de restriction Nci1 (digestion). La séquence reconnue par cette enzyme de restriction est : CC(G/C)GG. Enzyme de restriction Nci1 Matériel: Eprouvette Eppendorf blanche de 1.5ml Eprouvette Eppendorf rouge de 1.5ml Eau double-distillée Tampon de restriction Enzyme de restriction Nci1 (-20°C) ADN de plasmide issu de l’exp. 1 Bain de glace ______________________________________ Sachet pour déchets Rack Thermo-bloc 37°C Centrifugeuse Micropipette 1-10 µl Micropipette 5-50 µl Pointes de pipettes blanches et jaunes 16 ____________________________________ Marche à suivre: 1. Inscrivez votre nom sur les couvercles de chaque éprouvette Eppendorf blanche et rouge. 2. Pipetez d’après le schéma suivant: Pipetez l’enzyme de restriction dans l’éprouvette rouge en dernier lieu, après avoir brièvement centrifugé les deux éprouvettes.. Eprouvette rouge Eprouvette blanche 10 l ADN de plasmide de l’exp. 1 2.5 l eau double-distillée 7.5l eau double-distillée 1.5l tampon de restriction 1.5L tampon de restriction 1 l enzyme de restriction Nci1 6l ADN de plasmide de l’exp. 1 3. Fermez les éprouvettes, centrifugez 1 minute et incubez les échantillons pendant 45-90 minutes à 37°. Quelle est l’action du tampon de restriction ? __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ Qu’est-ce qui sert de substrat (serrure) à l’enzyme (clé) dans cette analyse de restriction ? __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ Pourquoi n’ajoute-t-on l’enzyme de restriction qu’à la fin ? __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ Pourquoi utilise-t-on des échantillons sans enzyme de restriction? __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ Evaluation: La digestion par enzyme de restriction est analysée dans l’expérience 3. Déchets: Les déchets issus de cette expérience doivent être collectés dans un sachet prévu à cet effet. ______________________________________ 17 ____________________________________ Expérience 3: Séparation et mise en évidence de fragments d’ADN par électrophorèse sur gel Méthode: Dans l’expérience 2 vous avez découpé de l’ADN de plasmide à l’aide d’une enzyme de restriction (digestion). Dans l’expérience suivante, les morceaux d’ADN ainsi obtenus (fragments) vont être séparés d’après leur taille. Cette séparation a lieu dans un champ électrique. L’ADN a une charge négative et migre donc vers le pôle positif du champ électrique. Lors de l’électrophorèse sur gel, les fragments d’ADN sont amenés à traverser un gel d’Agarose dans le champ électrique, que l’on peut comparer à une série de « grillages ». Plus les fragments d’ADN sont petits, plus ils migrent avec facilité à travers ce « grillage ». Au cours du même laps de temps, les petits fragments d’ADN traversent donc, une distance plus longue que les fragments d’ADN de plus grande taille. Les fragments de taille identique s’agglomèrent en bandes épaisses dans le gel. Après cette séparation par électrophorèse, les fragments d’ADN doivent être rendus visibles dans le gel. Un colorant fluorescent a été ajouté au gel, qui rend les bandes d’ADN visibles sous la lumière UV directement après l’électrophorèse. On obtient alors un motif de bande caractéristique. Si le nombre et la taille des fragments a été déterminée théoriquement à l’aide de la carte de plasmide (voir page 20), on peut comparer celle-ci avec le motif de bande apparaissant sur le gel et ainsi identifier le plasmide. Matériel: Eprouvette Eppendorf blanche de l’expérience 2 Eprouvette Eppendorf rouge de l’expérience 2 Tampon de charge Marqueur de poids moléculaire pour ADN Générateur Cuve à électrophorèse avec gel d’Agarose Sachets pour déchets ______________________________________ 18 Lampe à UV Rack Micropipette 5-50 µl Micropipette 1-10 µl Pointes de pipettes jaunes et blanches ____________________________________ Marche à suivre: 1. Pipetez dans chacune des éprouvettes Eppendorf blanche et rouge, 2l de tampon de charge. Attention: le tampon de charge est très visqueux. Il est donc très difficile d’effectuer un pipetage exact. Pipetez donc lentement. Pourquoi faut-il ajouter du tampon de charge dans les échantillons? ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 2. Centrifugez brièvement les échantillons. 3. Ecoutez l’explication du principe de fonctionnement de l’appareil à électrophorèse. La responsable du cours pipette 8l du marqueur de poids moléculaire d’ADN dans la première poche (puits). 4. Pipetez lentement 15l d’un échantillon dans l’un des puits (= poche) du gel. Il faut veiller à ce que la pointe de la pipette ne traverse pas le puits. Lors du pipetage, tenez la pipette à la verticale au-dessus de la poche. 5. Répétez ce processus avec tous les échantillons. Pour chaque échantillon, utilisez une poche vide. 6. L’électrophorèse dure env. 60 minutes à 140V/120mA. Attention: Seul le responsable du cours utilise les appareils! 7. Quand l’électrophorèse est terminée, la responsable du cours, portant des gants, ôte soigneusement le support d’agarose de la cuve à électrophorèse. Le gel est évalué sous la lampe UV. Attention: La lumière UV peut endommager les yeux! Fermez toujours l’écran protecteur avant d’enclencher l’appareil! ______________________________________ 19 ____________________________________ Evaluation: Pour chacun des trois plasmides utilisés, pGEM1, pBluescript et pUC18, la séquence d’identification spécifique reconnue de Nci1 est présente plusieurs fois. Les positions de cette séquence de reconnaissance sont indiquées ci-dessous dans les trois cartes de plasmides. Elles permettent de calculer la taille des fragments d’ADN. Séquence de reconnaissance de l’enzyme de restriction Nci1: CC(G/C)GG GG(C/G)CC NciI (2203) NciI (2238) NciI (2460) NciI (1702) NciI (2663) Ampr pGEM1 MCS 2865 bp NciI (1351) lacZ NciI (41 / 42) unvollständig ori NciI (655) NciI (2581) lacZ Ampr pBluescript SK 2958 bp NciI (659) MCS NciI (715 /716) NciI (2230) ori NciI (1534) NciI (49) NciI (84) NciI (2234) Ampr lacZ pUC18 2686 bp MCS NciI (436 / 437) NciI (1883) ori NciI (1187) ______________________________________ 20 ____________________________________ Marqueur pGEM 1 pBS pUC18 rouge blanc rouge blanc rouge blanc 2176 bp 1766 bp 1230 bp 1033 bp 653 bp 517bp 453 bp 394 bp 289 bp 234/220 bp 154 bp Calculez le nombre et la taille des fragments attendus pour tous les trois plasmides en utilisant les cartes de plasmides de la page 20. __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ Marquez ce résultat théorique sur la photo du gel (page 19). A l’aide du marqueur on peut estimer la position des bandes pour les fragments calculés. Quel résultat obtiendra-t-on pour l’essai avec le plasmide non-fragmenté. Marquez également votre proposition sur la photo du gel. Comparez le nombre et la position des fragments visibles sur le gel avec le résultat théorique sur votre dessin. Lequel des trois plasmides a été isolé par votre groupe ? __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ ______________________________________ 21 ____________________________________ Pourquoi ne voit-on pas tous les fragments produits par la digestion de restriction sur le gel ? Dans quelle mesure l’analyse des fragments par électrophorèse sur gel est limitée. __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ Séquence de pGEM1 (5’3’) 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 gaatacaagc tctccctata gcgcggggag tgcgctcggt tatccacaga ccaggaaccg agcatcacaa accaggcgtt ccggatacct gtaggtatct ccgttcagcc gacacgactt taggcggtgc tatttggtat gatccggcaa cgcgcagaaa agtggaacga cctagatcct cttggtctga ttcgttcatc taccatctgg tatcagcaat ccgcctccat atagtttgcg gtatggcttc tgtgcaaaaa cagtgttatc taagatgctt ggcgaccgag ctttaaaagt cgctgttgag ttactttcac gaataagggc gcatttatca aacaaatagg ttattatcat gtttcggtga gtctgtaagc ggtgtcgggg tcgacgctct gttgagcacc ggccacgggg agcccgatct gccggtgatg gattggttcg gtccaaccaa agccagatgc 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