MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis Manuel d’utilisation User manual ADN génomique du sang n NucleoMag® Blood 200 μL Janvier 2022 / Rev. 05 www.mn-net.com www.mn-net.com Contact MN Germany and international MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-0 Toll-free: 0800 26 16 000 (Germany only) E-mail: [email protected] Technical Support Bioanalysis Tel.: +49 24 21 969-270 E-mail: [email protected] USA MACHEREY-NAGEL Inc. 924 Marcon Blvd. · Suite 102 · Allentown PA, 18109 · USA Toll-free: 888 321 6224 (MACH) E-mail: [email protected] France MACHEREY-NAGEL SAS 1, rue Gutenberg – BP135 · 67720 Hoerdt Cedex · France Tel.: +33 388 68 22 68 E-mail: [email protected] MACHEREY-NAGEL SAS (Société par Actions Simplifiée) au capital de 186600 € Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 · N° intracommunautaire FR04 379 859 531 Switzerland MACHEREY-NAGEL AG Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Switzerland Tel.: +41 62 388 55 00 E-mail: [email protected] www.mn-net.com ADN génomique du sang Sommaire 1 Composition du kit 4 1.1 Composants 4 1.2 Réactifs, consommables et équipement nécessaires 5 1.3 A propos de ce manuel 5 2 Description du kit 6 2.1 Principe général 6 2.2 Caractéristiques du kit 6 2.3 Système de séparation magnétique 7 2.4 Réglage de l’agitateur 8 2.5 Manipulation des billes 9 2.6 Procédures d’élution 10 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs 11 4 Instructions de sécurité 12 4.1 Elimination des déchets 12 5 Protocole pour l’extraction d’ADN du sang 13 6 Annexes 18 6.1 Guide de résolution des problèmes 18 6.2 Informations de commande 20 6.3 Restriction d’utilisation / garantie 20 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 3 ADN génomique du sang 1 Composition du kit 1.1 Composants NucleoMag® Blood 200 μL REF 1x 96 preps 744501.1 4 x 96 preps 744501.4 Billes NucleoMag® B-Beads 2 x 1.5 mL 12 mL Tampon de lyse MBL1 13 mL 45 mL Tampon de fixation MBL2 40 mL 160 mL Tampon de lavage MBL3 300 mL 900 mL Tampon de lavage MBL4 125 mL 500 mL Tampon d’élution MBL5* 30 mL 125 mL Protéinase K, lyophilisée** 50 mg 4 x 50 mg Tampon PB de protéinase K 8 mL 15 mL 1 1 Manuel d’utilisation * Tampon d’élution MBL5: Tris 5 mM, pH 8.5 ** Pour la préparation des réactifs et leurs conditions de stockage, voir le chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 ADN génomique du sang 1.2 Réactifs, consommables et équipement nécessaires Réactifs • Ethanol 80 % (pour la dernière étape de lavage) Equipement / Consommables Produit • • • 1.3 REF Conditionnement 740481 740481.24 4 24 Plaque d’élution pour collecter l’ADN purifié, Ex : plaques d’élution ’U-bottom’ (96 puits de 0.3 mL, fond en ’U’) 740486.24 24 Pour une utilisation sur un instrument KingFisher®, Ex : Set d’accessoires ’KingFisher® Accessory Kit B’ (Blocs 96 puits, Tip combs, Plaques d’élution pour 4 x 96 preps NucleoMag® Blood 200 μL) 744951 1 set Plaque de séparation pour le séparateur magnétique, ex : blocs ’Square-well Block’ (96 puits carrés de 2.1 mL) A propos de ce manuel Nous recommandons vivement la lecture du protocole détaillé aux nouveaux utilisateurs du kit NucleoSpin® Blood 200 µL. Les utilisateurs expérimentés, quant à eux, pourront utiliser le résumé du protocole. Ce dernier est conçu pour un suivi rapide des différentes étapes de la procédure. Toute la documentation technique est disponible sur notre site internet www.mn‑net.com. MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 5 ADN génomique du sang 2 Description du kit 2.1 Principe général La procédure NucleoMag® Blood 200 μL est basée sur l’adsorption réversible des acides nucléiques sur les billes paramagnétiques en présence des tampons adéquats. Le sang total est lysé en présence du tampon de lyse MBL1 et de la Protéinase K. Après la lyse, les billes magnétiques sont ajoutées ainsi que le tampon MBL2 afin de créer les conditions optimales de fixation de l’ADN. Après séparation magnétique et élimination des surnageants, les billes paramagnétiques sont lavées pour éliminer les contaminants et les sels. Une étape de séchage à l’air n’est pas nécessaire: l’éthanol peut être éliminé avec le tampon de lavage MBL4. Pour finir, l’ADN purifié est élué dans un tampon faiblement salin (MBL5) et est directement utilisable pour les applications avales. Le kit NucleoMag® Blood 200 μL peut être utilisé de manière manuelle ou automatisée sur les robots pipeteurs ainsi que la plupart des séparateurs magnétiques automatisés. 2.2 Caractéristiques du kit NucleoMag® Blood 200 μL est conçu pour la purification rapide, à petite échelle, d’ADN génomique à partir de 200 µL de sang total en utilisant le séparateur magnétique NucleoMag® SEP (voir ’Informations de commandes’) ou un autre système de séparation (voir 2.3). La durée de préparation pour 96 échantillons est d’environ 120 minutes. L’ADN obtenu peut être directement utilisé pour les applications de PCR, de blotting ou pour différents types de réactions enzymatiques. NucleoMag® Blood 200 μL est aisément automatisable sur les plateformes de pipetage courantes ou sur les séparateurs magnétiques automatisés, comme par exemple les robots KingFisher® (Thermo Fischer Scientific). Le temps de traitement dépend de la configuration de votre plateforme et du système de séparation magnétique utilisé. En général, avec le séparateur NucleoMag® SEP sur un robot pipeteur, 96 échantillons peuvent être extraits en moins de 120 minutes. Le kit fournit les réactifs pour la purification de 2–8 μg d’ADN génomique à partir de 200 µL de sang total avec un ratio A260 / A280 ≥ 1.6–1.9 et des concentrations de l’ordre de 20–40 ng/ μL. En fonction de l’origine des échantillons et du volume d’élution utilisé, des concentrations de 10–160 ng/μL peuvent être obtenues. Le sang utilisé peut être frais ou congelé, traité à l’EDTA ou au citrate. La procédure est optimisée pour un volume de sang de 200 μL. NucleoMag® Blood 200 μL est utilisé à température ambiante. Cependant, l’élution à 55°C ou 72°C permet d’accroître le rendement de 15–20 %. Les billes NucleoMag® B-Beads sont des billes superparamagnétiques hautement réactives. Leur capacité de fixation d’ADN est d’environ 0.4 μg d’ADNg pour 1 µL de suspension NucleoMag® Blood Bead, 1 μL de suspension contient 140 μg de billes. 6 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 ADN génomique du sang 2.3 Système de séparation magnétique Pour utiliser le kit NucleoMag® Blood 200 μL, le séparateur magnétique NucleoMag® SEP est recommandé. La séparation s’effectue en blocs 96 puits carrés ’Square-well Block’ (voir ’Informations de commande’). Le kit peut aussi être utilisé sur d’autres séparateurs magnétiques courants Séparateur magnétique Plaque ou tube de séparation NucleoMag® SEP (MN REF 744900) Blocs ’Square-well Block’ (MN REF 740481) Tecan Te-MagS™ Tubes 1.5 mL sans bouchon (Sarstedt) Séparateurs à aimants fixes Les séparateurs à aimants fixes, comme le NucleoMag® SEP (utilisable manuellement ou sur automates pipeteurs), sont recommandés en association avec un agitateur pour plaques, permettant une resuspension optimale des billes pendant les étapes de lavages et d’élution. Alternativement, les billes peuvent être resuspendues dans les tampons par plusieurs cycles de pipetage. Pour automatiser totalement la procédure sur un robot pipeteur, un bras manipulateur de plaques est nécessaire, afin de transférer la plaque du séparateur magnétique vers l’agitateur pour la resuspension des billes. Système à aimants mobiles Ces séparateurs disposent d’aimants se déplaçant d’un côté à l’autre des puits, entraînant les billes à travers les tampons. La séparation magnétique a lieu lors de l’arrêt du système. Séparateurs automatisés (par exemple : les instruments King Fisher®) Ces séparateurs transfèrent les billes dans les différents tubes ou plaques. Les billes sont resuspendues par rétractation des aimants à l’intérieur de leur protection. Après chaque étape de fixation, lavage ou d’élution, les billes sont collectées et transportées dans le tube ou plaque correspondant à la solution suivante*. * Contacter le support technique MN. MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 7 ADN génomique du sang 2.4 Réglage de l’agitateur Lors de l’utilisation d’un agitateur à plaques pour les étapes de lavages et d’élution, la vitesse d’agitation doit être ajusté précautionneusement afin de garantir la bonne resuspension des billes en évitant tout risque de contaminations croisées : Réglage de l’agitation pour les étapes de fixation et les lavages : • Déposer 800 µL d’eau colorée (pour l'étape de fixation) ou 600 µL (pour les étapes de lavage) dans les puits de la plaque de séparation. Placer la plaque sur l’agitateur et lancer l’agitation à vitesse modérée pendant 30 secondes. Stopper et vérifier l’absence de projections. • Augmenter la vitesse d’agitation pour une durée de 30 sec supplémentaires et vérifier l’absence de projections. • Continuer à augmenter la vitesse d’agitation jusqu’à observer des projections audessus de la plaque de séparation. Réduire ensuite progressivement la vitesse, vérifier l’absence de projections et utiliser ce réglage pour les étapes de lavages. Réglage de l’agitation pour l’étape d’élution: • Déposer 100 μL d’eau colorée dans les puits de la plaque de séparation et procéder comme mentionné ci-dessus. 8 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 ADN génomique du sang 2.5 Manipulation des billes Distribution des billes Une distribution homogène des billes dans les puits de la plaque de séparation est essentielle pour une bonne reproductibilité. Avant de distribuer les billes, veiller à bien les resuspendre. Agiter le flacon ou placer le sur un vortex brièvement. Un mélange préliminaire des billes magnétiques avec le tampon de fixation MBL2 permet une distribution plus homogène des billes dans les différents puits de la plaque de séparation. Lors de l’automatisation, une étape de mélange des billes et du tampon de fixation dans les réservoirs avant leur distribution dans les plaques de séparation est recommandée afin de s’assurer que les billes demeurent bien en suspension. Durée de la séparation magnétique L’attraction des billes magnétiques par les aimants dépend de la force de l’aimant, du type de plaque de séparation utilisé, de la distance entre les parois des puits et les aimants ainsi que du volume présent dans les puits. Les temps d’aimantation des billes doivent être ajustés en fonction de chaque système. Il est recommandé d’utiliser des plaques ou tubes de séparation validés pour le type de séparateur magnétique utilisé. Lavage des billes Le lavage des billes est effectué par agitation ou pipetage. Contrairement au pipetage, l’agitation permet la resuspension des billes dans tous les puits simultanément. Ceci permet de réduire le temps de la procédure et le nombre de cônes nécessaires. Cependant, la resuspension par pipetage est plus efficace que l’agitation de la plaque ou l’agitation magnétique. Méthode Efficacité de resuspension Rapidité Nombre de cônes Magnétique + ++ Faible Agitateur ++ ++ Faible Pipetage +++ +* Elevé +: acceptable, ++: bon, +++: excellent; * pipette 8-canaux. * En fonction du système de pipetage multicanaux. MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 9 ADN génomique du sang 2.6 Procédures d’élution L’ADN total purifié peut être élué directement avec le tampon d’élution fourni MBL5. L’élution peut être réalisé dans un volume ≥ à 50 μL. Il est essentiel de recouvrir totalement les billes NucleoMag® B-Beads avec le tampon MBL5 lors de l’étape d’élution. Le volume optimal de tampon MBL5 dépend du système de séparation magnétique utilisé (ex: position des culots de billes dans les puits). Pour une élution optimale, les culots de billes magnétiques doivent être resuspendues totalement dans le tampon d’élution MBL5. Avec certains séparateurs, des volumes d’élution supérieurs peuvent être nécessaires afin de recouvrir totalement les culots de billes magnétiques. 9 8 ADN [µg] 7 6 7.0 6.4 7.4 8.1 8.2 150 175 7.6 5 4 3 2 1 0 50 75 100 125 Volume d'élution [µg] Figure 1 Influence du volume d’élution sur le rendement d’ADN (exemple) ADN [µg] L’élution est possible à température ambiante. Cependant, le rendement en ADN peut être amélioré de 15– 20 % si l’élution est effectuée à 72 °C (voir Figure 2). 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7.0 5.5 TA 6.0 56 °C 72 °C Figure 2 Influence de la température d’élution sur le rendement d’ADN 10 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 ADN génomique du sang 3 Conditions de stockage et préparation des réactifs Attention: les tampons MBL1, MBL2, et MBL3 contiennent des sels chaotropiques! Porter des gants et des lunettes de protection! ATTENTION : le tampon MBL1 contient du chlorhydrate de guanidine pouvant former des composants réactifs en présence d’eau de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus de la procédure. • Tous les composants du kit NucleoMag® Blood 200 μL doivent être stockés à température ambiante (15–25 °C) et sont stables pendant 1 an maximum. • Tous les tampons sont fournis prêts à l’emploi. Avant de débuter la procédure NucleoMag® Blood 200 μL, préparer la solution de protéinase K : • Ajouter le volume indiqué de tampon PB pour dissoudre la protéinase K lyophilisée (voir tableau ci-dessous). La solution de protéinase K est stable à -20°C pendant au plus 6 mois. NucleoMag® Blood 200 μL REF Protéinase K 1 x 96 preps 744501.1 4 x 96 preps 744501.4 50 mg 4 x 50 mg Ajouter 2.5 mL de tampon PB Protéinase K Ajouter 2.5 mL de tampon PB Protéinase K dans chaque flacon MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 11 ADN génomique du sang 4 Instructions de sécurité Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoMag® Blood 200 µL, portez des vêtements de protection appropriés (par exemple: une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consultez les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn‑net.com/msds). Attention : Le chlorhydrate de guanidine dans le tampon MBL1 et le perchlorate de sodium dans les tampons MBL2 et MBL3 peuvent former des composés hautement réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajoutez pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement dans les déchets liquides issus de la procédure. Les déchets générés par le kit NucleoMag® Blood 200 µL n’ont pas été testés pour la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du tampon de lyse fortement dénaturant et du traitement à la protéinase K mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations de sécurité locales. 4.1 Elimination des déchets Eliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique de manière sure et conforme aux dispositions règlementaires locales. 12 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 NucleoMag® Blood 200 μL 5 Protocole pour l’extraction d’ADN du sang Résumé du protocole A propos de l’équipement et du matériel requis, voir les chapitres 1.2 et 2.3. Pour des informations détaillées sur chaque étape, voir page 15 Avant de débuter la préparation: • Vérifier que la protéinase K a été préparée selon les instructions du chapitre 3. 1 Lyse des échantillons Déposer 20 μL Protéinase K dans le Bloc 200 μL de sang 80 μL MBL1 Mélanger 3–5 fois Agiter 10 min à TA 2 Fixation de l’ADN aux billes NucleoMag® B-Beads 25 μL B-Beads 300 μL MBL2 Agiter 5 min à TA (Option: Mélanger par pipetage) Prélever le surnageant après 2 min de séparation 3 Lavage MBL3 (1er lavage) Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 800 μL MBL3 Resuspendre: agiter 5 min à TA (Option: Mélanger par pipetage) Prélever le surnageant après 2 min de séparation MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 13 NucleoMag® Blood 200 μL 4 Lavage MBL3 (2ième lavage) Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 800 μL MBL3 Resuspendre: agiter 5 min à TA (Option: Mélanger par pipetage) Prélever le surnageant après 2 min de séparation 5 Lavage avec 80 % ethanol Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 800 μL d’éthanol 80 % Resuspendre: agiter 5 min à TA (Option: Mélanger par pipetage) Prélever le surnageant après 2 min de séparation 6 Lavage MBL4 900 μL MBL4 ! 7 Laisser le bloc sur le NucleoMag® SEP Incuber pendant 45–90 s Aspirer et jeter le surnageant Note: Ne pas resuspendre les billes dans le tampon MBL4! Elution de l’ADN Enlever le bloc du NucleoMag® SEP 50‑100 μL MBL5 (Option: Eluer à 55 °C) Agiter à 5–10 min à TA (Option : Mélanger par pipetage) Séparer les billes 2 min et transférer l’ADN dans une plaque / des tubes de collecte 14 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 NucleoMag® Blood 200 μL Protocole détaillé Ce protocole décrit la procédure utilisant un séparateur magnétique à aimants statiques (ex: NucleoMag® SEP) et un agitateur pour plaques adéquat (voir chapitre 2.3). Il est recommandé d’utiliser les blocs 96 puits carrés pour la séparation (voir chapitre 1.2). Par ailleurs, l’extraction de l’ADN peut s’effectuer en tube, avec un séparateur magnétique compatible. Cette procédure manuelle est également un guide pour l’automatisation du kit sur les robots pipeteurs. Avant de débuter : • Vérifier que la protéinase K a été préparée selon les instructions du chapitre 3. 1 Lyse des échantillons Déposer 20 μL de solution de Protéinase K dans les puits du bloc 96 puits carrés. Transférer 200 μL de sang (équilibré à température ambiante) dans chacun des puits. Veiller à ne pas contaminer la partie supérieure des puits. Note: voir nos recommandations à propos des compatibilités entre les plaques / tubes de séparation et les différents séparateurs magnétiques (chapitre 2.3). Ajouter 80 μL de tampon MBL1 à chaque échantillon, mélanger par pipetages répétés (3–5 fois) et agiter pendant 5–10 min à température ambiante. Alternativement, sans agitateur pour plaques, pipeter le mélange 10 fois et incuber 5–10 min à température ambiante. 2 Fixation de l’ADN aux billes NucleoMag® B-Beads Ajouter 25 μL de billes NucleoMag® B-Beads à chaque échantillon. Homogénéiser la suspension de billes avant de les distribuer dans les échantillons. Ajouter 300 μL de tampon MBL2 dans chaque échantillon, mélanger par pipetage 3–5 fois et agiter pendant 5 min pour permettre à l’ADN de se fixer aux billes magnétiques. Alternativement, sans agitateur, pipeter le mélange 10 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Note: les billes NucleoMag® B-Beads et le tampon MBL2 peuvent être mélangés au préalable. Pour chaque échantillon à extraire, mélanger 25 µL de billes NucleoMag® B-Beads et 300 μL de tampon MBL2. Vortexer brièvement. En fonction du volume mort des réservoirs utilisés, des excédents de suspension de billes et de tampon de fixation peuvent être nécessaires. Mélanger la solution plusieurs fois pour éviter aux billes de sédimenter. Ne pas stocker le mélange NucleoMag® B-Beads et le tampon MBL2 pendant plus de 12 h. Veiller à resuspendre les billes NucleoMag® B-Beads avant de les prélever dans le flacon. Vortexer le flacon jusqu’à ce que la suspension soit homogène. Séparer les billes magnétiques contre les parois des puits en plaçant le bloc 96 puits sur le séparateur magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter le surnageant. Note: ne pas perturber les culots de billes pendant l’aspiration des surnageants. Les culots sont très peu visibles à cette étape. Pipeter les surnageants du côté opposé des puits. MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 15 NucleoMag® Blood 200 μL 3 Lavage MBL3 (1er) Enlever le bloc du séparateur magnétique. Ajouter 800 μL de tampon MBL3 dans chaque puits et remettre en suspension les complexes billes / ADN en agitant à température ambiante jusqu’à totale resuspension des billes (5 min). Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15 fois). Note: veiller à suspendre totalement les billes magnétiques, une suspension homogène brunâtre doit apparaître. Si nécessaire, augmenter la durée d’agitation ou le nombre de cycles de pipetage. Un mélange incomplet peut impacter négativement la pureté de l’ADN élué. Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits sur le séparateur magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants. Note: les surnageants sont brunâtres, les culots de billes sont maintenant visibles. 4 Lavage MBL3 (2nd) Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique. Ajouter 800 μL de tampon MBL3 dans chaque puits pour un second lavage MBL3. Laver les complexes billes / ADN en agitant (5 min) à température ambiante. Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15 fois). Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants. Note: les surnageants sont incolores, les culots de billes magnétiques sont clairement visibles. 5 Laver à l’éthanol 80 % Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique. Ajouter 800 μL d’éthanol 80 % dans chaque puits et laver le complexe billes / ADN en agitant (5 min) à température ambiante. Alternativement, resuspendre les billes par pipetage (15 fois). Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc 96 puits sur le séparateur magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Retirer et jeter les surnageants. Note: les surnageants sont incolores, les culots de billes sont clairement visibles. 16 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 NucleoMag® Blood 200 μL 6 Lavage MBL4 Laisser le bloc 96 puits sur le séparateur magnétique. Déposer doucement 900 μL de tampon MBL4 dans chaque puits et incuber pendant 45–90 sec alors que les billes restent sur les aimants. Retirer et jeter les surnageants. Note: NE PAS resuspendre les billes dans le tampon MBL4. Cette étape élimine les traces d’éthanol et évite de recourir à une étape de séchage à l’air. Option: le lavage des billes avec le tampon MBL4 peut diminuer légèrement le rendement en ADN. Il est possible de remplacer ce lavage par un séchage à l’air des billes magnétiques en incubant 10–15 min à TA pour évaporer l’éthanol. En cas d’éthanol résiduel, les billes apparaissent brillantes. Chauffer modérément (37 °C) peut faciliter et raccourcir l’étape de séchage. Un séchage excessif, à contrario, peut induire une diminution de l’efficacité d’élution. 7 Elution de l’ADN Enlever le bloc 96 puits du séparateur magnétique. Ajouter le volume adéquat de MBL5 (50–100 μL) dans les puits et agiter pour resuspendre les billes (5–10 min). Alternativement, pipeter pour mélanger (15 fois). Séparer les billes magnétiques en plaçant le bloc sur le séparateur magnétique. Attendre au moins 2 min jusqu’à ce que toutes les billes aient été attirées par les aimants. Transférer les surnageants contenant l’ADN génomique purifié dans une plaque / des tubes d’élution. Note: le rendement peut être accru de 15–20 % en utilisant le tampon d’élution préchauffé (55– 72 °C) ou en incubant la suspension de billes / tampon d’élution à 55–72 °C pendant 10 min. MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 17 ADN génomique du sang 6 Annexes 6.1 Guide de résolution des problèmes Problèmes Cause possible et suggestions Volume de tampon d’élution insuffisant • Les billes doivent être recouvertes totalement par le tampon. Performance insuffisante du tampon d’élution • Eliminer complètement les tampons résiduels à chaque étape de séparation. Les tampons résiduels restant diminuent l’efficacité des lavages et de l’élution. Billes séchées excessivement • Ne pas trop sécher les billes, l’élution en serait impactée. Faible Elution partiel de l’ADN dans le tampon de lavage MBL4 rendement en • Maintenir la plaque de séparation sur l’aimant lors de la distribution ADN du tampon de lavage MBL4. Ne pas remettre en suspension les billes dans ce tampon, ni incuber les billes plus de 2 min dans ce tampon. Le tampon MBL4 étant aqueux, il pourrait conduire à l’élution prématurée de l’ADN. Aspiration du culot de billes présents sur l’aimant • Ne pas perturber les culots de billes sur l’aimant lors de l’aspiration des surnageants, en particulier lorsque les culots ne sont pas visibles dans les lysats. Incubation après distribution des billes dans les lysats. • Mélanger immédiatement après distribution des billes NucleoMag® B-Beads et du tampon de fixation MBL2. Sang de faible qualité • Pureté faible Veiller à l’absence de caillots sanguins lors du transfert dans les puits. Les échantillons peuvent être stockés à 2–8 °C pendant 2 semaines. Congeler pour une conservation à plus long terme. Procédure de lavage insuffisante • 18 Utiliser uniquement des plaques / tubes recommandés pour les séparateurs magnétiques, par exemple les blocs 96 puits carrés ’Square-well Block’ en association avec le séparateur magnétique NucleoMag® SEP. MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 ADN génomique du sang Problèmes Performance insuffisante de l’ADN dans les applications Cause possible et suggestions Contamination par de l’éthanol issu des tampons de lavage • Veiller à éliminer l’éthanol issu de l’étape de lavage. L’éthanol peut interférer avec les applications avales. Utiliser correctement le lavage avec le tampon MBL4 ou ajouter un séchage à l’air. Faible pureté • Voir ci-dessus. Durée de la séparation magnétique insuffisante • Perte de billes Augmenter la durée de séparation magnétique pour permettre aux billes d’être complétement attirées par les aimants avant d’aspirer les liquides. Vitesse d’aspiration trop élevée (étape d’élution) • Une vitesse d’aspiration élevée à l’étape d’élution peut induire la perte de billes. Réduire la vitesse d’aspiration lors de l’élution. • Pour éliminer les billes magnétiques des éluats, placer la plaque d’élution sur le séparateur magnétique, et transférer les éluats lorsque les résidus de billes ont été suffisamment attirés par les aimants. Contaminations des parties supérieures des puits Contamina• tions croisées Ne pas souiller les parties hautes des puits lors du transfert du sang. En cas de souillure, filmer le bloc avec un film adhésif en PE (voir ’Informations de commandes’) avant de lancer l’agitation. MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 19 ADN génomique du sang 6.2 Informations de commande Produit REF Conditionnement NucleoMag Blood 200 μL 744501.1 744501.4 1 x 96 preps 4 x 96 preps NucleoMag® SEP 744900 1 Blocs 96 puits carrés ’Square-well Blocks’ 740481.4 740481.24 4 24 Plaque d’élution à fond en ’U’ 740486.24 24 Films adhésifs en PE 740676 50 feuilles Kit B Accessoires pour KingFisher 744951 1 set ® (set comprenant : Blocs 96 puits, Tip combs, Plaques d’élution pour 4 x 96 preps) Visitez notre site web www.mn‑net.com pour des informations plus détaillées. 6.3 Restriction d’utilisation / garantie Les composants du kit NucleoMag® Blood 200 μL ont été développés, conçus et vendus UNIQUEMENT À DES FINS DE RECHERCHE, à l’exception, toutefois, de toute autre fonction du produit qui est expressément décrite dans les notices originales des produits MACHEREY‑NAGEL. Les produits MACHEREY‑NAGEL sont destinés à une utilisation GÉNÉRALE en LABORATOIRE UNIQUEMENT ! Les produits MACHEREY‑NAGEL sont EXCLUSIVEMENT destinés à un PERSONNEL QUALIFIÉ ! Lorsqu’ils manipulent des produits MACHEREYNAGEL, les utilisateurs doivent toujours porter des VÊTEMENTS DE PROTECTION adéquats. Pour des informations détaillées, veuillez-vous référer à la fiche de données de sécurité du produit ! Les produits MACHEREY‑NAGEL doivent être utilisés exclusivement dans un ENVIRONNEMENT DE TEST ADÉQUAT. MACHEREY‑NAGEL décline toute responsabilité pour les dommages dus à une utilisation incorrecte de ses produits dans tous autres domaines d’application. L’application sur le corps humain est STRICTEMENT INTERDITE. L’utilisateur est responsable de tous les dommages résultant d’une telle application. Les produits de purification d’ADN/ARN/PROTÉINES de MACHEREY‑NAGEL conviennent UNIQUEMENT aux UTILISATIONS IN VITRO ! SEULS les produits MACHEREY‑NAGEL portant la mention « IVD » peuvent également être utilisés pour le diagnostic IN VITRO. Veuillez prêter attention à l’emballage du produit. La mention « IVD » doit figurer expressément sur l’emballage des produits de diagnostic IN S’IL N’Y A PAS LA MENTION « IVD », LE PRODUIT NE PEUT PAS ÊTRE UTILISÉ POUR LE DIAGNOSTIC IN-VITRO ! TOUS LES AUTRES PRODUITS NE PORTANT PAS LA MENTION « IVD » NE SONT PAS ADAPTÉS À UN USAGE CLINIQUE (Y COMPRIS, MAIS SANS S’Y LIMITER, À UN USAGE DIAGNOSTIQUE, THÉRAPEUTIQUE ET/OU PRONOSTIQUE). 20 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 ADN génomique du sang Aucune revendication ni déclaration n’est prévue concernant son utilisation pour identifier un organisme spécifique ou pour un usage clinique (y compris, mais sans s’y limiter, à des fins diagnostiques, pronostiques, thérapeutiques ou dans les banques du sang). Il incombe plutôt à l’utilisateur ou – dans tous les cas de revente des produits – au revendeur de contrôler et de veiller à ce que les produits de purification d’ADN/ARN/protéines de MACHEREY‑NAGEL soient utilisés pour une application bien définie et spécifique. MACHEREY‑NAGEL est responsable uniquement des spécifications et des performances des produits MN conformément aux spécifications de contrôle qualité interne, de la documentation du produit et du matériel de marketing. Ce produit MACHEREY‑NAGEL est livré avec une documentation précisant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La seule obligation de MACHEREY‑NAGEL et le seul recours du client se limitent au remplacement gratuit des produits qui n’offriraient pas les performances garanties. Il est également fait référence aux conditions générales de vente MACHEREY‑NAGEL, qui sont imprimées sur la liste tarifaire et dont un exemplaire sera remis sur simple demande. MACHEREY‑NAGEL ne saurait être tenu responsable : des dommages ou défauts se produisant pendant le transport et la manipulation (hors assurance expédition du client), ou par suite d’un accident ou d’une utilisation impropre ou anormale du présent produit ; des défauts des produits ou des composants non fabriqués par MACHEREY‑NAGEL ; ni des dommages résultant de tels produits et composants de fabricants autres que MACHEREYNAGEL ; pour lesquels il n’existe aucune garantie. MACHEREY‑NAGEL n’accorde aucune autre garantie d’aucune sorte, et DÉCLINE ET EXCLUT SPÉCIFIQUEMENT TOUTE AUTRE GARANTIE DE TOUTE SORTE OU NATURE QUE CE SOIT, DIRECTEMENT OU INDIRECTEMENT, EXPRESSE OU IMPLICITE, Y COMPRIS, SANS S’Y LIMITER, RELATIVE AU CARACTÈRE APPROPRIÉ, À LA REPRODUCTIBILITÉ, LA DURABILITÉ, L’ADAPTATION À UN BUT OU UN USAGE PARTICULIER, LA QUALITÉ MARCHANDE, L’ÉTAT OU TOUT AUTRE SUJET EN CE QUI CONCERNE LES PRODUITS MACHEREY‑NAGEL. MACHEREY‑NAGEL ne saurait en aucun cas être tenue pour responsable en cas de réclamations pour tout autre dommage, qu’il soit direct, indirect, fortuit, compensatoire, prévisible, consécutif ou particulier (y compris, mais sans s’y limiter, la perte d’utilisation, de revenus ou de profits), que ce soit sur la base d’une garantie, d’un contrat, d’un délit civil (y compris la négligence) ou d’une responsabilité stricte découlant de la vente ou du défaut d’exécution d’un produit MACHEREY‑NAGEL conformément aux spécifications énoncées. La garantie est exclusive et MACHEREY‑NAGEL ne donne aucune autre garantie expresse ou implicite. La garantie fournie dans le présent document et les données, spécifications et descriptions de ce produit MACHEREY‑NAGEL figurant dans les catalogues publiés et la documentation sur le produit de MACHEREY‑NAGEL sont les seules représentations de MACHEREY‑NAGEL concernant le produit et la garantie. Aucune autre déclaration ou représentation, écrite ou orale, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY‑NAGEL, à l’exception des déclarations écrites signées par un agent dûment agréé par MACHEREY‑NAGEL, n’est autorisée ; le client ne doit pas se fier à de telles déclarations ou représentations, lesquelles ne font pas partie du contrat de vente ou de la présente garantie. Les allégations relatives au produit sont susceptibles d’être modifiées. Nous vous invitons par conséquent à contacter notre service d’assistance technique pour obtenir les informations MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 21 ADN génomique du sang les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur habituel, pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les applications mentionnées dans la documentation fournie par MACHEREY‑NAGEL le sont uniquement à titre informatif. MACHEREY‑NAGEL ne garantit pas que toutes les applications ont été testées dans les laboratoires de MACHEREY‑NAGEL, avec les produits MACHEREY‑NAGEL. MACHEREY‑NAGEL ne garantit en aucun cas le caractère correct de ces applications. Dernière mise à jour : 07/2010, Rév. 03 Veuillez contacter : MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co. KG Tel.: +49 24 21 969‑270 tech-bio@mn‑net.com Marques déposées : KingFisher ® est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific. NucleoMag ® est une marque déposée de MACHEREY‑NAGEL GmbH & Co KG. Te-MagS est une marque déposée de Tecan Group Ltd., Suisse. Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. 22 MACHEREY-NAGEL – 01/2022, Rev. 05 www.mn-net.com MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Valencienner Str. 11 52355 Düren · Germany DE CH FR US Tel.: +49 24 21 969-0 Tel.: +41 62 388 55 00 Tel.: +33 388 68 22 68 Tel.: +1 888 321 62 24 [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] A0xxxx/xxxx.xx ">
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