Thermo Fisher Scientific VetMAX M. bovis Kit Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ M. bovis Kit
TaqMan™ Détection par PCR temps réel de Mycoplasma bovis
Référence catalogue MPBO50
N° de document 100020390
Pub. nº MAN0008808 Rév. C
Technique
Espèces
PCR temps réel (ADN)
• Essais en duplex
• IPC endogène
Bovins
•
•
•
•
•
•
Échantillons
Liquide synovial
Liquide trachéo-bronchique
Lait
Organe (poumon)
Colonies microbiennes
Semences (fraiches ou paillettes commerciales,
sexuées ou non)
Type de test
Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de
protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante :
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit
disponibles sur thermofisher.com. Suivre toutes les réglementations du travail avec des échantillons biologiques locales, nationales
et/ou communautaires en vigueur.
Description du produit
™
™
Le kit Applied Biosystems VetMAX M. bovis Kit (cat. n°MPBO50) permet la détection par PCR temps réel de Mycoplasma bovis, l’une des
espèces de mycoplasmes les plus pathogènes chez les ruminants. M. bovis est responsable de maladies respiratoires et articulaires chez les
veaux et les jeunes bovins, et de mammite chez les bovins adultes. La transmission peut être horizontale, par les aérosols qui sont produits
pendant la bronchopneumonie, ou verticale, de la mère au veau par le lait infecté.
Le kit fournit les essais et les réactifs pour une détection par PCR temps réel en monopuits des cibles de l’ADN bactérien et du contrôle
positif interne (IPC) de M. bovis grâce à la chimie des sondes fluorescentes par hydrolyse. La positivité de l’IPC traduit à la fois l’efficacité de
l’extraction de l’ADN et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.
Le kit peut être utilisé avec de l’ADN bactérien extrait du liquide synovial, du liquide trachéo-bronchique, du lait individuel ou en mélange
(par exemple, du lait provenant de réservoirs), des organes, des colonies microbiennes et des semences. Les protocoles complets pour
l’extraction de l’ADN bactérien sont disponibles sur demande auprès du support technique.
Ce kit comprend les composants suivants.
• 3 – Mix MPBO: Contient des amorces, des sondes, un tampon et une enzyme pour une amplification optimisée en duplex par PCR temps
réel des cibles M. bovis (MB) et IPC.
• 4a – EPC MPBO: Matrice d’ADN contenant la séquence cible MB (contrôle positif externe, EPC). Il sert de contrôle positif pour les
composants de la PCR temps réel et est utilisé pour définir le critère de validation des résultats des tests.
Source
Élément
Instrument de PCR en temps réel, parmi les suivants (ou équivalent) :
Contenu et conservation
Élément
Quantité[1]
Conservation
2 × 500 µl
90 µl
-30°C à -10°C
3 – Mix MPBO (tube vert)
4a – EPC MPBO (tube marron)
[1] Les volumes sont suffisants pour 50 réactions de PCR en temps réel (20 µl).
Matériels requis non fournis
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur
fisherscientific.com ou auprès d'un autre fournisseur principal de
laboratoire.
Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent
les pages Web de ces produits.
Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR
System
• Precision Plate Holder pour les plaques
(A24820)
• Precision Plate Holder pour les tubes et
les barrettes de 0,2 ml (4367033)
Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time
Contacter votre bureau de
PCR System
vente local.
• Precision Plate Holder pour les plaques
(4359652)
• 7500 Fast Precision Plate Holder pour les
barrettes de tubes de 0,1 ml (A29252)
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 RealTime PCR System
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Élément
Source
Pipettes réglables
Centrifugeuse de paillasse
Centrifugeuse avec adaptateur pour plaque
Agitateur de laboratoire (vortex ou équivalent)
Deux bacs de glace ou portoirs réfrigérants :
• Un pour la zone de configuration de la
PCR dans laquelle le master mix PCR est
préparé
• Un pour la zone dans laquelle les
échantillons d’ADN et les contrôles sont
préparés
Tubes, plaques et autres consommables
PFL
PFL
PFL
PFL
Équipement
Plaques de réactions optiques et couvercles
adhésifs
PFL
Gants jetables
Réactifs
Eau sans nucléase (non traitée au DEPC)
Tampon 1X TE
Tampon PBS 1X
thermofisher.com/plastics
PFL
PFL
PFL
Instructions
• Inclure les réactions de contrôle suivantes pour chaque test de
PCR temps réel.
– Contrôle positif (EPC) — utiliser 4a – EPC MPBO.
– Contrôle d’extraction (NCS) — utiliser des échantillons
témoins qui ont été préparés au cours de la même procédure
d’extraction de l’ADN que les échantillons testés.
– Contrôle sans acide nucléique (NTC) — utiliser de l’eau sans
nucléase.
• Respecter les bonnes pratiques de laboratoire pour éviter les
faux positifs et la contamination des échantillons testés par des
produits de PCR (voir “Bonnes pratiques de laboratoire pour la
PCR et la RT-PCR” en page 3).
Exigences concernant l’ADN
Étape, processus ou
paramètre
Méthode d’extraction
de l’ADN
Modification de la
méthode d’extraction
de l’ADN pour les
échantillons testés et
l’échantillon témoin
Préparation de
l’échantillon témoin
pour une utilisation
dans une PCR de
contrôle d’extraction
1. Décongeler les réactifs et échantillons.
a. Décongeler 3 – Mix MPBO à 2–8°C sur de la glace ou un
portoir réfrigérant.
b. Décongeler 4a – EPC MPBO et les échantillons d’ADN dans
un bac de glace ou un portoir réfrigérant différent.
2. Vortexer chaque tube pour bien mélanger, puis centrifuger
brièvement pour recueillir le contenu.
Stocker les réactifs et les échantillons décongelés à 2–8°C jusqu’à
utilisation.
Préparer les réactions de PCR
thermofisher.com/
pipettetips
PFL
Embouts de pipettes
Avant de commencer
Recommandation
Les méthodes validées pour une utilisation avec
le VetMAX™ M. bovis Kit sont disponibles sur
demande auprès du support technique.
Pour les échantillons de semences sexuées dont
les résultats sont invalides en raison d’un faible
nombre de cellules, une source IPC exogène,
comme VetMAX™ Xeno™ Internal Positive Control
DNA, peut être utilisée pour surveiller la présence
d’inhibition de la PCR.
Préparer au moins 1 échantillon témoin, à l’aide
d’eau sans nucléase comme matériel de départ.
Traiter l’échantillon témoin en même temps que
les échantillons à analyser, en utilisant la même
procédure d’extraction de l’ADN.
1. Répartir 20 µl de 3 – Mix MPBO dans le nombre approprié de
puits de plaques ou de tubes.
2. Ajouter le composant indiqué pour chaque type de réaction.
Composant
Volume par réaction
Échantillon d’ADN
4a – EPC MPBO
Échantillon témoin
Eau sans nucléase
5,0 µl
5,0 µl
5,0 µl
5,0 µl
Type de réaction
Échantillon testé
EPC
NCS
NTC
3. Sceller chaque plaque ou tube, mélanger, puis centrifuger
brièvement pour collecter le contenu.
Configurer et démarrer l’instrument de PCR en
temps réel
1. En suivant les instructions du fabricant, configurer le test de
PCR temps réel à l’aide des paramètres suivants.
• Volume réactionnel : 25 µl
™
• Référence passive : Fluorophore ROX (inclus dans
3 – Mix MPBO)
™
Remarque : Le fluorophore ROX doit être sélectionné si
l’instrument est capable de le détecter. Les instruments de
™
PCR temps réel qui ne détectent pas le fluorophore ROX
peuvent être utilisés sans conséquence sur l’exactitude des
lectures.
• Programme de l’instrument de PCR temps réel : mode
standard ou fast
Phase
Répétitions
Température
Durée
1
2
3
1
1
45
50°C
95°C
95°C
60°C[1]
2 minutes
10 minutes
15 secondes
1 minute[1]
[1] Les données d’amplification en temps réel sont recueillies au cours de
cette étape.
2. Sélectionner ou créer des détecteurs de fluorophores, puis les
assigner à chaque tube ou puits.
Cible
Reporter
Quencher
M. bovis (MB) Fluorophore FAM™
Quencher non fluorescent (NFQ)
IPC endogène Fluorophore VIC™
3. Exécuter le programme de l’instrument de PCR temps réel.
Consignes pour l’analyse des données
• Suivre le guide de l’utilisateur de l’instrument pour l’analyse des données brutes.
• Fixer les seuils pour chaque cible séparément.
• Voir le certificat d’analyse du lot de fabrication du kit pour valider le test et interpréter les résultats.
2
™
Notice d’utilisation du VetMAX M. bovis Kit
Critères de validation
Se référer aux valeurs CtQC dans le certificat d’analyse du lot de fabrication du kit. Le test est validé si les critères suivants sont respectés :
Cible MB
(fluorophore FAM™)
Cible IPC endogène
(fluorophore VIC™)
Ct = CtQC MB de 4a – EPC MPBO ± 3 Ct[1]
Ct < 45 ou Ct > 45[2]
Ct > 45
Ct > 45
Ct > 45
Ct > 45
Type de réaction
EPC
NCS
NTC
Interprétation
La PCR est validée.
L’extraction de l’ADN est validée.
Les réactifs PCR sont validés.
[1] Voir le tableau EPC dans le certificat d’analyse.
[2]
La valeur Ct de l'IPC de la réaction de contrôle positif (EPC) n’est pas utilisée pour l’interprétation des résultats d’échantillons.
Interprétation des résultats
Cible MB
(fluorophore FAM™)
Cible IPC endogène
(fluorophore VIC™)
Ct < 45
Ct > 45
Ct > 45
Ct < 45 ou Ct > 45
Ct < 45
Ct > 45
Interprétation
M. bovis est détectée.
M. bovis n’est pas détectée.
Résultat invalidé.
Retester les échantillons ayant des résultats invalidés
Remarque : Pour les échantillons de semences sexuées, un IPC négatif peut résulter en raison du faible nombre de cellules dans les
™
™
échantillons. Si cela se produit, un IPC exogène, comme VetMAX Xeno Internal Positive Control DNA, peut être utilisé comme test
™
indépendant pour surveiller la présence d’inhibition de la PCR. Pour plus d’informations sur l’utilisation d’un IPC Xeno dans votre expérience,
™
™
contacter le support technique ou consulter l’un des guides de l’utilisateur suivants : Guide de l’utilisateur du test et de l’IPC VetMAX Xeno
™
Voir (pub. n° MAN0014500) ou Protocole du VetMAX -Plus qPCR Master Mix (pub. n° 4426032).
1. Diluer les échantillons d’ADN au 1:10 dans un tampon TE 1X.
2. Recommencer la procédure de PCR temps réel avec 5 µl de
Interprétation
Résultat
l’ADN dilué, puis interpréter les résultats comme suit.
L’ADN dilué est positif pour M. bovis.
3. Pour les échantillons dilués dont les résultats ne sont pas
Le résultat est validé.
L’ADN dilué est négatif pour M. bovis, et le
valides, répéter la procédure d’extraction de l’ADN en utilisant
résultat IPC est conforme.
l'échantillon pré-dilué au 1:2 dans du tampon PBS 1X. Si
L’ADN dilué est négatif pour M. bovis, mais le
Le résultat n’est pas validé.
le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur une
résultat IPC n’est pas conforme.
nouvelle aliquote du lysat de l’échantillon original.
Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et
la RT-PCR
• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres.
– Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux
précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés
ou préparer des échantillons.
• Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à
leur contamination possible.
• Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et
des fournitures dédiés pour les étapes suivantes :
– Préparation des échantillons et configuration de la réaction.
– Amplification et analyse des produits.
• Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR
de la réaction.
• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter
toute projection ou création d’aérosols.
• Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure
du possible.
• Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant
aux aérosols.
• Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de
laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une
solution de décontamination ADN.
Assistance à la clientèle et support technique
Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les
plus récentes sur les services et le support.
• Numéros de téléphone de contact internationaux
• Informations sur le support produit
– FAQ relatives aux produits
– Logiciels, correctifs et mises à jour
– Formations sur de nombreux instruments et applications
• Commandes et assistance en ligne
• Documentation produit
– Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
– Certificats d’analyse
– Fiches de données de sécurité (FDS)
Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs
et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces
derniers.
Garantie limitée du produit
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur
le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact
avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support.
™
Notice d’utilisation du VetMAX M. bovis Kit
3
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France
Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition.
Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0008809 C.
Historique des révisions : Pub. nº MAN0008809 C
Révision
Date
C
9 avril 2025
Des semences ont été ajoutés comme type d’échantillon.
Description
B.0
5 mai 2017
Le document a été mis à jour à la matrice actuelle, avec les mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux
logos.
A.0
24 mars 2014
Nouveau document pour VetMAX M. bovis Kit.
™
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE
TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À
SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les
conditions générales de toutes les licences à usage limité.
©2014-2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication
contraire.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
24 juillet 2025
">