Thermo Fisher Scientific VetMAX African Swine Fever Virus Mode d'emploi

NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ African Swine Fever Virus Detection Kit
TaqMan™ PCR en temps réel pour la détection du virus de la peste porcine
africaine
Référence catalogue A28809
N° de document 100027917
Pub. nº MAN0019541 Rév. B
Technique
PCR temps réel (ADN)
• Essais en duplex
• IPC exogène
Espèces
Échantillons
Type de test
Porcins
Sang
Sérum
Tissus
Individuel
ou en mélange (5 ou 10 échantillons)
Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité
(FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter
des lunettes de protection, des gants et des vêtements
appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS)
sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/
support.
Description du produit
™
™
Le Applied Biosystems VetMAX African Swine Fever Virus Detection
Kit (N° Cat. A28809) permet de détecter le virus de la peste porcine
africaine (PPA) dans le sang, le sérum ou les tissus porcins par
amplification PCR temps réel du gène P72 de la PPA.
L’analyse est une PCR temps réel monopuits dans laquelle les cibles
PPA et le contrôle positif interne (IPC) exogène sont amplifiés et
™
détectés à l’aide de sondes fluorescentes TaqMan .
Le kit comprend :
™
• 3 - Mix ASFV : contient des amorces, des sondes TaqMan ,
un tampon et une enzyme pour une amplification optimisée en
duplex par PCR temps réel des cibles PPA et IPC.
• 4a - EPC ASFV : matrice d’acide nucléique pour amplification de
cible P72. Elle sert de contrôle positif externe pour la réaction
PCR temps réel et est utilisée pour définir le cycle seuil (Ct) afin
d’évaluer les résultats des tests.
• 5 - IPC ASFV : contrôle positif interne ajouté à chaque échantillon
et contrôle lors de l’étape de lyse de la procédure d’extraction
de l’ADN. Il sert de contrôle pour le processus de purification de
l’ADN et permet de surveiller la présence d’inhibiteurs de la PCR.
Matériels requis non fournis
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur
fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de
laboratoire.
Élément
Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR System
Plaques à 96 puits, tubes de barrettes (à 8 ou
12 puits), microtubes ou capillaires compatibles avec le
thermocycleur utilisé
Pipettes sans nucléase et embouts de pipettes à filtre
Deux bacs de glace ou portoirs réfrigérants :
• Un pour la zone de configuration de la PCR dans
laquelle le master mix PCR est préparé
• Un pour la zone dans laquelle les échantillons d’ADN
et les contrôles sont préparés
Couvercles pour plaques ou bouchons compatibles avec
les plaques, les tubes de barrettes, les microtubes ou les
capillaires
Tubes de réactifs sans nucléase pour préparer le master
mix
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)
1X TE Buffer
Composant
Quantité[1]
Conservation[2]
2 × 1000 µl
2 × 90 µl
1 × 500 µl
–30°C à –10°C
[1] Suffisant pour 100 réactions PCR temps réel de 25 µl.
[2] Se référer à l’emballage pour la date de péremption.
PFL
PFL
PFL
PFL
PFL
AM9939
PFL
Instructions
• Pour chaque test de PCR temps réel, inclure les contrôles
indiqués à l’étape “Préparer les réactions PCR” en page 2.
• Respecter les “Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR
et la RT-PCR” en page 3 pour éviter les faux positifs et la
contamination des échantillons testés par des produits de PCR.
Contenu et conservation
3 – Mix ASFV
4a – EPC ASFV
5 – IPC ASFV
Source
Contacter votre
représentant
commercial local.
Exigences concernant l’ADN
™
Nous recommandons l’utilisation du MagMAX Pathogen RNA/DNA
Kit (N° Cat. 4462359) pour la purification d’ADN à partir d’échantillons
biologiques, mais vous pouvez également utiliser d’autres méthodes
de purification d’ADN de haute qualité après validation appropriée
dans votre laboratoire. De plus, préparer des échantillons témoins
avec de l’eau sans nucléase comme matériel de départ. Utiliser
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
la même méthode de purification d’ADN que pour les échantillons
testés.
IMPORTANT ! Ajouter 5 µl de 5 – IPC ASFV à la solution Lysis
utilisée pour la purification d’ADN pour chaque échantillon et contrôle
d’extraction.
Avant de commencer
1. Décongeler les réactifs et échantillons :
a. Décongeler 3 – Mix ASFV dans un bac de glace ou un portoir
réfrigérant.
b. Décongeler 4a – EPC ASFV, 5 – IPC ASFV et les échantillons
d’ADN dans un bac de glace ou un portoir réfrigérant différent.
2. Homogénéiser le contenu de chaque tube en le vortexant, puis
centrifuger brièvement.
Stocker les réactifs, les contrôles et les échantillons décongelés à 2 –
8°C jusqu’à utilisation.
Configurer et démarrer l’instrument PCR temps
réel
1. En suivant les instructions du fabricant, configurer le test de PCR
temps réel à l’aide des paramètres suivants.
• Volume réactionnel : 25 µl
™
• Référence passive : fluorophore ROX (inclus dans
3 – Mix ASFV)
™
Remarque : le fluorophore ROX est à renseigner
obligatoirement si l’instrument est capable de le détecter.
Les instruments de PCR temps réel qui ne détectent pas
™
le fluorophore ROX peuvent être utilisés sans affecter
l’exactitude de la lecture.
• Sélectionner des détecteurs et attribuer des reporters de
™
sondes TaqMan et des quenchers pour chaque puits, tube
ou capillaire utilisé pour l’analyse.
Préparer les réactions PCR
1. Répartir 20 µl de 3 – Mix ASFV dans le nombre approprié
de puits de plaques PCR, de barrettes de tubes PCR ou de
capillaires utilisés.
2. Ajouter l’échantillon ou le contrôle conformément au tableau
suivant :
Type d’échantillon
Échantillon testé
Contrôle positif
Contrôle d’extraction
Contrôle négatif
d’amplification (NTC)
Échantillon d’ADN
4a – EPC ASFV
Échantillon témoin
Eau exempte de
nucléases
5,0 µl
5,0 µl
5,0 µl
5,0 µl
3. Sceller chaque plaque ou tube, mélanger, puis centrifuger
brièvement pour amener le contenu au fond des puits de plaque
ou des tubes.
Reporter
Quencher
PPA
IPC
Fluorophore FAM™
Fluorophore VIC™
Quencher non fluorescent (NFQ)
Fluorophore TAMRA™[1]
[1] Le fluorophore TAMRA™ est à renseigner obligatoirement pour l’analyse
PCR temps réel si l’instrument est capable de le détecter. Les instruments
de PCR temps réel qui ne détectent pas le fluorophore TAMRA™ peuvent
être utilisés sans affecter l’exactitude de la lecture.
• Programme du thermocycleur :
Volume par
réaction
Composant
Cible
Etape
Répétitions
Température
Durée
1
2
3
1
1
45
50°C
95°C
95°C
60°C
2 minutes
10 minutes
15 secondes
1 minute
2. Démarrer le programme de thermocycleur et récupérer les
données d’amplification en temps réel au cours de l’étape 3.
Consignes pour l’analyse des données
• Suivre le guide de l’utilisateur de l’instrument pour l’analyse des données brutes.
• Fixer les seuils pour chaque cible séparément.
• Interpréter les résultats de chaque contrôle et échantillon en fonction des valeurs Ct obtenues comme indiqué dans les sections suivantes.
Critères de validation
Se référer aux valeurs CtQC dans le certificat d’analyse du lot de fabrication du kit. Le test est validé si les critères suivants sont respectés :
Type de réaction
Cible PPA
(fluorophore FAM™)
Cible IPC
(fluorophore VIC™)
Interprétation
Contrôle positif
Contrôle d’extraction[3]
Contrôle sans acide nucléique (NTC)
Ct = CtQC PPA ± 3 Ct[1]
Ct > 45
Ct > 45
Ct < 45 ou Ct > 45[2]
Ct = CtQC IPC ± 3 Ct[4]
Ct > 45
La PCR est validée.
L’extraction de l’ADN est validée.
Les réactifs PCR sont validés.
[1] Voir le tableau EPC dans le certificat d’analyse.
[2] La valeur d’IPC de la réaction du contrôle positif n’est pas à prendre en compte pour la validation du test.
[3] Utiliser le contrôle d’extraction préparé avec la même procédure d’extraction que celle utilisée pour les échantillons.
[4] Voir le tableau IPC dans le certificat d’analyse.
Interprétation des résultats
Cible PPA
(fluorophore FAM™)
Cible IPC
(fluorophore VIC™)
Interprétation
Ct < 45
Ct > 45
Ct > 45
Ct < 45 ou Ct > 45
Ct = Ct du contrôle d’extraction ± 3 Ct [1]
Ct est en dehors de cette plage : Ct du contrôle d’extraction ± 3 Ct[1]
La PPA est détectée.
La PPA n’est pas détectée.
Résultat invalidé.[2]
[1] La valeur C du contrôle d’extraction doit d’abord être validée comme décrit dans le paragraphe “Critères de validation” en page 2.
t
[2] L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la valeur non conforme de l’IPC.
2
™
Notice d’utilisation du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit
Retester les échantillons ayant des résultats invalidés
1. Diluer les échantillons d’ADN au 1:10 dans un tampon TE 1X.
2. Recommencer la procédure de PCR en temps réel avec 5 µl de l’ADN dilué, puis interpréter les résultats comme suit.
Résultat
Interprétation
L’ADN dilué est positif pour la PPA.
L’ADN dilué est négatif pour la PPA, et le résultat IPC est conforme.
L’ADN dilué est négatif pour la PPA, mais le résultat IPC n’est pas conforme.
Le résultat est validé.
Le résultat est invalide.
3. Pour des échantillons dilués dont les résultats sont rendus invalides, recommencer la procédure d’extraction de l’ADN avec une nouvelle
aliquote du lysat de l’échantillon d’origine, puis répétez le test.
Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la
RT-PCR
• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres.
– Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux
précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés
ou préparer des échantillons.
• Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur
contamination possible.
• Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des
fournitures dédiés pour les étapes suivantes :
– Préparation des échantillons et configuration de la réaction.
– Amplification et analyse des produits.
• Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de
la réaction.
• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute
projection ou création d’aérosols.
• Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du
possible.
• Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant
aux aérosols.
• Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de
laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une
solution de décontamination ADN.
Certification de l’Organisation mondiale de la
santé animale (WOAH)
™
Notice d’utilisation du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit
Validé et certifié par la WOAH comme étant apte aux emplois prévus
dans cette notice. Numéro d’enregistrement : 20200114.
Assistance à la clientèle et support technique
Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les
plus récentes sur les services et le support.
• Numéros de téléphone de contact internationaux
• Informations sur le support produit
– FAQ relatives aux produits
– Logiciels, correctifs et mises à jour
– Formations sur de nombreux instruments et applications
• Commandes et assistance en ligne
• Documentation produit
– Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
– Certificats d’analyse
– Fiches de données de sécurité (FDS)
Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et
produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers.
Garantie limitée du produit
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs
produits selon les termes et conditions générales de ventes
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/
terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous
pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web
suivante : www.thermofisher.com/support.
3
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France
Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition.
Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0010783 D.
Historique des révisions : Pub. nº MAN0010783 D
Révision
Date
D
10 février 2025
Le logo de l’Organisation mondiale de la santé animale (WOAH) a été mis à jour.
Description
C.0
21 juillet 2020
Ajout du logo de l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) et du numéro d’enregistrement.
B.0
8 février 2018
• Mise à jour du modèle de document actuel, avec les mises à jour associées à la garantie, aux marques commerciales et
aux logos.
• Modifications mineures pour s’aligner sur le style actuel.
A.0
2 avril 2015
Base de référence pour l’historique des révisions.
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES
POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE
OU EN RÉSULTANT.
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générales de toutes les licences à usage limité.
©2015-2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication
contraire.TaqMan est une marque de Roche Molecular Systems, Inc., utilisée sous autorisation et licence.
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10 février 2025
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