NOTICE D’UTILISATION PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques du Virus de la Diarrhée Virale Bovine dans le sérum, le plasma et le lait de bovins (lait de tank) Référence Catalogue 7588940 Pub. Nº MAN0013808 Rév. C.0 AVERTISSEMENT! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Introduction Le virus de la diarrhée virale bovine (BVD) est un Pestivirus de la famille des Flaviviridae qui est présent dans le monde entier. Il provoque des avortements chez les vaches en gestation, ce qui entraîne des pertes économiques importantes pour les producteurs de lait. Les vaches gestantes infectées par la BVD transmettent l'infection au fœtus par passage transplacentaire du virus, et peuvent donner naissance à des veaux infectés permanents immunotolérants (ou IPI). Ces derniers sont une source continue de propagation du virus dans l'environnement, et ils contaminent ainsi les autres animaux du troupeau. Par ailleurs leur sérologie BVD est négative ou faiblement positive. Applied Biosystems™ PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit détecte les anticorps spécifiques de différentes souches du virus de la BVD (Ia, Ib et II) dans le sérum, le plasma et le lait (de tank). Il peut être utilisé pour diagnostiquer l'infection à BVD chez les animaux, individuellement ou à l'échelle du troupeau. La surveillance de l’infection à BVD est réalisée en prélevant 2 échantillons de sérum ou de plasma sur l'animal (à 4 semaines au moins d'intervalle) et en titrant les anticorps spécifiques. PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit est également un outil précieux pour le dépistage à grande échelle et les programmes d'éradication. Il peut servir par ailleurs (bien que cette utilisation ne soit pas entièrement validée) à identifier les anticorps spécifiques des Pestivirus dans le sérum de moutons et de porcs. Principe du test PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit utilise deux anticorps monoclonaux, l'un coaté dans les puits d'une microplaque, l'autre servant de conjugué. Les deux anticorps monoclonaux reconnaissent des épitopes différents de la protéine non structurale NS-3 du virus de la BVD (P80) qui est une protéine hautement conservée. Les prélèvements de sérum ou de plasma non dilués et les échantillons de lait sont d'abord incubés avec l'antigène inactivé du virus de la BVD dans la microplaque qui est ensuite lavée. Puis le conjugué est distribué dans les puits. Après incubation et lavage de la plaque, le substrat chromogène est ajouté et la plaque est à nouveau incubée. Le développement de la coloration est stoppé et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm afin de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifiques de la BVD. Composition du coffret Coffret de 5 plaques pour 440 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à la date d’expiration qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (ci-dessous). Composant Description 1 : Microplaque Cinq microplaques. 2 : Conjugué (30x) Concentré 30x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 2.5 mL de conjugué. 3 : Tampon de dilution (5x) Concentré 5x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 60 mL de tampon de dilution. Conservation du tampon de dilution 1x : 4 heures à 22±3°C. 4 : Antigène Lyophilisé. Cinq flacons contenant 6.0 mL d'antigène lyophilisé. Conservation de l’antigène reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C. 5 : Sérum de cheval Lyophilisé. Un flacon contenant 3.5 mL de sérum de cheval. Conservation du sérum de cheval reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C. 6 : Eau déminéralisée Un flacon contenant 10 mL d'eau déminéralisée. 7 : Solution de lavage (200x) Concentré 200x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 60 mL de solution de lavage. Conservation de la solution de lavage 1x : 1 semaine à 22±3°C. 8 : Sérum de contrôle 1 Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de sérum de contrôle 1. 9 : Sérum de contrôle 2 Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de sérum de contrôle 2. 10 : Sérum de contrôle 3 Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de sérum de contrôle 3. 11 : Lait de référence 1 Prêt à l’emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de lait de référence 1. 12 : Lait de référence 2 Prêt à l’emploi. Un flacon contenant 1.0 mL de lait de référence 2. 13 : Substrat chromogène (TMB) Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de substrat chromogène (TMB). 14 : Solution d'arrêt Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de solution d'arrêt. Autres composants du coffret • Notice d'utilisation • 10 films adhésifs pour couvrir les plaques Equipement nécessaire mais non fourni Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. Use Général Description Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales. Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. Analyse des résultats Lecteur de microplaques : Multiskan EX ou équivalent. Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire les plaques à 450 nm. Optionnel Laveur de microplaques. Mode opératoire Précautions • Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte. • PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit ne doit être réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela. • Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être considéré comme potentiellement contaminé. Remarques Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit, les précautions suivantes doivent être prises : • Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi. • Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C) avant utilisation. • L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé. • Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif. • Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de péremption ou si un changement dans leur aspect est observé. • Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests. Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau équivalente. Solutions à préparer à l'avance Tampon de dilution 1x Le tampon de dilution (5x) (Composant 3) doit être dilué au 1:5 avec de l'eau déminéralisée (1 volume de tampon de dilution + 4 volumes d'eau déminéralisée). Le tampon de dilution 1x peut être conservé 4 heures à 22±3°C. Antigène Amener le flacon à 22±3°C et reconstituer l'antigène (Composant 4) avec 6.0 mL le volume indiqué de tampon de dilution 1x. L'antigène reconstitué peut être conservé en aliquot de 1.0 mL à −20°C jusqu’à la date de péremption. Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante : 1. Ramener le flacon à T° ambiante (22±3°C). 2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon. 3. Ouvrir le flacon. 4. Ajouter la quantité indiquée d'eau déminéralisée ou de tampon de dilution (voir l'étiquette du flacon). 5. Reboucher le flacon et laisser le lyophilisat.se dissoudre. 6. Agiter doucement le flacon jusqu'à dissolution complète du lyophilisat. 7. Laisser le flacon reposer au moins 15 minutes à 22±3°C avant utilisation. 8. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la formation de mousse). Sérum de cheval Amener le flacon à 22±3°C et reconstituer le sérum de cheval (Composant 5) avec 3.5 mL le volume indiqué d'eau déminéralisée. Le sérum de cheval reconstitué peut être conservé à −20°C. Tampon du conjugué Ajouter 1 volume de sérum de cheval reconstitué à 19 volumes de tampon de dilution. Par exemple, pour une plaque, préparer 12 mL (ajouter 0.6 mL de sérum de cheval reconstitué à 11.4 mL de tampon de dilution 1x). Le tampon du conjugué peut être conserve 4 heures à 22±3°C. Dilution du conjugué Diluer le conjugué (30x) (Composant 2) au 1:30 dans du tampon de conjugué; par exemple pour une plaque, préparer 12 mL (ajouter 400 µL de conjugué (30x) à 11.6 mL de tampon de conjugué). Note : Le conjugué dilué doit être préparé juste avant l’utilisation. Solution de lavage Diluer la solution de lavage (Composant 7) au 1:200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité fournie de solution de lavage permet de préparer un volume final de 12 litres. Stabilité de la solution de lavage 1x : 1 semaine à 22±3°C. Remarque : Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques peut être fait manuellement avec 200 µL de solution de lavage par puits. Puis vider les plaques et répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est pas utile d'égoutter les plaques sur du papier absorbant entre les lavages. Les tapoter fermement après le dernier cycle de lavage. Remarque : Voir Annexe B pour la préparation et la conservation des échantillons. Incubation des échantillons, de l'antigène et du conjugue 1. Distribuer 100 µL de tampon de dilution 1x dans les puits A1 et B1 (= DO450 blanc). 2. Ajouter 50 µL de l’échantillon de référence approprié dans les puits indiqués dans le tableau suivant. Réactif Puits Type d’échantillon : sérum ou plasma Sérum de référence 1 (composant 8) C1 et D1 (=DO450 max) Sérum de référence 2 (composant 9) E1 et F1 Sérum de référence 3 (composant 10) G1 et H1 Type d’échantillon : lait (individuel ou tank) Lait de référence 1 (composant 11) C1 et D1 (=DO450 max) Lait de référence 2 (composant 12) E1 et F1 3. Déposer 50 µL de chaque échantillon dans les autres puits. 4. Distribuer 50 µL d'antigène BVD reconstitué dans tous les puits sauf dans les puits A1 et B1. 5. Couvrir la plaque (Composant 1) avec un film adhésif et les agiter doucement. 6. Incuber la plaque 60±5 minutes à 22±3°C. 7. Vider la plaque et la laver 6 fois avec la solution de lavage dilué. La tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. 8. Distribuer 100 µL de la dilution du conjugué fraîchement préparée dans tous les puits. 9. Couvrir la plaque avec un film adhésif et les incuber 1 heure à 60±5 minutes à 22±3°C. Incubation avec le substrat chromogene (TMB) 1. Vider la plaque et la laver 6 fois avec la solution de lavage dilué. La tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. 2. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) (Composant 13) dans tous les puits. 3. Incuber les plaques 15 minutes à 22±3°C. 4. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 14) dans tous les puits. 5. Homogénéiser le contenu des puits. Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes après avoir déposé la solution de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits. Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB). Lecture du test et calcul des résultats 1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la solution d'arrêt. 2. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 et B1 (= DO450 blanc). 3. Calculer la DO450 corrigée de tous les échantillons en soustrayant la DO450 blanc. 4. Calculer la DO450 moyenne des puits C1 and D1 (= DO450 max). 5. Calculer le pourcentage d’inhibition (PI) des échantillons de référence et des échantillons à tester dans les puits E1 à H12 en utilisant la formule suivante. La DO450 de chaque échantillon est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par rapport à la DO450 max : PI = 100 − (DO450 de l'échantillon corrigée / DO450 max corrigée) × 100 2 Interprétation des résultats Validation des critères 1. La DO450 blanc moyenne (puits A1 et B1) doit être <0.150. 2. La moyenne corrigée de la DO450 max (puits C1 et D1) doit être ≥ 1,000 pour le sérum de référence 1 ou ≥ 0,800 pour le lait de référence 1. 3. Le PI du sérum de contrôle 2 doit être >50. 4. Le PI du sérum de contrôle 3 doit être <50. 5. Le pourcentage d’inhibition du lait de référence 2 doit être >30. Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont ininterprétables. Remarque : Si la DO450 max est inférieure à 1.000, la solution de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber plus longtemps les barrettes (sans dépasser 30 minutes d'incubation). Interprétation du pourcentage d'inhibition Echantillons de sérum et de plasma PI = <50% Négatif Absence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement. PI = ≥50% Positif Présence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement. Pour le titrage des anticorps dans le sérum ou le plasma, le titre des anticorps est défini comme l'inverse de la plus grande dilution donnant un PI ≥50%. Le diagnostic d'infection transitoire à BVD est posé lorsque, sur deux échantillons prélevés à la phase aiguë et à plus de quatre semaines d'intervalle, le titre des anticorps passe d'indétectable à détectable ou si le titre des anticorps est multiplié par quatre entre les 2 prélèvements. Echantillons de lait PI = <30% Négatif Absence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement. PI = ≥30% Positif Présence d'anticorps spécifiques de la BVD dans le prélèvement. Disposition recommandée de la microplaque La disposition suivante permet un ajout efficace des échantillons et témoins pré-dilués dans la microplaque (B : solution de tampon de dilution préparée préalablement ; R1 : Référence 1 ; R2 : Référence 2 ; R3 : Référence 3 [facultatif] ; E : Échantillon). Tableau 1 Dispositions de plaque : Microplaque 1 2 3 4 5 6 7 A B E E E E E E B B E E E E E E C R1 E E E E E E D R1 E E E E E E E R2 E E E E E E F R2 E E E E E E G R3 ou S E E E E E E H R3 ou S E E E E E E 8 E E E E E E E E 9 E E E E E E E E 10 E E E E E E E E 11 E E E E E E E E 12 E E E E E E E E Annexe A – Références bibliographiques 1. Deregt D and Loewen KG (1995). Can Vet J 36:371−378. 2. Kramps JA, Van Maanen C, Van de Wetering G, Stienstra G, Quak S, Brinkhof J, Ronsholt L, Nylin B (1999). Vet Microbiol Jan. 64(2-3):135−144. 3. Paton DJ, Ibata G, Edwards S, Wensvoort G (1991). J Vir Meth 31:315−324. Annexe B – Préparation et conservation des échantillons Lait Sérum et plasma • Avant d'être testés, les échantillons de lait doivent être dégraissés par centrifugation 15 min. à 1000 × g. Utiliser une pipette pour prélever l'échantillon sous la couche de crème du lait. Plutôt que de centrifuger les échantillons de lait, on peut également les garder 16 heures au réfrigérateur. • Les échantillons de lait dégraissés peuvent être conservés à −20°C avant d'être testés. • Les échantillons de sérum et de plasma peuvent être conservés à −20°C avant d'être testés. • Les échantillons de sérum et de plasma peuvent être titrés avec PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit. Préparer pour cela des dilutions de 2 en 2 (1:10 à 1:1280) en tampon de dilution. • Les échantillons de sérum ou de plasma fraîchement collectés peuvent, occasionnellement, donner des résultats faiblement positifs (faux positifs). Ce phénomène peut être évité en congelant et décongelant une fois les prélèvements ou par inactivation 30 minutes à 56°C. Service clientèle et assistance technique Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment : • Numéros de téléphone partout dans le monde • Commande et Support web • Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles • Certificats d’analyse • Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques)) Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant. PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit Notice d’Utilisation Garantie produit limitée Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support. Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Historique des révisions : Pub. N° MAN0013808 (français) Rév. Date Description C.0 B.0 1er novembre 2022 • Les critères de validation du sérum de référence 1 et du lait de référence 1 ont été mis à jour. 11 mars 2022 • Le lait de référence 1 et le lait de référence 2 ont été ajoutés au document (voir Composants du kit, Procédure de test et Interprétation des résultats). • La disposition recommandée de la microplaque a été ajoutée au document. • Nouveau document. Conversion effectuée du document existant (PrioCHECK BVDV Ab 7588940 v1.0_f.doc) sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées aux informations A.0 24 juillet 2019 de licence limitée, à la garantie, aux marques et aux logos. • Changement du nom du kit de PrioCHECK® BVDV Ab en PrioCHECK™ Bovine BVDV Ab Plate Kit. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2022 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 1er novembre 2022 ">
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