Thermo Fisher Scientific BOVIGAM TB Kit Mode d'emploi

BOVIGAM™ TB Kit
NOTICE D’UTILISATION
Mode opératoire simplifié pour son utilisation en France selon les
recommandations du laboratoire contrôle
Référence catalogue 63326
Numéro de publication MAN0030314
Révision A
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands
Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition.
Historique des révisions : MAN0030314 A
Révision
Date
Description
A
14 février 2025
Création du MAN030314 basé sur le document "Mode opératoire simplifié du Bovigam TB kit du
26 Octobre 2023, révision D.0".
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
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sauf indication contraire.
©2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés.
Validé et certifié par le WOAH comme étant adapté aux fins définies dans la notice fournie dans kit.
Numéro d'enregistrement : 20150110.
Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France
Applied Biosystems™ BOVIGAM™ TB Kit est un test sanguin rapide in vitro basé sur la détection de la
réponse immunitaire à médiation cellulaire suite à une infection due à Mycobacterium bovis (ou M. caprae
ou M. tuberculosis) pour le diagnostic de la tuberculose chez les bovins.
A – Contenu et stockage du BOVIGAM™ TB Kit – Réf.: 63326
Conserver le kit Applied Biosystems™ BOVIGAM™ TB à une température comprise entre 2 et 8 °C
Laisser tous les réactifs (sauf le conjugué - concentré 100x) à température ambiante (22±3 °C) avant
leur utilisation, puis les reconserver à 2-8 °C immédiatement après utilisation.
Composant
Format 30
plaques
Description
1- Plaque sensibilisée avec
l’anticorps IFN-γ bovins
30x96 plaques
avec couvercle
Prêt à emploi
2- Contrôle positif IFN-γ bovins
3x 2mL
Contient 0.01% p/v de thimérosal. Lyophilisé. A
reconstituer avec de l'eau déionisée ou distillée.
3- Contrôle négatif IFN-γ bovins
3x2mL
Contient 0.01% p/v de thimérosal. Lyophilisé. A
reconstituer avec de l'eau déionisée ou distillée.
4- Diluent « Green »
1x175mL
Contient 0,01 % p/v de thimérosal. Prêt à l'emploi.
5- Tampon de lavage (20X)
2x500mL
Contient 0,01 % p/v de thimérosal. A diluer avec
de l'eau déionisée ou distillée.
2x2mL
Contient 0.01% p/v de thimérosal. Lyophilisé. A
reconstituer avec de l'eau déionisée ou distillée.
2x 175mL
Contient 0,01 % p/v de thimérosal. A diluer avec
de l'eau déionisée ou distillée.
2x175mL
Contient de l’eau. Prêt à l'emploi.
2x2mL
Contient du TMB dans du DMSO. A diluer avec le
tampon de substrat enzymatique
1x175mL
Prêt à emploi
« Positive Bovine IFN-γ Control »
« Negaitive Bovine IFN-γ Control »
« Green Diluent »
« Wash Buffer – 20X Concentrate »
6- Conjugué (100X )
« Conjugate – 100X Concentrate »
Anti-IFN-γ bovin marqué à la
peroxydase de raifort
7- Diluent « Blue »
« Blue Diluent »
Tampon de dilution du conjugué
8- Solution de substrat enzymatique
« Enzyme Substrate Buffer »
9- Solution Chromogène (100X)
« Chromogen Solution -100X concentrate »
10- Solution de révélation
"Enzyme Stopping Solution”
0.5M H2SO4
Les instructions de préparation sont en partie E-2&3
3/9
MAN0030314, Révision A
Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France
B – Documents complémentaires nécessaires
Document
Information nécessaire
Certificat de vérification du lot du kit Bovigam
Dilution du Contrôle positif à réaliser
Certificat du MRC
Pourcentage de positivité attendu
Instructions françaises en vigueur
Exemple: Critères d’interprétations
sévères/intermédiaires
C – Matrice
Un prélèvement de sang de 10 mL minimum pour chaque animal dans un tube de prélèvement sanguin
contenant de l'héparine (héparine de lithium de type CML VF109SHL ou autres) comme anticoagulant est
nécessaire.
Note : Le sang au moment du prélèvement doit être mélangé doucement par plusieurs retournements du
tube pour dissoudre l'héparine.
Les échantillons de sang doivent être transportés au laboratoire à température ambiante (T°C ambiante =
21 ± 5°C) en évitant les extrêmes. Il est recommandé d’effectuer la stimulation dans les 6 à 8 h maximum
suivant le prélèvement. En aucun cas, le sang ne doit être conservé au réfrigérateur ni au congélateur.
D – Réactifs nécessaires
Phase
expérimentale
Nom réactif / kit
Référence
produit
Recommandation de préparation et de
conservation
BOVIGAM™ Tuberculin PPD
Stimulating Antigen, bovine
(30,000 I.U./mL)_7600060
7600022
Conservation : à 2-8°C, ne pas congeler
Préparation : Dilution au 1/9 extemporanément (110
µL PPD A ou B dans 890 µL de RPMI ou PBS)
BOVIGAM™ Tuberculin PPD
Stimulating Antigen, avian
(25,000 I.U./mL)_7600065
Stimulation
en plaque de
culture
cellulaire
BOVIGAM™ Pokeweed Mitogen
(flacon de 3.2 mg)
5108777
Reconstituer avec 64 mL de RPMI ou PBS
Conserver à température ≤ −16°C
BOVIGAM™ PC-EC Stimulating
Antigen (lyophilisé)
7600100
Reconstituer avec 3 mL d’eau déionisée ou distillée.
Note : après reconstitution et aliquotage, conserver à
-80°C
Pour plus de détails MAN0017011
RPMI-1640 Medium with sodium
bicarbonate, without L-glutamine,
liquid, sterile-filtered, suitable for
cell culture
31870017
Non applicable
Sterile phosphate buffered salinePBS: (0.01M, pH 7.2)
20012027
Non applicable
Plaques de culture cellulaire
ELISA
4/9
Plus de détails sur les MAN0017035 et
MAN0017038
Applied Biosystems™
BOVIGAM™ TB Kit
(format 30 plaques)
De type Dutscher 353072 ou VWR 39 13 325 ou TPP 92096
63326
Cf partie « Préparation des réactifs ELISA »
Conserver le kit ELISA à 5 ± 3°C
MAN0030314, Révision A
Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France
E – Protocole simplifié
Collecter le sang en tube contenant de l’héparine
(moins de 8 h avant stimulation)
Stimulation en plaque de culture cellulaire
(20-24 h à 37 ± 2°C) *cf note page 6
Centrifugation et récupération du plasma
(10 min à 500 g)
ELISA
Mettre à T°C ambiante les réactifs sauf le conjugué à garder au réfrigérateur
Préparer les réactifs ELISA selon les recommandations du paragraphe 2 de cette
notice
Analyse
Note : L’analyse peut être réalisée avec un unique réplicat, cependant la réalisation d’un duplicat est
conseillée et permet une meilleure reproductibilité.
1 – Stimulation en plaque de culture cellulaire
Avant de réaliser la stimulation, veiller à amener les réactifs à T°C ambiante et à les mélanger soigneusement
avant utilisation. Après utilisation les remettre immédiatement à température recommandée.
Proposition de plan de plaque pour un test en réplicat unique :
Ligne/colonne
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A
1N
1A
1B
1M
1PW
CN
9N
9A
9B
9M
9PW
B
2N
2A
2B
2M
2PW
CN
10N
10A
10B
10M
10PW
C
3N
3A
3B
3M
3PW
CN
11N
11A
11B
11M
11PW
D
4N
4A
4B
4M
4PW
CP dil
12N
12A
12B
12M
12PW
E
5N
5A
5B
5M
5PW
CP dil
13N
13A
13B
13M
13PW
F
6N
6A
6B
6M
6PW
CP dil
14N
14A
14B
14M
14PW
G
7N
7A
7B
7M
7PW
Traceur
15N
15A
15B
15M
15PW
H
8N
8A
8B
8M
8PW
Traceur
16N
16A
16B
16M
16PW
Réactifs « Stimulateur » : N = Nil Antigen (RPMI ou PBS) / A = PPD Aviaire / B = PPD Bovine / M = Mix
Cocktail de peptide PC-EC / PW = Pokeweed
Pour l’ELISA : CN = Contrôle Négatif (ELISA) / CP = Contrôle Positif (ELISA) / Traceur = matériel de
référence « MRC » pouvant être fourni par le laboratoire de référence
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MAN0030314, Révision A
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Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France
Agiter doucement les tubes de sang héparinés pendant 1 à 3 minutes
(agitateur rotatif fortement recommandé)
Note : Sur une paillasse différente de celle où les réactifs propres sont distribués, ou agiter
postérieurement
Distribuer 25 µL de chaque réactif (N/A/B/M/Pw) selon le plan ci-dessus dans la plaque de culture
Distribuer 250 µl d’échantillon de sang par puits selon le plan de plaque (ex : éch. 1 en A1 à A5)
Couvrir la plaque et homogénéiser à l’aide d’un agitateur de plaque 5 à 10 minutes à une vitesse
équivalente à 600 rpm
Incuber 20 à 24 heures* à 37 ± 2°C dans une boite humide fortement recommandé
Centrifuger à 500 g pendant 10 minutes à T°C ambiante
Transférer le plasma dans une nouvelle plaque identifiée.
Conservation: 3 jours maximum à 5 ± 3°C, au-delà à une température ≤ −16°C
Note : Si un duplicat a été réalisé, les plasmas peuvent être poolés puis testés sur 2 puits lors de l’ELISA.
*Possibilité de faire une incubation au minimum de 16h : Seulement si les conditions d’incubation des
plaques à 37°C sont maintenues pendant toute la période d’incubation. Toute évaporation doit être évitée.
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MAN0030314, Révision A
Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France
2 – Préparation des réactifs ELISA Avant et pendant l’ELISA
Réactif
Préparation
Conservation et recommandations
Contrôles
positifs et
négatifs
Reconstituer les flacons appropriés avec
2 mL d'eau déionisée ou distillée.
Ensuite, le contrôle positif doit être
dilué selon le certificat qualité établi
suite à la vérification du kit.
Assurer une solubilisation complète.
Conservation des contrôles reconstitués à 5 ±
3°C jusqu'à 3 mois.
Diluant
« Green »
Utiliser de façon non diluée comme
tampon de dilution du plasma.
Amener à T°C ambiante et mélanger
soigneusement.
Conjugué (100X)
Pour préparer la solution « mère » de
Assurer une solubilisation complète sans le
conjugué concentré 100X reconstituer vortexer avec une agitation douce. Le mélange
(si possible la veille des analyses) le doit être effectué avec un minimum de mousse
lyophilisat avec 2 mL d'eau déionisée ou
(risque de dénaturation).
Conserver la solution mère reconstituée
distillée.
Pendant les lavages de l’ELISA une
immédiatement à 5 ± 3°C en continu et à
dilution au 1/100e dans du tampon Blue
utiliser dans les 3 mois suivant la
sera à réaliser (~5 min avant utilisation).
reconstitution.
Tampon de
lavage (20X)
Amener la solution mère à température
ambiante pour dissoudre les cristaux.
Ensuite, diluer au 1/20e avec de l'eau
déionisée ou distillée
La solution 20X doit être conservée à 5 ± 3°C
et celle à 1X à T°C ambiante pour une
utilisation sur la journée ou à 5 ± 3°C jusqu’à 2
semaines. Bien remettre à température
ambiante avant utilisation.
Solution de
substrat
enzymatique
Amener le tampon de substrat
enzymatique et la solution de
chromogène concentrée 100X à T°C
ambiante. Bien les mélanger.
Pendant les lavages de l’ELISA une
dilution au 1/100e du chromogène est à
réaliser : ajouter 0,12 mL de solution
chromogène (pour 96 puits par
exemple) dans 11,880 mL de solution
de substrat enzymatique. Utiliser ce
mélange dans les 10 min suivant la
préparation.
Si possible, utiliser des récipients jetables en
plastique polypropylène stérilisés par
irradiation pour préparer la solution de substrat
enzymatique. La solution de substrat
enzymatique doit être complètement mélangée
et doit être incolore. Si une coloration bleue
apparaît, la solution de substrat doit être
éliminée.
Diluer le MRC selon les
recommandations de son certificat.
Se référer aux recommandations fournies par
le laboratoire de référence.
Solution
Chromogène
(100X)
Traceur (MRC)
Notes : Ne pas utiliser de récipients ou de pipettes en polystyrène. Toute verrerie utilisée avec les réactifs du
substrat enzymatique doit être soigneusement rincée avec du H2SO4 ou du HCI 1N, suivi d'au moins trois
lavages à l'eau déionisée ou distillée, en veillant à ce qu'il ne reste aucun résidu d'acide sur la verrerie.
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Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France
3 – ELISA
Avant l’ELISA, placer les réactifs à T°C ambiante (au moins 30 min à 1 h) avant utilisation, à l’exception du
conjugué à garder à 5 ± 3°C après reconstitution.
Dans une plaque : Distribuer 50 µL de diluant « Green » par puits
(selon le plan de plaque du paragraphe 1)
Ajouter dans les puits, selon le plan de plaque, 50 µL de chaque échantillon préalablement stimulé, et
les témoins (contrôles kit et MRC)
Couvrir et incuber à T°C ambiante pendant 60 ± 5
min., sous agitation (600 rpm) recommandée
Préparer la solution de lavage : dilution au
1/20e dans de l’eau déionisée/distillée
Réaliser au laveur 2 séries de 3 lavages
(Ajouter 300 µL/puits de solution de lavage au 1/20e)
Conseils : Temps d'attente de 15 secondes entre chaque plaque et de 1 à 2
minutes entre les 2 séries en ayant retourné la plaque à 180° sur le laveur
Préparer le conjugué :
dilution au 1/100e la solution
mère dans le diluant "Blue" et
bien mélanger
Distribuer immédiatement 100 µL/puits du conjugué
Couvrir et incuber à T°C ambiante pendant 60 ± 5min, sous agitation (600 rpm) recommandée
Réaliser au laveur 2 séries de 3 lavages comme
précédemment (Entre chaque rinçage, bien vider la plaque par
retournement sec pour éliminer toute trace de conjugué.)
Préparer la solution de révélation
en diluant la solution chromogène au
1/100e dans le tampon de substrat
enzymatique (dans les 10 minutes
avant utilisation)
Distribuer 100 µL/puits de la solution de révélation fraichement préparée
Incuber à T°C ambiante (étuve à 21 +/- 5°C par exemple) pendant 20 à 30 min
à l’obscurité sans agitation et sans film
Note : si les contrôles montrent une forte coloration, la réaction peut être arrêtée après 20 minutes. Si la coloration
des contrôles est faible, la réaction peut être continuée jusqu'à 30 minutes.
Distribuer 50 µL/puits de la solution d’arrêt enzymatique
Lire la DO de chaque plaque à 450 - 620 nm
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MAN0030314, Révision A
Mode opératoire simplifié du BOVIGAM™ TB Kit pour son utilisation en France
F – Critère de validation de la plaque
• Contrôle négatif IFN-γ bovin : moyenne des DO < 0.130 avec une variation < 0.040 entre les
différentes valeurs de CN.
• Contrôle positif de l'IFN-γ bovin dilué (selon les recommandations du certificat de vérification du kit
Français établi suite à la vérification de celui-ci) : moyenne des DO > 0.550 avec un écart entre les
différentes valeurs de DO du CP ≤ à 30 % de la DO attendue.
• Si un traceur (MRC) est fourni par le laboratoire de référence : moyenne des DO puis calcul du
pourcentage de positivité : % Réf. = [(DO MRC - DO CN)/ [3* (DO CP dilué - DO CN)]*100
o Pour la justesse, suivre les recommandations notifiées dans le certificat du MRC établi par
le LNR.
o Pour la reproductibilité, suivre votre carte de contrôle.
 Si l'un ou l'autre des critères ci-dessus n'est pas respecté, l’ELISA n'est pas validé et doit être répété.
G – Calculs et critères d’interpretation des échantillons
Si des réplicats ont été réalisés, calculer la moyenne pour chaque condition de stimulation.
• Nil Control Antigen (RPMI ou PBS) : DO < 0.300
Si le PBS n’est pas valide le résultat de l’échantillon est dit « Ininterprétable ».
• Pokeweed mitogen : DO > 0.500
Si la DO du Pokeweed est inférieur ou égal à 0.500, vérifier les calculs des rapports ci-dessous.
Si les valeurs des rapports PPD, PPD B et Mix :
o sont trouvées positives, l’échantillon est interprété « Positif ».
o sont trouvées négatives et amenant à une interprétation finale négative, l’échantillon
est « Ininterprétable ».
Rapport PPD à calculer par échantillon :
*
**
Rapport
Calcul
Négatif
Positif
Positif fort
PPD
PPD Ech = (PPD B Ech - PPD
A Ech)/ (3*( CP dilué - CN))
< 0.05
≥ 0.05
≥ 0.3
PPD B
PPD B Ech= (PPD B EchPBS Ech)/ (3* (CP dilué - CN))
≤ 0.7
> 0.7
Non applicable
Mix « Cocktail de
Peptide » PC/EC
Mix Ech= (Mix Ech - PBS
Ech)/(3*(CP dilué-CN))
< 0.03
> 0.03
≥ 0.1
Calcul* : pour tout test réalisé en duplicat, utiliser la moyenne des valeurs
Positif fort** : Critère qui n’est actuellement pas utilisé pour l’interprétation réglementaire
Important
Ces critères d’interprétation dépendent des instructions réglementaires françaises et
peuvent être modifiés. Il en est de même pour les critères d’interprétation dite « Sévère »
ou « Intermédiaire » (non présentés).
Veuillez suivre les mises à jour de ces instructions données par la DGAL.
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BOVIGAM TB Kit_cover_MAN0030314-v2-GUID-D752142A-87F0-477FAA69-16B35DBD47CE-2024/04/29 20:18:06 fr
17:03:54.007-05:00
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
14 février 2025
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