NOTICE D’UTILISATION PrioCHECK™ Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit ELISA pour la détection des anticorps contre Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis dans le sérum, le plasma et le lait des ruminants Références catalogue A65415 et A65416 Pub. nº MAN0029778 Rév. A Technique Espèces Matrice d’échantillons Type de test Protocole ELISA monocupule indirect – Plaques sécables Bovin Ovin Caprin Sérum Plasma hépariné Lait (bovin) Individuel (sérum, plasma hépariné et lait) Lait de grand mélange Incubation courte Incubation longue AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité concernant les risques biologiques sur la page du produit à l’adresse thermofisher.com. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection appropriés. Description du produit ™ ™ L’Applied Biosystems PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit (réf. A65415 et A65416) est un test ELISA facile d'utilisation. Ce test permet la détection d’anticorps contre Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis dans des échantillons (sérum, plasma hépariné ou lait) de ruminants. La paratuberculose, également connue sous le nom de maladie de Johne, résulte d’une infection par Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), un bacille à Gram positif. Cette infection touche principalement les ganglions mésentériques et l’intestin grêle, entraînant une infection intestinale chronique. Les symptômes cliniques sont des diarrhées, une perte de poids et des œdèmes. Ces symptômes ne deviennent perceptibles qu’à un stade avancé de la maladie. Le contrôle de la maladie repose sur l’identification des animaux infectés et la mise en place de procédures d’abattage. Les principaux outils de diagnostic sont la bactérioscopie, la culture bactérienne, la PCR et les tests ELISA. Pour éviter les réactions croisées avec les anticorps d’autres mycobactéries, les échantillons sont préincubés avec des protéines de Mycobacterium phlei. Principe du test Le test est basé sur le principe d’un test ELISA indirect. 1. Les échantillons et les contrôles sont préparés dans une plaque de prédilution et incubés avec des protéines de Mycobacterium phlei (M. phlei). Les protéines se fixent sur tout anticorps susceptible d’interférer avec le test. 2. Les échantillons et les contrôles préincubés sont ensuite transférés sur la plaque de test sensibilisée avec l'antigène de MAP. Les anticorps anti-MAP présents dans l’échantillon ou le contrôle se fixent à l’antigène. 3. Après une étape de lavage, la protéine G conjuguée est ajoutée et se lie aux anticorps fixés sur la plaque. 4. Le conjugué non lié est éliminé par lavage, puis un substrat chromogène est ajouté. L’oxydation du substrat par le conjugué donne une couleur bleue. 5. La réaction est arrêtée et la couleur tourne au jaune. Les résultats peuvent être lus à l'aide d'un lecteur de plaque ELISA. L’intensité de la couleur jaune dans les échantillons positifs est proportionnelle à la quantité d’anticorps anti-MAP présents au sein de l’échantillon. Contenu et conservation Tableau 1 PrioCHECK™ Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit (réf. A65415 et A65416) Elément Description 1 : Plaque de test 12 barrettes de 8 puits 2 : Contrôle négatif sérum Solution beige dans un flacon translucide 3 : Contrôle positif sérum Solution beige dans un flacon translucide 4 : Contrôle négatif lait Solution blanche dans un flacon translucide 5 : Diluant échantillon[2] Solution jaune dans un flacon translucide 6 : Conjugué (30X/150X)[3] Solution rouge dans un flacon ambré 7 : Diluant conjugué Solution transparente dans un flacon translucide 8 : Solution de lavage (40X) Solution transparente dans un flacon translucide 9 : Substrat chromogène (TMB) Solution transparente dans un flacon ambré Réf. A65415 Réf. A65416 (460 tests) (2 760 tests) 5 plaques 700 μl 700 μl 9 ml 90 ml 2,1 ml 60 ml 60 ml 60 ml Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. 30 plaques 2,5 ml 2,5 ml 30 ml 500 ml 15 ml 450 ml 500 ml 500 ml Conservation [1] 2-8°C 2-8°C 2-8°C 2-8°C 2-8°C 2-8°C 2-8°C 2-8°C 2-8°C Elément 10 : Solution d’arrêt Films adhésifs pour plaques Réf. A65415 Réf. A65416 (460 tests) (2 760 tests) Description Solution transparente dans un flacon translucide 60 ml 10 500 ml — Conservation [1] 2-8°C Conserver à température ambiante (18-24°C). [1] Voir la date de péremption sur l’étiquette. [2] Le Diluant échantillon contient des protéines de Mycobacterium phlei. [3] Le conjugué est concentré 30X (pour le protocole d’incubation court) / 150X (pour le protocole d’incubation long). À diluer avant utilisation, voir “Préparation des réactifs” en page 2. Matériel requis non fourni Préparer les échantillons de lait Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits. Élément Dégraisser les échantillons de lait. 1. Centrifuger les échantillons de lait à 1 000 × g pendant 15 minutes. Les échantillons peuvent également être conservés au réfrigérateur pendant au moins 16 heures. 2. À l’aide d’une pipette, prélever l'échantillon sous la couche lipidique. Les échantillons et les contrôles de lait sont testés à une dilution de 1:2 dans le Diluant échantillon réalisée en une étape (voir “Incuber les échantillons et les contrôles” en page 2). Source Multiskan™ FC Microplate Photometer ou équivalent[1] Pipette monocanal (de 2 à 200 µl) Pipette multi-canaux (de 20 à 500 µl) Embouts de pipettes (conformes aux recommandations du fabricant) Plaque de prédilution Eau déionisée ou distillée Réservoirs à réactifs Microtubes 51119000 PFL PFL thermofisher.com/ pipettetips PFL PFL PFL PFL Préparation des réactifs • • • [1] Le lecteur de plaques doit pouvoir lire à 450 nm. Instructions générales • Ne pas mélanger des réactifs provenant de lots de kits différents. Le mélange de réactifs provenant de lots différents peut entraîner des données inexactes. • Les barrettes non utilisées peuvent être conservées dans un sachet hermétiquement fermé avec un sachet déssicant à 2-8°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’emballage du kit. Ne pas utiliser les barrettes après la date de péremption. Des barrettes conservées de manière inappropriée ou des barrettes périmées peuvent donner des résultats erronés. • Dans cette notice, la température ambiante est définie comme une température comprise entre 18 et 24°C. • La tolérance pour les temps d’incubation est de ±10 %. • Porter les réactifs à température ambiante avant d’effectuer le test. Utiliser des réservoirs à usage unique pour distribuer les réactifs Préparer le Contrôle positif lait en diluant le réactif 3 : Contrôle positif sérum au 1 : 17 avec le réactif 4 : Contrôle négatif lait. Exemple : Pour une plaque, mélanger 10 µl de réactif 3 : Contrôle positif sérum avec 160 µl de réactif 4 : Contrôle négatif lait. Diluer le réactif 8 : Solution de lavage (40X) au 1 : 40 avec de l’eau distillée ou déionisée Exemple : Pour une barrette, ajouter 500 µl de réactif 8 : Solution de lavage (40X) à 19,5 ml d’eau, puis mélanger. La solution de lavage diluée peut être conservée jusqu'à 1 mois à 2-8°C. • Avant de commencer Préparer des échantillons de sérum et de plasma Un échantillon frais, réfrigéré (8 jours à 2-8°C) ou congelé (1 an à < −16°C) peut être utilisé. Il n’est pas recommandé de tester des échantillons fortement hémolysés, qui peuvent donner un résultat erroné. L’intradermotuberculination pourrait interférer avec le test et entraîner des résultats faux positifs. Les échantillons de sérum et de plasma sont testés à une dilution de 1 : 30 dans le Diluant échantillon réalisée en 2 étapes (voir “Incuber les échantillons et les contrôles” en page 2). Remarque : En raison de la forte concentration en sels, le réactif 8 : Solution de lavage (40X) peut contenir des cristaux. Avant dilution, agiter le flacon pour dissoudre les cristaux. Diluer le réactif 6 : Conjugué (30X/150X) avant utilisation. – Pour un protocole avec incubation courte : diluer le réactif 6 : Conjugué (30X/150X) au 1 : 30 avec le réactif 7 : Diluant conjugué. Exemple : Pour une plaque, diluer 400 µl de réactif 6 : Conjugué (30X/150X) dans 11,6 ml de réactif 7 : Diluant conjugué. – Pour un protocole avec incubation longue : diluer le réactif 6 : Conjugué (30X/150X) au 1 : 150 avec le réactif 7 : Diluant conjugué. Exemple : Pour une plaque, diluer 80 µl de réactif 6 : Conjugué (30X/150X) dans 11,92 ml de réactif 7 : Diluant conjugué. Mise en œuvre du test ELISA 1 Incuber les échantillons et les contrôles 1. Diluer les échantillons et les contrôles avec le Diluant échantillon dans la Plaque de prédilution, selon le tableau suivant. Quantité Position du puits[1] Diluant échantillon Contrôle négatif sérum (NC) Contrôle positif sérum (PC) 80 μl 10 μl 10 μl Échantillon de sérum ou de plasma 10 μl Tous les puits A1 et B1 C1 et D1 Un puits (test en simplicat) ou deux puits adjacents (test en duplicat) Elément Test sur le sérum ou le plasma 2 ™ Notice d’utilisation du PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit 1 (suite) Elément Test sur le lait Quantité Position du puits[1] Diluant échantillon Contrôle négatif lait (NC) Contrôle positif lait (PC) Échantillon de lait 60 μl 60 μl 60 μl 60 μl Tous les puits A1 et B1 C1 et D1 Un puits (test en simplicat) ou deux puits adjacents (test en duplicat) [1] Position suggérée dans la Plaque de prédilution. 2. Agiter doucement la plaque, puis incuber la Plaque de prédilution pendant 15 minutes à 24 heures à température ambiante. 3. Transférer chaque échantillon et contrôle dilué de la Plaque de prédilution dans les puits correspondants de la Plaque de test. Elément Test sur le sérum ou le plasma Diluant échantillon Dilution d'échantillon ou de contrôle de la Plaque de prédilution Test sur le lait Dilution d'échantillon ou de contrôle de la Plaque de prédilution Quantité Position du puits[1] 70 μl Tous les puits 30 μl Puit(s) correspondant(s) dans la Plaque de test 100 μl Puit(s) correspondant(s) dans la Plaque de test [1] Position suggérée dans la Plaque de test. 4. Couvrir la Plaque de test avec film adhésif, puis l'agiter doucement. 5. Incuber la plaque. • Incubation courte : incuber la plaque pendant 45 minutes à température ambiante. • Incubation longue : incuber la plaque pendant 16 à 20 heures à 2-8°C. 2 1. Vider la Plaque de test, puis laver les puits 3 fois avec 350 μl de solution de lavage diluée par puits selon votre méthode de lavage. Ajouter le Conjugué dilué IMPORTANT ! Ne pas laisser la plaque sécher. • Lavage manuel : répéter le remplissage puis le vidage des puits par aspiration ou inversion. Après le dernier cycle de lavage, tapoter la plaque sur un papier absorbant pour éliminer autant de liquide que possible des puits. • Utilisation d’un laveur de plaques automatisé : laver les puits en suivant les instructions de l'instrument. 2. Ajouter 100 µl de Conjugué dilué à la Plaque de test. 3. Couvrir la Plaque de test avec un nouveau film adhésif. 4. Incuber la Plaque de test pendant 30 minutes à température ambiante. 3 1. Vider la Plaque de test, puis laver les puits 3 fois avec 350 μl de solution de lavage diluée par puits selon votre méthode de lavage. • Lavage manuel : répéter le remplissage puis le vidage des puits par aspiration ou inversion. Après le dernier cycle de lavage, tapoter la plaque sur un papier absorbant pour éliminer autant de liquide que possible des puits. • Utilisation d’un laveur de plaques automatisé : laver les puits en suivant les instructions de l'instrument. 2. Ajouter 100 µl de Substrat chromogène (TMB) à la Plaque de test. 3. Incuber la Plaque de test pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. 4. Ajouter 100 μl de Solution d’arrêt à la Plaque de test dans le même ordre que le Substrat chromogène (TMB). 5. Agiter doucement la Plaque de test. 6. Mesurer la densité optique (DO) des puits à l’aide d’un lecteur de plaques à 450 nm dans les 10 minutes suivant l’arrêt de la réaction. Réaliser l’étape de révélation puis lire la plaque Analyser les résultats Critères de validation Calculer les résultats Le test est validé si les critères suivants sont respectés. Calculer la DO (densité optique) moyenne du PC (DOm PC), et celle du NC (DOm NC). Pour chaque échantillon, calculer le pourcentage de positivité (PP %) : PP % = (DOéchantillon – DOm NC) / (DOm PC – DOm NC) × 100 Pour les échantillons négatifs, le PP % peut donner une valeur < 0 %. Tableau 2 Critères de validation par matrice d’échantillon Matrice d’échantillon Sérum Plasma Lait Résultats Incubation courte Incubation longue DOm NC ≤ 0,300 DOm NC ≤ 0,350 DOm PC > 0,800 DOm PC > 0,800 DOm NC ≤ 0,300 DOm PC > 0,800 Si les critères ci-dessus ne sont pas remplis, lire les instructions de nouveau, puis refaire le test. Si les résultats sont toujours non valides, veuillez contacter le support technique. ™ Notice d’utilisation du PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit 3 Tableau 5 Sérums et plasmas ovins Interprétation des résultats Interpréter les résultats conformément aux tableaux suivants. Tableau 3 Sérums, plasmas et échantillons de lait bovins Résultats Sérum et plasma Interprétation PP% ≥ 50 Positif PP% ≤ 40 Négatif 40 < PP% < 50 Douteux Lait (échantillons individuels et de grand mélange) PP% ≥ 40 PP% ≤ 30 30 < PP% < 40 Positif Négatif Douteux Tableau 4 Sérums et plasmas caprins Résultats Interprétation PP% ≥ 60 PP% ≤ 50 50 < PP% < 60 Positif Négatif Douteux Résultats Interprétation PP% ≥ 80 PP% ≤ 70 70 < PP% < 80 Positif Négatif Douteux Obtenir le certificat d’analyse 1. Rendez-vous sur thermofisher.com. 2. Dans la barre de recherche, saisir le numéro de lot du certificat, le numéro de lot est celui de votre kit. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de vente disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/ home/global/terms-and-conditions.html. Pour toute question, prendre contact avec Life Technologies à l’adresse www.thermofisher.com/support. Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0029777 C. Historique des révisions : Pub. nº MAN0029777 C Révision Date Description C 21 mai 2024 • Le type d’échantillon lait de grand mélange a été ajouté. • Le nombre de tests fournis dans le tableau Contenu et conservation a été mis à jour (voir “Contenu et conservation” en page 1). • Des modifications mineures ont été apportées suite à la demande des autorités réglementaires. B.0 18 janvier 2024 Le tableau Contenu et conservation a été mis à jour pour inclure le kit de 30 plaques (réf. A65416). A.0 8 décembre 2023 Nouveau document pour PrioCHECK Paratuberculosis Ab 3.0 Plate Kit. ™ Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2023-2024 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 17 septembre 2024 ">
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