NOTICE D’UTILISATION VetMAX™ African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 TaqMan™ PCR en temps réel pour la détection du virus de la peste porcine africaine Référence catalogue A57008 N° de document 100119744 Technique Pub. nº MAN1000012 Rév. A Échantillons[1] Type de test Sang total, sérum, tissus, organes lymphoïdes, fluides oraux, exsudat musculaire, écouvillons, papier buvard, chiffonnettes (échantillons environnementaux) Individuel Échantillons en mélange (jusqu’à 20 échantillons[2]) Espèces PCR en temps réel (ADN) • Test triplex Porcin et sanglier • (En option) IPC exogène • IPC endogène [1] Pour la France, seuls les types d’échantillons indiqués dans le document de spécifications français ANSES (2024) pour la présentation des réactifs PCR détectant le virus de la peste porcine africaine (PPA) ont été validés. [2] Les recommandations et réglementations relatives au mélange peuvent varier selon les pays. Pour la Pologne, suivre les exigences locales : mélanger jusqu’à 5 échantillons. Pour la France, suivre les exigences locales : mélanger jusqu’à 5 échantillons de sang total. AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse suivante : thermofisher.com/support. Description du produit ™ ™ L’Applied Biosystems VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 (réf. A57008) permet de détecter le virus de la peste porcine africaine (PPA) dans des échantillons (sang total, sérum, tissus, organes, fluides oraux, exsudat musculaire, écouvillons, papier buvard et chiffonnettes) par amplification de PCR temps réel. L’analyse est une PCR temps réel monopuits dans laquelle les cibles d’ADN sont ™ amplifiées et détectées à l’aide de sondes fluorescentes TaqMan . Les cibles sont la PPA et deux formes de contrôle positif interne (IPC) : exogène et endogène. Ce kit comprend les composants suivants : ™ • 3 – Mix ASFV 2.0 : contient des amorces, des sondes TaqMan , un tampon et une enzyme pour une amplification de PCR en temps réel optimisée des cibles PPA et IPC en triplex. • 4a – EPC ASFV 2.0 : matrice d’acide nucléique pour amplification de cible. Elle sert de contrôle positif externe pour la réaction de PCR temps réel et est utilisée pour définir le cycle seuil (Ct) afin d’évaluer les résultats des tests. • 5 – IPC ASFV 2.0 : contrôle positif interne exogène qui peut être ajouté à chaque échantillon et contrôle lors de la procédure d’extraction de l’ADN. Il sert de contrôle pour le processus d’extraction de l’ADN et permet de surveiller la présence d’inhibiteurs de PCR. • 6 – Negative Control ASFV 2.0 : eau exempte de nucléases qui sert de contrôle négatif externe pour les réactions de PCR en temps réel. Contenu et conservation Tableau 1 VetMAX™ African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 (réf. n° A57008) Composant 3 – Mix ASFV 2.0 4a – EPC ASFV 2.0 5 – IPC ASFV 2.0 6 – Negative Control ASFV 2.0 Couleur du bouchon Quantité[1] Conservation[2] Bouchon vert Bouchon marron Bouchon jaune Bouchon blanc 2 × 500 µl 2 × 90 µl 1 × 550 µl 1 × 180 µl -30°C à -10°C [1] Suffisant pour 100 réactions de PCR en temps réel de 15 µl. [2] Se reporter à l’emballage pour la date de péremption. Matériel requis, mais non fourni Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. "PFL" indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits. Article Instrument PCR en temps réel, l’un des suivants : Référence Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR System • Precision Plate Holder pour systèmes de PCR en temps réel 7500 (réf. A24820) • Precision Plate Holder pour les tubes et les barrettes de 0,2 ml (réf. 4367033) Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System • Precision Plate Holder pour systèmes de PCR en temps réel 7500 Fast (réf. 4359652) • 7500 Fast Precision Plate Holder pour les barrettes de 0,1 ml (réf. A29252) QuantStudio™ 3 Real-Time PCR System QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR System QuantStudio™ 7 Pro Real-Time PCR Instrument Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. Contacter un représentant commercial local. Équipement Pipeteurs sans nucléase Deux bacs de glace ou portoirs réfrigérants : • Un pour la zone de configuration de la PCR dans laquelle le master mix PCR est préparé • Un pour la zone dans laquelle les échantillons d’ADN et les contrôles sont préparés Tubes, plaques et autres consommables PFL PFL MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate, 0,2 ml MicroAmp™ Optical Adhesive Film MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2 mL MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips MicroAmp™ 96–Well Support Base Réactifs 4346907 4316813 4311971 4316567 4323032 4379590 1 tampon Tris-EDTA (TE) Autres consommables PFL Tubes de réactifs nuclease-free pour préparer les mix réactionnels Cônes de pipette résistants aux aérosols PFL PFL Instructions • • • • Respecter rigoureusement toutes les réglementations de sécurité nationales pour la PPA. Du matériel provenant d’un autre fournisseur de matériel de laboratoire peut être utilisé. Pour chaque test de PCR en temps réel, inclure les contrôles indiqués à l’étape “Préparer les réactions de PCR” en page 2. Respecter les “Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR” en page 4 pour éviter les faux positifs et la contamination des échantillons testés par des produits de PCR. Exigences concernant l’ADN ™ Nous recommandons l’utilisation du MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit (réf. A32700 et A32702) pour l’extraction d’ADN à partir d’échantillons biologiques, mais il est également possible d’utiliser d’autres méthodes d’extraction d’ADN de haute qualité. De plus, préparer un échantillon témoin avec de l’eau sans nucléase comme matériel de départ. Utiliser la même méthode d’extraction d’ADN que pour les échantillons testés. IMPORTANT ! Si un IPC exogène est nécessaire pour votre expérience, ajouter 5 µl de 5 – IPC ASFV 2.0 à chaque échantillon et contrôle d’extraction pendant l’extraction de l’ADN. Avant de commencer 1. Décongeler les réactifs et échantillons : a. Décongeler 3 – Mix ASFV 2.0 sur de la glace ou un portoir réfrigérant. b. Décongeler les composants suivants dans un bac de glace ou un portoir réfrigérant différent. • 4a – EPC ASFV 2.0 • 5 – IPC ASFV 2.0–Obligatoire pour les chiffonnettes (échantillons environnementaux) et en option pour les autres types d’échantillons. • 6 – Negative Control ASFV 2.0 • Échantillons d’ADN 2. Homogénéiser le contenu de chaque tube en le vortexant, puis centrifuger brièvement. Stocker les réactifs, les contrôles et les échantillons décongelés de 2 à 8°C jusqu’à utilisation. Préparer les réactions de PCR ™ IMPORTANT ! Distribuer 3 – Mix ASFV 2.0 à température ambiante. Utiliser une MicroAmp 96–Well Support Base. 1. Distribuer 10 µl de 3 – Mix ASFV 2.0 dans le nombre approprié de puits de plaques PCR, de barrettes de tubes ou de capillaires utilisés. 2. Ajouter l’échantillon ou le contrôle conformément au tableau suivant : Type de réaction Échantillon testé Contrôle positif (En option) Contrôle positif interne exogène (IPC)[1] Contrôle d’extraction Contrôle négatif d’amplification (NTC) Composant Volume par réaction Échantillon d’ADN 4a – EPC ASFV 2.0 5 – IPC ASFV 2.0 dilué dans un rapport de 1:10 Échantillon témoin 6 – Negative Control ASFV 2.0 5,0 µl 5,0 µl 1,0 µl 5,0 µl 5,0 µl [1] Si l’IPC n’a pas été ajouté lors de l’extraction de l’échantillon, il peut l’être dans les cas suivants 3 – Mix ASFV 2.0 à l'étape “Préparer les réactions de PCR”. 3. Sceller chaque plaque ou tube, mélanger, puis centrifuger brièvement pour en collecter le contenu. 2 ™ Notice d’utilisation du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 Configurer et démarrer l’instrument PCR en temps réel 1. En suivant les instructions du fabricant, configurer le test de PCR temps réel à l’aide des paramètres suivants. • Volume réactionnel : 15 µl ™ • Référence passive : Fluorophore ROX (inclus dans 3 – Mix ASFV 2.0) ™ Remarque : Le fluorophore ROX est à renseigner obligatoirement si l’instrument est capable de le détecter. Les instruments de PCR ™ en temps réel qui ne détectent pas le fluorophore ROX peuvent être utilisés sans affecter l’exactitude de la lecture. ™ • Programme du thermocycleur : Utilisable en mode fast ou en mode standard (QuantStudio 5 Real‑Time PCR System) Phase Répétitions Température Durée 1 2 1 40 95°C 95°C 60°C[1] 5 minutes (05’00”) 5 secondes (00’05”) 20 secondes (00'20”) [1] Collecte des données de fluorescence durant la phase 20 secondes à 60°C. • Programme du thermocycleur : Utilisable en mode fast ou en mode standard (7500/7500 Fast Real-Time PCR System) Phase Répétitions Température Durée 1 2 1 40 95°C 95°C 60°C[1] 5 minutes (05’00”) 5 secondes (00’05”) 31 secondes (00'31”) [1] Collecte des données de fluorescence durant la phase 31 secondes à 60°C. 2. Sélectionner ou créer des détecteurs de fluorophores, puis assigner à chaque tube ou puits. Cible Reporter Quencher PPA IPC exogène[1] IPC endogène Fluorophore FAM Fluorophore Cy5™ Fluorophore VIC™ ™ Quencher non fluorescent (NFQ) [1] Inclus dans le kit comme composant 5 – IPC ASFV 2.0. 3. Démarrer le programme de thermocyclage approprié et collecter les données d’amplification en temps réel pendant l’incubation à 60°C. Consignes pour l’analyse des données • Suivre le guide d’utilisation de l’instrument pour l’analyse des données brutes. • Fixer les seuils pour chaque cible séparément. • Voir le certificat d’analyse du lot de fabrication du kit pour valider le test et interpréter les résultats. Critères de validation Se référer aux valeurs CtQC dans le certificat d’analyse du lot de fabrication du kit. Le test est validé si les critères suivants sont respectés : Type de réaction Cible PPA (fluorophore FAM™) (Facultatif) Cible IPC exogène (Fluorophore Cy5™) Cible IPC endogène (Fluorophore VIC™) Interprétation Contrôle positif Contrôle d’extraction[3] Contrôle négatif d’amplification Ct = CtQC PPA ± 3 Ct[1] Ct > 40 Ct > 40 Ct > 40[2] Ct = CtQC IPC ± 3 Ct[4] Ct > 40 Ct > 40[2] Ct > 40[5] Ct > 40 La PCR est validée. L’extraction de l’ADN est validée. Les réactifs PCR sont validés. [1] Voir le tableau EPC dans le certificat d’analyse. [2] La valeur d’IPC de la réaction du contrôle positif n’est pas à prendre en compte pour la validation du test. [3] Utiliser le contrôle d’extraction préparé avec la même procédure d’extraction que celle utilisée pour les échantillons. [4] Voir le tableau IPC dans le certificat d’analyse. [5] La valeur d’IPC de la réaction du contrôle d’extraction n’est pas à prendre en compte pour la validation du test. Interprétation des résultats Tableau 2 Interprétation des résultats si seulement une cible IPC endogène a été utilisée dans l’expérience Cible PPA (fluorophore FAM™) Cible IPC endogène (Fluorophore VIC™) Interprétation Ct < 40 Ct > 40 Ct > 40 Toute valeur Ct < 40 Ct > 40 La PPA est détectée. La PPA n’est pas détectée. Résultat invalide.[1] [1] Le résultat est invalide en raison d’un échec d’expérience. Tableau 3 Interprétation des résultats si des cibles IPC doubles ont été utilisées dans l’expérience Cible PPA (fluorophore FAM™) Cible IPC exogène (Fluorophore Cy5™) Ct < 40 Ct > 40 Toute valeur[1] Ct = Ct du contrôle d’extraction ± 3 Ct[2] Ct > 40 Ct > 40 Cible IPC endogène (Fluorophore VIC™) Interprétation Toute valeur La PPA est détectée. Ct < 40 La PPA n’est pas détectée. Pour les chiffonnettes : Toute valeur Ct est en dehors de cette plage : Ct du contrôle d’extraction + 3 Ct[2] Toute valeur Résultat invalide.[3] [2] Ct = Ct du contrôle d’extraction ± 3 Ct Ct > 40 Résultat invalide.[4] [1] Un résultat fortement positif pour la PPA peut concurrencer la cible IPC exogène. [2] La valeur C du contrôle d’extraction doit d’abord être validée comme décrit dans le paragraphe “Critères de validation” en page 3. t [3] L’échantillon sera rendu invalide en raison d’une inhibition ou d’une valeur non conforme de l’IPC. [4] Le résultat est invalide en raison d’un échec pendant l’expérience dans le cas d’échantillons cellulaires (chiffonnettes exclues). ™ Notice d’utilisation du VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0 3 Retester les échantillons ayant des résultats invalidés 1. Diluer les échantillons d’ADN au 1:10 dans un tampon TE 1X. 2. Recommencer la procédure de PCR en temps réel avec 5 µl de l’ADN dilué, puis interpréter les résultats comme suit. Résultat Interprétation L’ADN dilué est positif pour la PPA. L’ADN dilué est négatif pour la PPA, et le résultat IPC est conforme. L’ADN dilué est négatif pour la PPA, mais le résultat IPC n’est pas conforme. Le résultat est validé. Le résultat est invalide. 3. Pour des échantillons dilués dont les résultats sont rendus invalides, recommencer la procédure d’extraction de l’ADN avec une nouvelle aliquote du lysat de l’échantillon d’origine, puis répétez le test. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. • Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0028501 C. Historique des révisions : Pub. nº MAN0028501 C Révision Date Description C 6 janvier 2025 De nouveaux types d’échantillons (écouvillons, papier buvard et chiffonnettes) ont été validés et ajoutés pour répondre aux exigences de l’ANSES pour ce kit. B.0 27 juin 2023 Ajout d’une déclaration concernant les exigences relatives aux échantillons en mélange. A.0 15 décembre 2022 ™ Nouveau document pour VetMAX African Swine Fever Virus Detection Kit 2.0. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU À SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2022-2025 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. TaqMan est une marque de Roche Molecular Systems, Inc., utilisée sous autorisation et licence. Cy5 est une marque commerciale de Cytiva et GE Healthcare UK Limited, utilisée sous autorisation et licence. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 6 janvier 2025 ">
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