MACHEREY-NAGEL Biologie moléculaire Bioanalysis User manual Manuel d’utilisation Extraction des ARN n NucleoSpin® RNA n NucleoSpin® RNA Midi November 2023 / Rev. 22 www.mn-net.com www.mn-net.com Extraction d’ARN Résumé du protocole (Rev. 22) Mini Midi NucleoSpin RNA NucleoSpin® RNA Midi ® 1 Préparation de l’échantillon 2 Lyse des cellules 3 Filtration du lysat 30 mg 100 mg 350 μL RA1 3.5 μL μL ß-mercaptoethanol 1.8 mL RA1 18 μL μL ß-mercaptoethanol Mélanger Mélanger 11,000 x g, 1 min 4 5 6 7 8 Ajustement des conditions de fixation des ARN 1,8 mL éthanol 70 % Mélanger Mélanger Charger le lysat Charger le lysat 11,000 x g, 30 s 4,500 x g, 3 min 350 μL MDB 2,2 mL MDB 11,000 x g, 1 min 4,500 x g, 3 min 95 μL de mélange réactionnel de rDNase 250 μL de mélange réactionnel de rDNase TA, 15 min TA, 15 min Dessalage de la membrane de silice Lavage et séchage de la membrane de silice 1er lavage 200 μL RAW2 1er lavage 2.6 mL RAW2 2ième lavage 600 μL RA3 2ième lavage 2.6 mL RA3 lavage 250 μL RA3 3 lavage 2.6 mL RA3 3 9 350 μL éthanol 70 % Fixation de l’ARN Digestion de l’ADN Elution d’ARN purifié 4,500 x g, 10 min ième ième 1er et 2ième 11,000 x g, 30 s 1 et 2ième 4,500 x g, 3 min 3ième 11,000 x g, 2 min 3ième 4,500 x g, 5 min er 60 μL RNasefree H₂O 11,000 x g, 1 min MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany Tel.: +49 24 21 969-333 · [email protected] · www.mn-net.com 500 μL RNasefree H₂O TA, 2 min 4,500 x g, 3 min Extraction des ARN Sommaire 1 Composition du kit 1.1 Composants 1.2 Réactifs, consommables et équipements complémentaires requis 1.3 À propos de ce manuel d’utilisation 4 4 6 6 2 Description du produit 2.1 Le principe de base 2.2 Caractéristiques du kit 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons 2.4 Procédures d’élution 7 7 8 12 14 3 Conditions de stockage et préparation des solutions de travail 15 4 Instructions de sécurité 4.1 Élimination 17 17 5 Protocoles NucleoSpin® RNA 5.1 Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus 5.2 Préparation d’ARN à partir de 10⁹ ou 30 mg de cellules bactériennes 5.3 Préparation d’ARN à partir de 5 × 10⁷ ou 30 mg de cellules de levure 5.4 Préparation d’ARN à partir de tissus inclus en paraffine* 5.5 Purification de l’ARN de mélanges réactionnels 5.6 Extraction d’ARN à partir d’insectes 18 18 21 23 25 26 27 6 Protocoles NucleoSpin® RNA Midi 6.1 Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus 6.2 Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 5 × 10⁹ cellules bactériennes 6.3 Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 3 × 10⁸ cellules de levure 6.4 Purification de l’ARN de mélanges réactionnels 28 28 32 34 37 7 Protocoles NucleoSpin® RNA / NucleoSpin® RNA Midi 38 7.1 Préparation d’ARN à partir d’échantillons traités avec du NucleoProtect® RNA ou du RNAlater® 38 7.2 Digestion rDNase en solution 38 8 Annexes 8.1 Guide de résolution des problèmes 8.2 Informations pour la commande 8.3 Restrictions d’utilisation / garantie MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 40 40 43 44 3 Extraction des ARN 1 Composition du kit 1.1 Composants NucleoSpin® RNA 10 préps 740955.10 50 préps 740955.50 250 préps. 740955.250 Tampon de lyse RA1 10 mL 25 mL 125 mL Tampon de lavage RAW2 13 mL 13 mL 80 mL Tampon de lavage RA3 (concentré)* 6 mL 12 mL 3 × 25 mL Tampon de dessalage de la membrane MDB 10 mL 25 mL 125 mL Tampon de réaction pour la rDNase 7 mL 7 mL 30 mL rDNase, RNase-free (lyophilisée)* 1 flacon (taille D) 1 flacon (taille F) 5 flacons (taille F) H2O RNase-free 13 mL 13 mL 60 mL NucleoSpin® Filters (bagues violettes) 10 50 250 Colonnes NucleoSpin® RNA (bagues bleues claires plus tubes collecteurs) 10 50 250 Tubes collecteurs (2 mL) 30 150 750 Tubes d’élution (1,5 mL) 10 50 250 Manuel d’utilisation 1 1 1 REF * Pour la préparation des réactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3. 4 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN Composants suite NucleoSpin® RNA Midi 20 préps. 740962.20 REF Tampon de lyse RA1 125 mL Tampon de lavage RAW2 80 mL Tampon de lavage RA3 (concentré)* 25 mL Tampon de dessalage des membranes MDB 50 mL Tampon de réaction pour la rDNase 7 mL rDNase, RNase-free (lyophilisée)* 1 flacon (taille D) H2O RNase-free 13 mL ® NucleoSpin Filters Midi (plus tubes collecteurs) 20 Colonnes NucleoSpin® RNA Midi (plus tubes collecteurs) 20 Tubes collecteurs (15 mL) 20 Manuel d’utilisation 1 * Pour la préparation des réactifs et des conditions de stockage, voir le chapitre 3. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 5 Extraction des ARN 1.2 Réactifs, consommables et équipements complémentaires requis Réactifs • Éthanol à 96 – 100 % (pour préparer le tampon de lavage RA3) • Éthanol à 70 % (pour ajuster les conditions de fixation de l’ARN) • Agent réducteur [ß-mercaptoéthanol, DTT (dithiothreithol) ou TCEP (BisTris (Bis-(2hydroxyéthyl)-imino-tris(hydroxyméthyl)-méthane)] en complément du tampon de lyse RA1 Consommables • Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (NucleoSpin® RNA) ou tubes de 15 mL (NucleoSpin® RNA Midi) • Cônes stériles, RNases-free Equipements • Pipettes manuelles • NucleoSpin® RNA : centrifugeuse pour microtubes • NucleoSpin® RNA Midi : centrifugeuse pour tubes de 15 mL avec rotor pivotant et godets appropriés pouvant atteindre 4 000 – 4 500 × g • Équipement pour le broyage et l’homogénéisation de l’échantillon (voir paragraphe 2.3) • Equipements de protection individuelle (par exemple, blouse de laboratoire, gants, lunettes) 1.3 À propos de ce manuel d’utilisation Il est fortement recommandé de lire les protocoles détaillés de ce manuel d’utilisation si le kit NucleoSpin® RNA ou NucleoSpin® RNA Midi est utilisé pour la première fois. Les utilisateurs expérimentés peuvent toutefois se référer au résumé du protocole. Celui-ci est conçu pour repérer aisément le déroulement de la procédure en rappelant la chronologie des différentes étapes. Toute la littérature technique est disponible sur notre site www.mn-net.com. Merci de contacter notre support technique pour toute information concernant les changements éventuels entre cette version du manuel et les précédentes versions. 6 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN 2 Description du produit 2.1 Le principe de base Un des aspects les plus important lors de l’extraction de l’ARN concerne la prévention de sa dégradation. Avec les méthodes NucleoSpin® RNA, les cellules sont lysées par incubation dans une solution contenant une forte concentration d’ions chaotropiques. Ce tampon de lyse inactive immédiatement les RNases – omniprésentes dans quasiment tous les échantillons biologiques – et crée les conditions favorables pour la fixation de l’ARN à la membrane de silice. L’ADN contaminant, également fixé à la membrane de silice, est éliminé par digestion au moyen d’une solution de rDNase directement appliquée sur la membrane de silice pendant la procédure (la rDNase RNase-Free est incluse dans le kit). De simples étapes de lavages avec deux tampons différents permettent d’éliminer les sels, les métabolites et autres composants cellulaires macromoléculaires. L’ARN purifié est finalement élué dans de l’H₂O RNases-free (fournie dans le kit). La préparation de l’ARN avec les kits de la gamme NucleoSpin® RNA peut être effectuée à TA. Cependant, une fois élué, l’éluat doit être traité avec précaution en raison de sa forte vulnérabilité vis-à-vis des RNases, souvent présentes sur le matériel, les traces de doigts et la poussière. Pour garantir la stabilité de l’ARN, conserver le congelé à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -70 °C pour un stockage à long terme. Extraction simultanée d’ARN, de protéines et d’ADN (NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set*, NucleoSpin® TriPrep*) Le set de tampons ’NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set’ (voir les informations de commande) est un kit permettant l’extraction d’ARN et d’ADN lorsqu’il est combiné avec les kits NucleoSpin® RNA, NucleoSpin® RNA XS, NucleoSpin® RNA Plant ou NucleoSpin® RNA / Protein. Cette technologie brevetée permet l’élution successive de l’ADN et de l’ARN à partir d’une colonne NucleoSpin® avec un tampon à faible teneur en sel et de l’eau, respectivement. L’ADN et l’ARN sont immédiatement prêts pour les applications en aval. La combinaison du kit NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set avec le kit NucleoSpin® RNA / Protein permet d’isoler en parallèle l’ARN, l’ADN et les protéines à partir d’un seul échantillon sans le diviser. Le kit NucleoSpin® TriPrep permet l’extraction d’ARN, d’ADN et des protéines à partir d’échantillons uniques non divisés. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 7 Extraction des ARN 2.2 Caractéristiques du kit • Les kits NucleoSpin® RNA sont recommandés pour l’extraction d’ARN à partir de cellules et de tissus cultivés. Des protocoles supports pour la purification d’ARN à partir de mélanges réactionnels, de bactéries et de levures à l’aide du kit NucleoSpin® RNA sont également inclus. Les kits NucleoSpin® RNA permettent la purification d’ARN pur avec un ratio A₂₆₀/A₂₈₀ généralement supérieur à 1,9 (mesuré dans le tampon TE, pH 7,5). • Même des échantillons biologiques, parfois difficiles à traiter, produisent de l’ARN de haute qualité. Il s’agit par exemple de tissus de souris (foie, cerveau), de différentes lignées de cellules tumorales, de Streptocoques et d’Actinobacillus pleuropneumoniae. • L’ARN purifié est prêt à être utilisé pour des applications telles que la transcriptase inverse-PCR (RT-PCR), l’extension d’amorces ou les essais de protection par la RNase. • L’ARN purifié avec les kits NucleoSpin® RNA est d’une grande intégrité. L’indice RIN pour RNA Integrity Number de l’ARN purifié à partir d’échantillons frais de haute qualité (par exemple, des cellules eucaryotes ou du foie de souris frais) est généralement supérieur à 9,0. Toutefois, l’intégrité de l’ARN dépend fortement de la qualité de l’échantillon. L’intégrité de l’ARN a été examinée à l’aide de la méthode Agilent 2100 Bioanalyzer en association avec le test RNA 6000 Nano ou Pico. • La contamination en ADN est considérablement réduite grâce à la digestion avec la rDNase directement appliquée sur la membrane de silice. Néanmoins, dans des applications très sensibles, il peut être possible de détecter des traces d’ADN. L’élimination de l’ADN lors de la digestion sur colonne NucleoSpin® RNA est testée avec la procédure suivante : un million de cellules HeLa sont soumises à l’extraction d’ARN conformément au protocole. L’éluat d’ARN est utilisé comme modèle pour la détection par PCR d’un fragment de 1 kb dans une réaction de 30 cycles. En général, aucun fragment PCR n’est obtenu si la DNase est appliquée, tandis qu’un fragment PCR intense peut être obtenu si la digestion à la DNase est omise. La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec 1. le nombre de copies d’ADN par préparation : cible à copie unique < cible plastidiale / mitochondriale < plasmide transfecté dans les cellules. 2. la diminution de la taille de l’amplicon PCR. 8 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN Tableau 1 : Résumé des caractéristiques du kit Paramètres NucleoSpin® RNA NucleoSpin® RNA Midi Technologie Technologie des membranes de silice Technologie des membranes de silice Utilisation Réservé uniquement à usage de la recherche Réservé uniquement à usage de la recherche Format Mini colonne à centrifuger Midi colonne à centrifuger Traitement Manuel et centrifugation Manuel et centrifugation Echantillon < 5 × 10⁶ cellules en culture, < 10⁹ cellules de bactéries, < 10⁸ cellules de levure, < 30 mg de tissus < 5 × 10⁷ cellules en culture, < 10¹⁰ cellules de bactéries, < 3 × 10⁸ cellules de levure, < 200 mg de tissus > 200 nt > 200 nt Rendement 14 μg à partir de 10⁶ cellules HeLa, 70 μg à partir de 10⁹ cellules de bactéries. 180 μg de 10⁷ cellules HeLa, 620 μg de 4 × 10⁷ cellules HeLa A260/A280 1.9 – 2.1 1.9 – 2.1 RIN (RNA integrity number) >9 >9 Volume d’élution 40 – 120 μL 500 μL 30 min/6 préparations 80 min/4 préparations 200 μg 700 μg Taille du fragment Temps de préparation Capacité de reliure NucleoSpin® RNA • Le protocole standard (paragraphe 5.1) permet de purifier jusqu’à 70 μg d’ARN par colonne NucleoSpin® RNA à partir de 5 × 10⁶ cellules en culture ou de 30 mg de tissus (voir également le tableau 1). L’ARN purifié peut être utilisé comme matrice dans une réaction RT-PCR. En général, 1 à 10 % de l’éluat d’ARN préparé à partir de 1 × 10⁶ cellules ou 10 mg de tissus suffit comme matrice pour la RT-PCR. Si possible, il convient de définir des amorces sur des exons qui encadrent un ou plusieurs intron(s) pour la RT-PCR. • L’ARN préparé à partir de quantités élevées est généralement exempt d’ADN résiduel, bien que des traces infimes d’ADN puissent subsister dans la préparation si le matériel utilisé est riche en acide nucléique. Toutefois, si l’ARN purifié doit être utilisé comme matrice dans une réaction RT-PCR, nous recommandons d’utiliser des quantités plus MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 9 Extraction des ARN faibles d’échantillon (par exemple, 1 × 10⁶ cellules en culture ou 10 mg de tissus, ce qui donne environ 20 μg d’ARN). • Le kit peut être utilisé pour préparer de l’ARN à partir de différentes quantités d’échantillons. Pour des résultats optimaux, le volume de tampon de lyse RA1 (étape 1 du protocole) et d’éthanol (étape 3 du protocole) doit être adapté conformément au Tableau 2. Tableau 2 : Adaptation de la lyse Volume de Quantité Tampon de lyse RA1 (étape 2 du protocole) Éthanol (étape 4 du protocole) < 5 × 10⁶ 350 μL 350 μL < 20 mg 20 mg – 30 mg* 350 μL 600 μL 350 μL 600 μL Tissu conservé dans du NucleoProtect® RNA ou RNAlater®. < 20 mg 20 mg – 30 mg* 350 μL 600 μL 350 μL 600 μL Échantillons réputés difficiles à lyser < 5 × 10⁷* 600 μL 600 μL Échantillon Cellules animales ou humaines en culture (par exemple, cellules HeLa) Tissu humain ou animal Une étape de chargement supplémentaire est nécessaire si 600 μL de tampon RA1 et d’éthanol sont utilisés (charger l’échantillon sur la colonne en deux étapes de centrifugation successives). Selon le type d’échantillon, le rendement moyen est d’environ 5 – 70 μg d’ARN (voir tableau 3). Le rapport A260/A280 est généralement supérieur à 1,9, ce qui indique la pureté de l’ARN. * Le volume de tampon de lyse RA1 inclus dans le kit n’est pas suffisant pour effectuer toutes les préparations avec 600 μL. Si nécessaire, du tampon de lyse RA1 supplémentaire peut être commandé séparément (voir les informations de commande, chapitre 8.2). 10 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN Tableau 3 : Aperçu des rendements moyens en ARN obtenus à l’aide du NucleoSpin® RNA Échantillon Rendement moyen 8 × 10⁴ cellules HeLa 1,5 μg 4 × 10⁵ cellules HeLa 4 μg 1 × 10⁶ cellules HeLa 14 μg 2 × 10⁶ cellules HeLa 21 μg 2,5 × 10⁶ cellules HeLa 25 μg 5 × 10⁶ cellules HeLa 50 μg ® NucleoSpin RNA Midi • Le kit peut être utilisé pour extraire de l’ARN à partir de différentes quantités d’échantillons. Pour des résultats optimaux, le volume de tampon de lyse RA1 (étape 1 du protocole) et d’éthanol (étape 3 du protocole) doit être adapté conformément au tableau 4 : Tableau 4 : Adaptation de la lyse Volume de Quantité Tampon de lyse RA1 (étape 1 du protocole) Éthanol (étape 4 du protocole) Cellules animales en culture (par exemple, cellules HeLa) 5 × 10⁶ – 2 × 10⁷ 2 × 10⁷ – 5 × 10⁷ 1,8 mL 3,6 mL 1,8 mL 3,6 mL Tissu animal 30 – 100 mg 100 – 200 mg 1,8 mL 3,6 mL 1,8 mL 3,6 mL Bactéries 1 × 10⁹ – 5 × 10⁹ 2 × 10⁹ – 1 ×10¹⁰ 1,8 mL 3,6 mL 1,8 mL 3,6 mL Levure < 3 × 10⁸ 3,6 mL 3,6 mL Échantillon Une étape de chargement supplémentaire est nécessaire si 3,6 mL de tampon RA1 et d’éthanol sont utilisés. Si vous isolez l’ARN d’un certain type de tissu pour la première fois avec le kit NucleoSpin® RNA Midi, nous vous recommandons de commencer avec un maximum de 100 mg de tissu. En fonction de la nature du tissu, il est possible de traiter jusqu’à 200 mg. Ne pas utiliser plus de 200 mg de tissu pour éviter le colmatage de la colonne. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 11 Extraction des ARN Selon le type d’échantillon, le rendement moyen est d’environ 70 – 400 μg d’ARN (voir tableau 5). Le rapport A260/A280 indiquant la pureté de l’ARN est généralement supérieur à 1,9. Tableau 5 : Aperçu des rendements moyens en ARN obtenus à l’aide de NucleoSpin® RNA Midi Échantillon Rendement moyen 1 × 10⁶ cellules HeLa 20 μg 1 × 10⁷ cellules HeLa 160 μg 2 × 10⁷ cellules HeLa 330 μg 4 × 10⁷ cellules HeLa 620 μg 200 mg de foie de porc 450 μg 200 mg de foie de souris 320 μg 2.3 Manipulation, préparation et stockage des échantillons Environnement de travail Maintenir un environnement de travail exempt de RNase. Porter des gants à tout moment pendant la préparation. Changer de gants fréquemment Stockage des échantillons et inhibition de la RNase Les RNases peuvent dégrader rapidement l’ARN contenu dans les échantillons si ceux-ci ne sont pas protégés de l’activité des RNases après la récolte. Les méthodes suivantes sont recommandées pour éviter la dégradation de l’ARN : • Utiliser l’échantillon fraîchement récolté pour une lyse immédiate et une extraction de l’ARN. • Immerger et conserver les échantillons dans NucleoProtect® RNA ou dans des solutions de stabilisation similaires. Veiller à ce que l’échantillon soit complètement imprégné de la solution de stabilisation avant de le congeler. Retirer l’excès de solution de stabilisation de l’échantillon avant l’isolement de l’ARN conformément au manuel d’utilisation de la solution de stabilisation. • Congeler rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide immédiatement après la récolte et le conserver à -70 °C. Les échantillons congelés sont stables jusqu’à 6 mois. Un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour pulvériser l’échantillon à l’état congelé. Veiller à ce que l’échantillon ne soit pas décongelé avant d’entrer en contact avec le tampon de lyse. • Conserver les échantillons dans le tampon de lyse RA1 après rupture à -70 °C jusqu’à un an, à 4 °C jusqu’à 24 heures ou à température ambiante pendant quelques heures. Les échantillons congelés dans le tampon de lyse RA1 doivent être décongelés lentement avant de commencer l’isolement de l’ARN. 12 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN Broyage et homogénéisation de l’échantillon • Cellules cultivées en suspension : Récolter les cellules par centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter immédiatement le tampon de lyse RA1 conformément à l’étape 2 du protocole standard (voir les paragraphes 5.1, 6.1). • Cultures de cellules adhérentes (lyse dans la boîte de culture) : Aspirer complètement le milieu de culture. Ajouter immédiatement le tampon de lyse RA1 dans la boîte de culture. Éliminer complètement le milieu de culture afin de permettre une activité de lyse complète du tampon de lyse. Poursuivre la filtration du lysat (étape 3 du protocole standard). • Cultures de cellules adhérentes (lyse après trypsinisation) : Aspirer le milieu de culture et laver les cellules une fois avec du PBS. Aspirer le PBS. Ajouter 0,1 – 0,3 % de trypsine dans du PBS et incuber pendant une durée appropriée pour détacher les cellules de la surface de la boîte. Après le détachement des cellules, ajouter du milieu, transférer les cellules dans un tube approprié (non fourni) et les culotter par centrifugation pendant 5 minutes à 300 × g. Éliminer le surnageant et poursuivre l’addition du tampon de lyse RA1 au culot cellulaire. • Tissus d’animaux : Pour une préparation efficace de l’ARN, il est essentiel que tout l’ARN contenu dans l’échantillon soit libéré des cellules par broyage et que la viscosité de l’échantillon soit réduite par homogénéisation. La technique la plus couramment utilisée pour le broyage des tissus d’animaux est le broyage à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Réduiser l’échantillon en poudre fine en présence d’azote liquide. Veiller à ce que l’échantillon ne décongèle pas pendant ou après le broyage ou la pesée et ajouter la poudre congelée à une aliquote appropriée de tampon RA1 contenant un agent réducteur (par exemple, ß-mercaptoéthanol, DTT ou TCEP) et mélanger immédiatement. Le tissu fragmenté doit ensuite être homogénéisé à l’aide d’un NucleoSpin® Filter / Filter Midi (inclus dans le kit) ou en passant ≥ 5 fois à travers une aiguille de seringue de 0,9 mm. La décongélation des tissus non broyés doit se faire exclusivement en présence du tampon RA1 lors d’un broyage mécanique simultanée, par exemple, avec un broyeur à rotor-stator. Cela garantit que l’ARN n’est pas dégradé par les RNases avant le début de la préparation. Le rotor-stator broye et homogénéise simultanément l’échantillon par cisaillement mécanique de l’ADN en quelques secondes à quelques minutes (le temps d’homogénéisation dépend de l’échantillon). Veiller à ce que l’extrémité du rotor soit immergée afin d’éviter la formation d’une mousse excessive. Choisir un broyeur de taille appropriée (des rotors de 5 à 7 mm de diamètre peuvent être utilisés pour l’homogénéisation dans des tubes de microcentrifugeuse). Le broyage mécanique et l’homogénéisation dans le tampon RA1 (par exemple, avec un homogénéisateur à rotor-stator) sont également recommandées pour les échantillons de tissus stockés dans des solutions de stabilisation comme NucleoProtect® RNA ou RNAlater®. • Bactéries et levures : Une lyse enzymatique ou mécanique est nécessaire dans la plupart des cas. Pour la lyse enzymatique, les échantillons doivent être incubés avec des solutions de lysozyme (bactéries) ou de lyticase/zymolase (levures) (voir les protocoles supports aux paragraphes 5.2 et 5.3). Ce traitement permet de digérer ou au moins d’affaiblir les parois cellulaires robustes de ces organismes, ce qui est essentiel pour une lyse cellulaire efficace par le tampon RA1. Pour les micro-organismes dont les parois cellulaires sont extrêmement résistantes - comme certaines souches bactériennes Gram-positives - il peut être nécessaire d’optimiser les conditions de traitement avec des enzymes lytiques ou les conditions de culture. Les cellules de bactéries et de levures peuvent également MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 13 Extraction des ARN être lysées mécaniquement par broyage avec des billes. Par conséquent, remettre en suspension le culot cellulaire dans le tampon de lyse RA1, transférer la solution dans un tube MN Bead Tubes Type B et broyer les échantillons par grâce aux billes (par exemple, en utilisant le support MN Bead Tube Holder sur un Vortex Genie® 2). Après la lyse, l’homogénéisation est réalisée à l’aide d’un NucleoSpin® Filter ou par passage dans une aiguille-seringue. 2.4 Procédures d’élution Il est possible d’adapter la méthode d’élution et le volume d’eau utilisé à l’application ultérieure qui nous intéresse. Outre la méthode standard décrite dans les protocoles individuels (taux de récupération d’environ 70 – 90 %), plusieurs modifications sont possibles. • Rendement élevé : effectuer deux étapes d’élution avec le volume indiqué dans le protocole individuel. Environ 90 à 100 % de l’acide nucléique lié sera élué. • Rendement et concentration élevés : éluer avec le volume d’élution standard et appliquer l’éluat une fois de plus sur la colonne pour une nouvelle élution. L’ARN élué doit être immédiatement placé et toujours conservé sur de la glace pour une stabilité optimale, car les RNases presque omniprésentes (matériel de laboratoire, empreintes digitales, poussière) dégradent l’ARN. Pour un stockage à court terme, congeler vos ARN à -20 °C, pour un stockage à long terme, congeler à -70 °C. 14 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN 3 Conditions de stockage et préparation des solutions de travail Attention : Les tampons RA1, RAW2 et MDB contiennent du sel chaotropique. Porter des gants et des lunettes ! ATTENTION : Les tampons RA1, RAW2 et MDB contiennent des sels chaotropiques qui peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés à de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium). NE PAS ajouter d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation des échantillons. • Conserver la rDNase lyophilisée (RNase-free) à 4 °C dès son arrivée au laboratoire (stable jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage). • Tous les autres composants du kit doivent être conservés à température ambiante (15 – 25 °C) et sont stables jusqu’à : voir l’étiquette de l’emballage. Le stockage à des températures inférieures peut entraîner la précipitation de sels. • Vérifier que de l’éthanol à 70 % est disponible comme solution supplémentaire pour ajuster les conditions de fixation de l’ARN dans le lysat. • Vérifier que l’agent réducteur (ß-ME, DTT ou TCEP) est disponible. Avant de commencer le protocole NucleoSpin® RNA, préparer les éléments suivants : • rDNase (RNase-free) : Ajouter le volume d’H2O RNase-free indiqué (voir tableau cidessous) dans le flacon de rDNase lyophilisée et incuber pendant 1 minute à température ambiante. Agiter doucement le flacon pour dissoudre complètement la rDNase. Veiller à ne pas mélanger la rDNase vigoureusement, l’enzyme étant sensible à l’agitation mécanique. Distribuer en aliquotes et conserver à -20 °C. La solution de travail congelée est stable pendant au moins 6 mois. Ne pas congeler/décongeler les aliquotes plus de trois fois. (Faire attention lors de l’ouverture du flacon car certaines particules du lyophilisat peuvent être attachées au couvercle). Pour le stockage temporaire de la rDNase dissoute au cours d’une journée de travail, toujours la conserver sur la glace. Dans certains cas, le flacon de rDNase peut sembler vide. Ceci est dû au fait que l’enzyme lyophilisée colle au septum. Pour éviter la perte de rDNase, veiller à recueillir la rDNase au fond du flacon avant de retirer le bouchon. • Tampon de lavage RA3 : ajouter le volume indiqué d’éthanol 96 – 100 % (voir le tableau de la page suivante) au tampon RA3 concentré. Marquer l’étiquette du flacon pour indiquer que l’éthanol a été ajouté. Le tampon de lavage RA3 peut être conservé à température ambiante (15 – 25 °C) pendant au moins un an. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 15 Extraction des ARN NucleoSpin® RNA 10 préps 740955.10 50 préps 740955.50 250 préps. 740955.250 Tampon de lavage RA3 (concentré) 6 mL Ajouter 24 mL d’éthanol 12 mL Ajouter 48 mL d’éthanol 3 × 25 mL Ajouter 100 mL d’éthanol à chaque flacon rDNase, RNase-free (lyophilisée) 1 flacon (taille D) Ajouter 120 μL de H2O RNase-free 1 flacon (taille F) Ajouter 550 μL de H2O RNase-free 5 flacons (taille F) Ajouter 550 μL de H2O RNase-free à chaque flacon. REF NucleoSpin® RNA Midi 20 préps. 740962.20 REF Tampon de lavage RA3 (concentré) 25 mL Ajouter 100 mL d’éthanol rDNase, RNase-free (lyophilisée) 1 flacon (taille D) Ajouter 540 μL de H2O RNase-free 16 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN 4 Instructions de sécurité Les composants suivants des kits NucleoSpin® RNA et NucleoSpin® RNA Midi contiennent des substances dangereuses. Lorsque vous travaillez avec le kit NucleoSpin® RNA, porter des vêtements de protection appropriés (par exemple, une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection). Pour plus d’informations, consulter les fiches de données de sécurité appropriées (FDS disponibles en ligne sur www.mn-net.com/msds). Attention : Le thiocyanate de guanidine dans le tampon RA1 et le chlorhydrate de guanidine dans le tampon RAW2 peuvent former des composés très réactifs lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ! Par conséquent, n’ajouter pas d’eau de Javel ou de solutions acides directement aux déchets de préparation d’échantillons. Les déchets générés par le kit NucleoSpin® RNA n’ont pas été testés pour détecter la présence de matériel infectieux résiduel. Une contamination des déchets liquides par du matériel infectieux résiduel est hautement improbable en raison du traitement par tampon de lyse fortement dénaturant, mais elle ne peut être totalement exclue. Par conséquent, les déchets liquides doivent être considérés comme infectieux et doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations locales en matière de sécurité. 4.1 Élimination Éliminer les substances dangereuses, potentiellement infectieuses ou contaminées par du matériel biologique d’une manière sûre et conforme aux dispositions règlementaires locales. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 17 NucleoSpin® RNA 5 Protocoles NucleoSpin® RNA 5.1 Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus Avant de débuter la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 3. 1 Préparer l’échantillon Broyer jusqu’à 30 mg de tissu (pour les quantités d’échantillons, voir le paragraphe 2.2 ; pour les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.3). Broyer l’échantillon Jusqu’à 5 × 10⁶ cellules eucaryotes cultivées peuvent être collectées par centrifugation et lysées en ajoutant directement le tampon RA1. 2 Lyser les cellules Ajouter 350 μL de tampon RA1 et 3,5 μL de ß-mercaptoéthanol (ß-ME) au culot cellulaire ou au tissu broyé et agiter vigoureusement au vortex. Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir le paragraphe 2.2. + 350 μL RA1 + 3,5 μL ß-ME Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse RA1. 3 Filtrer le lysat Réduire la viscosité et clarifier le lysat par filtration à travers le NucleoSpin® Filter (bague violettte) : placer le NucleoSpin® Filter dans un tube collecteur (2 mL), appliquer le mélange et centrifuger pendant 1 minute à 11,000 × g. Le lysat peut alternativement être passé ≥ 5 fois à travers une aiguille de 0,9 mm (calibre 20) montée sur une seringue. En cas de formation d’un culot visible (en fonction de la quantité et de la nature de l’échantillon), transférer le surnageant sans aucun culot formé dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL (non fourni). Important : pour traiter des quantités plus importantes de cellules (> 1 × 10⁶) ou de tissus (> 10 mg), le lysat doit d’abord être homogénéisé à l’aide d’une aiguille de 0,9 mm (calibre 20), puis filtré à l’aide de NucleoSpin® Filters. 18 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 11,000 × g, 1 min NucleoSpin® RNA 4 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN Eliminer le NucleoSpin® Filter et ajouter 350 μL d’éthanol (70 %) au lysat homogénéisé et mélanger par pipetage successif (5 fois). + 350 μL d’éthanol 70 % Autrement, transférer le filtrat dans un nouveau tube de 1,5 mL (non fourni), ajouter 350 μL d’éthanol (70 %) et mélanger en vortexant (2 × 5 s). Mélanger Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut devenir visible, ce qui n’affectera pas l’isolement de l’ARN. Veiller à désagréger ce précipité en mélangeant et charger l’ensemble sur la colonne comme décrit à l’étape 5. Ne pas centrifuger le lysat après l’ajout de l’éthanol et avant chargement de la colonne afin d’éviter de culotter le précipité. 5 Fixer l’ARN Pour chaque préparation, prendre une colonne NucleoSpin® RNA (bague bleue) placée dans un tube collecteur. Mélanger le lysat en pipetant 2 à 3 fois et charger le lysat dans la colonne. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g. Placer la colonne dans un nouveau tube de collecte (2 mL). Charger le lysat 11,000 × g, 30 s La capacité de chargement maximale des colonnes NucleoSpin® RNA est de 750 μL. Répéter la procédure si des volumes plus importants doivent être traités. 6 Dessaler la membrane de silice Ajouter 350 μL de MDB (tampon de tampon de dessalage de la membrane) et centrifuger à 11,000 × g pendant 1 min pour sécher la membrane. L'élimination du sel rend la digestion à la rDNase beaucoup plus efficace. Si la sortie de la colonne est entrée en contact avec le filtrat de la colonne pour quelque raison que ce soit, jeter le filtrat et centrifuger à nouveau pendant 30 s à 11 000 × g. 7 + 350 μL MDB 11,000 × g, 1 min Digérer l’ADN Préparer le mélange réactionnel pour la rDNase dans un microtube stérile de 1,5 mL (non fourni) : pour chaque préparation, ajouter 10 μL de rDNase reconstituée (voir également le chapitre 3) à 90 μL de tampon de réaction pour la rDNase. Mélanger en tapotant le tube. Appliquer 95 μL de mélange réactionnel de rDNase directement sur le centre de la membrane de silice de la colonne. Incuber à température ambiante pendant 15 min. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 + 95 μL Mélange réactionnel rDNase RT, 15 min 19 NucleoSpin® RNA 8 Laver et sécher la membrane de silice 1er lavage Ajouter 200 μL de tampon RAW2 à la colonne NucleoSpin® RNA. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g. Placer la colonne dans un nouveau tube collecteur (2 mL). Le tampon RAW2 inactive la rDNase. + 200 μL RAW2 11,000 × g, 30 s 2ième lavage Ajouter 600 μL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin® RNA. Centrifuger pendant 30 s à 11,000 × g. Jeter l’écoulement et replacer la colonne dans le tube collecteur. Note : S’assurer que le tampon résiduel des étapes précédentes a été lavé avec le tampon RA3, en particulier si le lysat a été en contact avec le bord interne de la colonne pendant le chargement du lysat sur la colonne. Pour un lavage efficace du bord interne, le rincer avec le tampon RA3. 3ième lavage Ajouter 250 μL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin® RNA. Centrifuger pendant 2 min à 11,000 × g pour sécher complètement la membrane. Placer la colonne dans un tube collecteur exempt de nucléase (1,5 mL, fourni). + 600 μL RA3 11,000 × g, 30 s + 250 μL RA3 11,000 × g, 2 min Si, pour une raison quelconque, le niveau de liquide dans le tube collecteur a atteint la colonne NucleoSpin® RNA après la centrifugation, jeter le liquide et centrifuger à nouveau. 9 Eluer l’ARN Éluer l’ARN dans 60 μL de H2O RNase-free, (fourni) et centrifuger à 11,000 × g pendant 1 min. Si des concentrations plus élevées d’ARN sont souhaitées, l’élution peut être effectuée avec 40 μL. Le rendement global, cependant, diminuera lors de l’utilisation de volumes plus petits. + 60 μL RNase-free H2O 11,000 × g, 1 min Pour d’autres procédures d’élution alternatives, voir le paragraphe 2.4. 20 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA 5.2 Préparation d’ARN à partir de 10⁹ ou 30 mg de cellules bactériennes Réactifs supplémentaires à fournir par l’utilisateur : • Lysozyme ou • MN Bead Tubes Type B (voir informations de commande, paragraphe 8.2) Avant de débuter la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 3. 1 Homogénéiser l’échantillon Deux protocoles alternatifs sont proposés pour l’homogénéisation des cellules bactériennes. Les utilisateurs peuvent choisir entre une digestion enzymatique (A) et une homogénéisation mécanique (B), en fonction de l’équipement du laboratoire et de leurs préférences personnelles. A) Homogénéisation par digestion enzymatique Remettre en suspension le culot de cellules bactériennes (souches Gram négatives, jusqu’à 10⁹ cellules) dans 100 μL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ; pH 8) contenant 1 mg/mL de lysozyme en agitant vigoureusement le vortex. Incuber à 37 °C pendant 10 minutes. Pour la préparation de l’ARN des bactéries Gram-positives, remettre en suspension les cellules dans 100 μL de TE contenant 2 mg/mL de lysozyme. Il peut être nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration en lysozyme, en fonction de la souche bactérienne. Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents génomiques dans une préparation d’acide nucléique de bactéries par rapport au matériel eucaryote, il peut être nécessaire d’utiliser une quantité plus faible de cellules pour la préparation. Ajouter 350 μL de tampon RA1 et 3,5 μL de ß-mercaptoéthanol à la suspension et vortexer vigoureusement. Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir le paragraphe 2.2. Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse RA1. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 21 NucleoSpin® RNA B) Homogénéisation à l’aide de tubes à billes MN Récolter les cellules (jusqu’à environ 30 mg de poids humide) par centrifugation et éliminer le surnageant. Ajouter 350 μL de tampon RA1 au culot cellulaire et agiter vigoureusement au vortex. Note : Les agents réducteurs tels que le ß-mercaptoéthanol, le DTT ou le TCEP ne sont pas nécessaires. Transférer les cellules remises en suspension dans un tube MN Bead Tubes Type B et fermer le tube. Broyer sur un MN Bead Tube Holder : Mettre les tubes de billes MN Bead Tubes Type B horizontalement sur un vortex, par exemple en les fixant avec du ruban adhésif ou en utilisant un adaptateur spécial (par exemple, le MN Bead Tube Holder, voir les informations de commande). Vortexer les échantillons à pleine vitesse et à température ambiante pendant 3 minutes. Homogénéisation avec un broyeur rotatif: Il est également possible de placer les tubes MN Bead Tubes Type B dans un broyeur rotatif et d’effectuer un broyage à 30 Hz pendant 1 minute. Note : Dans les deux cas, nous recommandons vivement d’optimiser la procédure de broyage avec les billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en fonction de votre application et du matériel de départ afin d’obtenir un bon équilibre entre le rendement et l’intégrité de l’ARN. Centrifuger le tube MN Bead Tubes Type B pendant 1 minute à 11,000 × g pour sédimenter les billes. Récupérer le surnageant (lysat). Passer à l’étape 3 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe 5.1). 22 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA 5.3 Préparation d’ARN à partir de 5 × 10⁷ ou 30 mg de cellules de levure Les réactifs et composants supplémentaires à fournir par l’utilisateur : • Agent réducteur [ß-mercaptoéthanol, ou DTT (dithiothréithol) ou TCEP (BisTris (Bis-(2hydroxyéthyl)-imino-tris(hydroxyméthyl)-méthane)]. • Sorbitol et lyticase (ou zymolase) pour l’homogénéisation par digestion enzymatique • MN Bead Tubes Type B et MN Bead Tube Holder ou broyeur rotatif pour l’homogénéisation mécanique Avant de débuter la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 3. 1 Homogénéiser l’échantillon Deux protocoles alternatifs sont proposés pour l’homogénéisation des cellules de levure. Les utilisateurs peuvent choisir entre une digestion enzymatique (A) ou une homogénéisation mécanique (B), en fonction de l’équipement du laboratoire et de leurs préférences personnelles. L’homogénéisation par digestion enzymatique n’est recommandée que pour les cellules fraîchement récoltées, l’homogénéisation par rupture mécanique peut également être réalisée avec des culots de levure, conservés à -70 °C pendant plusieurs mois ou des levures stabilisées avec du NucleoProtect® RNA (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). Comme cela dépend fortement de l’organisme utilisé, nous recommandons de comparer à l’avance le matériel congelé et le matériel frais. Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents génomiques dans une préparation d’acide nucléique de levures par rapport à des cellules cultivées ou à du matériel tissulaire, il peut être nécessaire d’utiliser une quantité plus faible de cellules pour la préparation. A) Homogénéisation par digestion enzymatique Récolter les levures de 2 à 5 mL de culture YPD (5,000 × g ; 10 min). Resuspendre le culot dans une quantité appropriée de tampon sorbitol / lyticase fraîchement préparé (50 – 100 U de lyticase ou de zymolase dans 1 M de sorbitol / 100 mM d’EDTA) et incuber à 30 °C pendant 30 minutes. Concentrer les sphéroplastes obtenus par centrifugation (1,000 × g ; 10 min). Eliminer délicatement le surnageant. Note : Il peut être nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration en lyticase/zymolase, en fonction de la souche de levure. Ajouter 350 μL de tampon RA1 et 3,5 μL de ß-mercaptoéthanol et vortexer vigoureusement pour lyser les sphéroplastes. Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir le paragraphe 2.2. Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse RA1. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 23 NucleoSpin® RNA B) Homogénéisation par rupture mécanique Récolter les cellules de levure (environ 30 mg de poids humide) par centrifugation et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 350 μL de tampon de lyse RA1. Remarque : il n’est pas nécessaire d’utiliser un agent réducteur tel que le ß-mercaptoéthanol, le DTT ou le TCEP. Transférer les cellules remises en suspension dans un tube MN Bead Tubes Type B et fermer le tube. Utiliser un broyeur rotatif pour homogénéiser l’échantillon : Agiter les échantillons à 30 Hz pendant 10 secondes. Broyer les cellules avec un support MN Bead Tube Holder : Agiter les échantillons dans le support MN Bead Tube Holder pendant 3 minutes à vitesse maximale et à température ambiante. Dans les deux cas, nous recommandons vivement d’optimiser la procédure de broyage avec les billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en fonction de votre application et de votre matériel de départ afin d’obtenir un bon équilibre entre le rendement et l’intégrité de l’ARN. Centrifuger le tube MN Bead Tubes Type B pendant 1 minute à 11,000 × g pour sédimenter les billes. Récupérer le surnageant (lysat). Passer à l’étape 4 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe 5.1). 24 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA 5.4 Préparation d’ARN à partir de tissus inclus en paraffine* Réactifs supplémentaires à fournir par l’utilisateur : • Xylène Avant de débuter la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 3. A Introduire 10 mg de tissu finement haché dans un microtube de 1,5 mL (non fourni). Ajouter 300 μL de xylène et incuber 5 min avec un mélange constant à température ambiante. B Centrifuger à vitesse maximale (13 000 rpm) pendant 3 minutes pour collecter le tissu. Jeter le xylène. C Répéter les étapes A et B deux fois, pour un total de trois lavages au xylène. D Ajouter 300 μL d’éthanol à 96 % dans le tube et incuber 5 min en mélangeant constamment à température ambiante. E Centrifuger à vitesse maximale (13 000 rpm) pendant 3 minutes pour collecter le tissu. Jeter l’éthanol. F Répéter les étapes D et E, pour un total de deux lavages à l’éthanol. Continuer avec l’étape 1 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe 5.1). Note : Pour une extraction efficace de l’ARN à partir de tissus fixés à la formaline et inclus en paraffine, il est recommandé d’utiliser le kit NucleoSpin® totalRNA FFPE (REF 740982, voir les informations de commande, paragraphe 8.2) ou le kit NucleoSpin® totalRNA FFPE XS (REF 740969, voir les informations de commande, paragraphe 8.2). *Veuiller également vous référer à : Annunziata Gloghini, Barbara Canal, Ulf Klein, Luigino Dal Maso, Tiziana Perin, Riccardo Dalla-Favera, et Antonino Carbone RT-PCR Analysis of RNA Extracted from Bouin-Fixed and Paraffin-Embedded Lymphoid Tissues J Mol Diagn 2004 6 : 290 – 296 comme exemple de modification du protocole support mentionné ci-dessus. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 25 NucleoSpin® RNA 5.5 Purification de l’ARN de mélanges réactionnels Avant de débuter la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 a été préparé conformément au chapitre 3. 1 Préparer l’échantillon Ramener à un volume de 100 μL d’échantillon avec de l’H2O RNase-free. Si différents échantillons dont les volumes varient entre 100 et 200 μL sont purifiés, les échantillons d’ARN doivent être ramenés par exemple à 200 µL avec de l’H2O RNase-free pour uniformiser les volumes. 2 Préparer du tampon de lyse-fixation Préparer un mélange RA1 - éthanol avec un rapport de 1 :1. Pour chaque échantillon d’ARN de 100 μL, mélanger 300 μL de tampon RA1 et 300 μL d’éthanol (96 – 100 %). Si plusieurs échantillons sont traités, il est recommandé de préparer un prémix (par exemple, 2 mL de RA1 + 2 mL d’éthanol à 98 % pour environ 6 préparations de NucleoSpin® RNA ). 3 Filtrer le lysat Inutile ! 4 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN À chaque échantillon d’ARN de 100 μL, ajouter 600 μL (6 volumes) de mélange de RA1 - éthanol. Mélanger au vortex. Si 200 μL d’échantillons d’ARN sont traités, ajouter 1200 μL de mélange RA1éthanol. La capacité de chargement maximale des colonnes NucleoSpin® RNA est de 750 μL. Répéter la procédure si des volumes plus importants doivent être traités. Après l’ajout d’éthanol, un léger précipité peut apparaître, ce qui n’affectera pas la purification de l’ARN. Veiller à bien mélanger et à appliquer l’échantillon sous forme de solution homogène sur la colonne. Pour la capacité de fixation des colonnes, voir le tableau 1. Procéder aux étapes 5, 8 et 9 du protocole NucleoSpin® RNA standard (paragraphe 5.1). Les étapes 6 et 7 des protocoles respectifs peuvent être omises dans ce cas. Comme produits alternatifs pour la purification de l’ARN, NucleoSpin® RNA Clean up et NucleoSpin® RNA Clean up XS sont recommandés (voir les informations de commande, paragraphe 8.2). 26 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA 5.6 1 Extraction d’ARN à partir d’insectes Prélèvement d’échantillons Utiliser des échantillons frais, surgelés (-70 °C.) ou stabilisés grâce au NucleoProtect® RNA* (environ 1 – 10 mg d’insecte). * Veiller à éliminer l’excès de solution NucleoProtect® RNA de l’échantillon avant de commencer la procédure d’extraction de l’ARN. 2 Remise en suspension Ajouter 350 μL de tampon de lyse RA1 sans ß-mercaptoéthanol ni TCEP dans un tube MN Bead Tubes Type G et ajouter l’échantillon d’insecte. 3 Homogénéisation et lyse Broyer l’échantillon grâce aux billes à l’aide d’un broyeur Retsch (30 Hz, 1 – 3 min) ou d’un support MN Bead Tube Holder (pleine vitesse, 10 min). 4 Sédimentation des billes Retirer les billes d’acier du tube de billes (par exemple à l’aide d’un aimant), récupérer le lysat et l’appliquer sur le NucleoSpin® Filter (bague violette) conformément à l’étape 3 du paragraphe 5.1 du manuel d’utilisation. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 27 NucleoSpin® RNA Midi 6 Protocoles NucleoSpin® RNA Midi 6.1 Extraction d’ARN à partir de cellules cultivées et de tissus Avant de débuter la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 3. • For centrifugation, a centrifuge with a swing-out rotor and appropriate buckets capable of reaching 4,000 – 4,500 × g is required. 1 Homogénéiser l’échantillon Broyer jusqu’à 100 mg de tissu (pour les quantités d’échantillons, voir le paragraphe 2.2 ; pour les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.3). Broyer l’échantillon Jusqu’à 5 × 10⁷ cellules eucaryotes cultivées sont collectées par centrifugation et lysées par addition directe du tampon RA1. Pour choisir une quantité appropriée de produit de départ, voir le chapitre 2.2. 2 Lyse des cellules Ajouter 1,8 mL de tampon RA1 et 18 μL de ß-mercaptoéthanol (ß-ME) à l’échantillon broyé dans un tube à centrifuger de 15 mL (non fourni) et vortexer vigoureusement (utiliser 3,6 mL de tampon RA1 et 36 μL de ß-mercaptoéthanol pour les grandes quantités d’échantillons ; voir paragraphe2.2.) Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse RA1. 28 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 + 1,8 mLRA1 + 18 μL ß-ME NucleoSpin® RNA Midi 3 Filtrer le lysat Appliquer le lysat sur un NucleoSpin® Filter Midi placé dans un tube de collecte et centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à 4 500 × g. Cette étape permet d’homogénéiser l’échantillon en éliminant le matériel insoluble résiduel et en réduisant simultanément la viscosité du lysat. 4,500 × g, 10 min En cas de formation d’un culot visible (en fonction de la quantité et de la nature de l’échantillon), transférer le surnageant sans aucun culot formé dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL (non fourni). Si l’on travaille avec de petites quantités de cellules cultivées (par exemple, < 1 × 10⁷ cellules HeLa), l’étape 3 peut être remplacée par un mélange vigoureux de l’échantillon. 4 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN Jeter le NueoSpin® Filter Midi et ajouter 1,8 mL d’éthanol (70 %) au lysat dans le tube de collecte et mélanger en vortexant 2 × 5 s (utiliser 3,6 mL d’éthanol 70 % si l’on travaille avec de grandes quantités d’échantillons, voir l’étape 2 et le paragraphe 2.2). Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut devenir visible, ce qui n’affectera pas la suite de la procédure. Bien remettre en suspension les précipités avant de les charger sur la colonne NucleoSpin® RNA Midi. 5 + 1.8 mL d’éthanol à 70 % + 1,8 mL d’éthanol à 70 Mélanger Fixer l’ARN Charger le mélange lysat-éthanol (maximum 3,8 mL) sur une colonne NucleoSpin® RNA Midi. Centrifuger pendant 3 minutes à 4,500 × g. Charger max. 3,8 mL de lysat Si vous travaillez avec de grandes quantités d’échantillons, appliquez le reste du mélange lysat-éthanol (max. 3,8 mL) sur la colonne et centrifugez à nouveau. 4,500 × g, 3 min Si le lysat n’a pas traversé la colonne, centrifuger à nouveau à 4,500 × g pendant 10 minutes. En cas de surcharge de la colonne, un écoulement incomplet de l’échantillon peut être observé, par exemple si la membrane est encore humide ou si une partie du lysat n’est pas passée. Retirer le lysat qui n’a pas traversé la colonne et passer à l’étape suivante du protocole. La prochaine fois, utiliser moins de matériel de départ et éliminer soigneusement le matériel insoluble à l’étape 3. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 29 NucleoSpin® RNA Midi 6 Dessaler la membrane de silice Ajouter 2,2 mL de MDB (Membrane Desalting Buffer) à la colonne NucleoSpin® RNA Midi. Centrifuger pendant 3 minutes à 4,500 × g. Jeter le filtrat. Si la membrane de silice n’est pas complètement sèche après la centrifugation, centrifuger à nouveau à 4,500 × g pendant 10 minutes. Cette étape permet d’obtenir les conditions de réaction optimales pour la rDNase. 7 + 2.2 mL MDB 4,500 × g, 3 min Digérer l’ADN Préparer le mélange réactionnel pour la DNase : dans un microtube stérile, mélanger 235 μL de tampon de réaction pour la rDNase et 25 μL de rDNase reconstituée (voir chapitre 3) par colonne NucleoSpin® RNA Midi. Mélanger soigneusement mais délicatement. Digérer avec la rDNase + 250 μL de mélange réactionnel rDNase RT, 15 min Appliquer 250 μL de mélange réactionnel de rDNase directement au centre de la membrane de silice. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. 8 Laver et sécher la membrane de silice 1er lavage Ajouter 2,6 mL de tampon RAW2 à la colonne NucleoSpin® RNA Midi. Incuber à température ambiante pendant 2 minutes. Centrifuger pendant 3 minutes à 4 500 × g. Jeter le filtrat et replacer la colonne dans le tube collecteur (15 mL). Le tampon RAW2 inactive la rDNase. + 2.6 mL RAW2 4,500 × g, 3 min + 2.6 mL RA3 2ème lavage Ajouter 2,6 mL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin® RNA Midi. Centrifuger pendant 3 minutes à 4 500 × g. 4,500 × g, 3 min Le filtrat ne doit pas être jeté lors de cette étape. Laisser la colonne NucleoSpin® RNA Midi dans le tube collecteur. 3ème lavage + 2.6 mL RA3 ® Ajouter 2,6 mL de tampon RA3 à la colonne NucleoSpin RNA Midi. Centrifuger pendant 5 minutes à 4 500 × g pour sécher complètement la membrane. Placer la colonne dans un nouveau tube de collecte (15 mL, fourni). 30 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 4,500 × g, 5 min NucleoSpin® RNA Midi 9 Eluer l’ARN Pipeter 500 μL d’H2O RNase-free (fourni) directement au centre de la membrane de silice. Incuber à température ambiante pendant 2 min et centrifuger pendant 3 min à 4 500 × g. La réduction du volume d’élution n’entraîne généralement pas une augmentation de la concentration de l’acide nucléique élué avec le kit NucleoSpin® RNA Midi (voir paragraphe 2.4 pour les procédures d’élution alternatives). MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 + 500 μL RNase-free H2O RT, 2 min 4,500 × g, 3 min 31 NucleoSpin® RNA Midi 6.2 Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 5 × 10⁹ cellules bactériennes Réactif supplémentaire à fournir par l’utilisateur : • Lysozyme ou • MN Bead Tubes Type B (voir informations de commande, paragraphe 8.2) Avant de commencer la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 3. 1 Homogénéiser A) Homogénéisation par digestion enzymatique Remettre en suspension le culot de cellules bactériennes (souches Gram négatif) dans 200 μL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ; pH 8) contenant 1 mg/mL de lysozyme en vortexant vigoureusement. Incuber à 37 °C pendant 10 minutes. Pour la préparation de l’ARN des bactéries Gram-positives, remettre en suspension les cellules dans 200 μL de TE contenant 2 mg/mL de lysozyme. Il peut être nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration en lysozyme, en fonction de la souche bactérienne. Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents génomiques dans une préparation d’acide nucléique de bactéries par rapport au matériel eucaryote, il peut être nécessaire d’utiliser une quantité plus faible de cellules pour la préparation. Ajouter 1,8 mL de tampon RA1 et 1,8 μL de ß-mercaptoéthanol à la suspension et vortexer vigoureusement. Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir le paragraphe 2.2 Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse RA1. B) Homogénéisation par rupture mécanique Concentrer les cellules par centrifugation et éliminer le surnageant. Ajouter des billes de verre (par exemple, MN Bead Type B1 (en vrac), 40 – 70 mm ou MN Bead Type B2 (en vrac), 0,3 – 0,4 mm, voir les informations de commande). Agiter les échantillons dans un broyeur à 30 Hz pendant 15 minutes. Remarque : les agents réducteurs tels que le ß-mercaptoéthanol, le DTT et le TCEP peuvent être dispensés (en fonction de l’échantillon). Note : Nous recommandons vivement d’optimiser la procédure de broyage des billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en fonction de votre application et de votre matériel de départ afin d’obtenir un bon équilibre entre le rendement et l’intégrité de l’ARN. 32 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA Midi 1 Filtrer le lysat Réduire la viscosité et la turbidité de la solution par filtration à travers le NucleoSpin® Filter Midi. Placer le NucleoSpin® Filter Midi dans un tube collecteur, appliquer le mélange et centrifuger pendant 10 minutes à 4 500 × g. En cas de formation d’un culot visible (en fonction de la quantité et de la nature de l’échantillon), transférer le surnageant sans le culot dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL (non fourni). 2 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN Ajouter 1,8 mL d’éthanol (70 %) au lysat et mélanger au vortex. Passer à l’étape 5 du protocole standard NucleoSpin® RNA Midi (paragraphe 6.1). MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 33 NucleoSpin® RNA Midi 6.3 Préparation d’ARN à partir d’un maximum de 3 × 10⁸ cellules de levure Les réactifs et composants supplémentaires doivent être fournis par l’utilisateur : • Agent réducteur [ß-mercaptoéthanol, ou DTT (dithiothréithol), ou TCEP (BisTris (Bis-(2hydroxyéthyl)-imino-tris(hydroxyméthyl)-méthane)]. • Sorbitol et lyticase (ou zymolase) pour l’homogénéisation par digestion enzymatique ou broyeur et billes de verre pour l’homogénéisation par rupture mécanique. Avant de commencer la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 3. 34 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA Midi 1 Homogénéiser l’échantillon Deux protocoles alternatifs sont proposés pour l’homogénéisation des cellules de levure. Les utilisateurs peuvent choisir entre une digestion enzymatique (A) ou une homogénéisation mécanique (B), en fonction de l’équipement du laboratoire et de leurs préférences personnelles. L’homogénéisation par digestion enzymatique n’est recommandée que pour les cellules fraîchement récoltées. L’homogénéisation par rupture mécanique peut également être réalisée avec des culots de cellules de levure, conservés à -70 °C pendant plusieurs mois. Note : En raison de la concentration beaucoup plus élevée d’équivalents génomiques dans une préparation d’acide nucléique de levures par rapport à des cellules cultivées ou à du matériel tissulaire, il peut être nécessaire d’utiliser une quantité plus faible de cellules pour la préparation. A) Homogénéisation par digestion enzymatique Récolter une quantité appropriée de cellules de la culture YPD (5,000 × g ; 10 min). Resuspendre le culot dans une quantité appropriée de tampon sorbitol / lyticase fraîchement préparé (50 – 100 U de lyticase ou de zymolase dans 1 M de sorbitol / 100 mM d’EDTA) et incuber à 30 °C pendant 30 minutes. Concentrer les sphéroblates obtenus par centrifugation (1,000 × g ; 10 min). Jeter soigneusement le surnageant. Il peut être nécessaire d’optimiser le temps d’incubation et la concentration en lyticase/zymolase, en fonction de la souche de levure. Poursuivre avec l’étape 2. OU B) Homogénéisation par rupture mécanique Récolter une quantité appropriée de cellules de la culture YPD (5,000 × g ; 10 min) et laver avec de l’eau glacée. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un mélange de 3,6 mL de tampon RA1 et 36 μL de ß-mercaptoéthanol. Ajouter les billes de broyage (par exemple, MN Bead Type B (en vrac) ou C (en vrac), voir les informations de commande). Agiter les échantillons dans un broyeur à 30 Hz pendant 15 minutes. Passer à l’étape 3 Filtrer le lysat. Remarque : les agents réducteurs tels que le ß-mercaptoéthanol, le DTT et le TCEP peuvent être dispensés (en fonction de l’échantillon). Note : Nous recommandons vivement d’optimiser la procédure de broyage des billes (augmentation ou diminution du temps de broyage) en fonction de votre application et du matériel de départ afin d’obtenir un bon équilibre entre le rendement et l’intégrité de l’ARN. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 35 NucleoSpin® RNA Midi 2 Lyse des cellules Ajouter 3,6 mL de tampon RA1 et 36 μL de ß-mercaptoéthanol et vortexer vigoureusement pour lyser les sphéroplastes. Pour les quantités appropriées d’échantillon et de tampon de lyse, voir la section 2.2. Note : L’agent réducteur DTT ou TCEP peut être utilisé à la place du ß-ME. Utiliser une concentration finale de 10 – 20 mM de DTT ou de TCEP dans le tampon de lyse RA1. 3 Filtrat lysat Réduire la viscosité et la turbidité de la solution par filtration à travers NucleoSpin® Filter Midi. Placer NucleoSpin® Filter Midi dans les tubes collecteurs et centrifuger pendant 10 minutes à 4 500 × g. En cas de formation d’un culot visible (en fonction de la quantité et de la nature de l’échantillon), transférer le surnageant sans le culot dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL (non fourni). 4 Ajuster les conditions de fixation des ARN Jeter le NucleoSpin® Filter Midi et ajouter 3,6 mL d’éthanol à 70 % au lysat dans le tube collecteur et mélanger au vortex. Passer à l’étape 5 du protocole standard NucleoSpin® RNA Midi (paragraphe 6.1). 36 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA Midi 6.4 Purification de l’ARN de mélanges réactionnels Avant de commencer la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 a été préparé conformément au chapitre 3. 1 Préparer l’échantillon Compléter les échantillons d’ARN < à 500 μL avec de l’H2O RNase-free jusqu’à 500 μL. 2 Préparer le prémix de tampon de lyse et de fixation Préparer un prémix de tampon RA1 - éthanol avec un rapport de 1 :1. Pour chaque échantillon d’ARN de 500 μL, mélanger 1500 μL de tampon RA1 et 1500 μL d’éthanol (96 – 100 %). Si plusieurs échantillons sont traités, il est recommandé de préparer un masterprémix (par exemple, 2 mL de RA1 + 2 mL d’éthanol à 98 % pour environ 6 préparations de NucleoSpin® RNA ). 3 Filtrer le lysat Inutile ! 4 Ajuster les conditions de fixation de l’ARN À 500 μL d’échantillon d’ARN, ajouter 3000 μL (6 volumes) de premix de tampon RA1-éthanol. Mélanger l’échantillon avec le prémix par vortex. La capacité de chargement maximale des colonnes NucleoSpin® RNA Midi est de 4 000 μL. Répéter la procédure si des volumes plus importants doivent être traités. Après l’ajout d’éthanol, un précipité filandreux peut devenir visible, ce qui n’affectera pas la purification de l’ARN. Veiller à bien mélanger et à appliquer l’échantillon sous forme de solution homogène sur la colonne. Pour la capacité de fixation des colonnes, voir le Tableau 1. Passer aux étapes 5, 8 et 9 du protocole standard NucleoSpin® RNA Midi (paragraphe 6.1). Les étapes 6 et 7 des protocoles respectifs peuvent être omises dans ce cas. Les produits NucleoSpin® RNA Clean up et NucleoSpin® RNA Clean up XS sont recommandés comme produits alternatifs pour la purification de l’ARN (voir les informations de commande). MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 37 NucleoSpin® RNA / NucleoSpin® RNA Midi 7 Protocoles NucleoSpin® RNA / NucleoSpin® RNA Midi 7.1 Préparation d’ARN à partir d’échantillons traités avec du NucleoProtect® RNA ou du RNAlater® Avant de commencer la préparation : • Vérifier que le tampon de lavage RA3 et la rDNase ont été préparés conformément au chapitre 33. 1 Préparer l’échantillon Retirer la solution NucleoProtect® RNA/RNAlater®. Couper une quantité appropriée de tissu. 2 Lyse des cellules Ajouter 350 μL (NucleoSpin® RNA) / 1,8 mL (NucleoSpin® RNA Midi) de tampon RA1 et 3,5 μL (NucleoSpin® RNA) / 18 μL (NucleoSpin® RNA Midi) de ß-mercaptoéthanol à l’échantillon. Broyer l’échantillon en utilisant, par exemple, des homogénéisateurs à rotor-stator (pour les méthodes d’homogénéisation, voir le paragraphe 2.3). Passer à l’étape 3 (filtrer le lysat) des protocoles standards NucleoSpin® RNA (paragraphe 5.1) ou NucleoSpin® RNA Midi (paragraphe 6.1). 7.2 Digestion rDNase en solution La digestion à la rDNase sur colonne dans le protocole standard est très efficace et produit un minimum d’ADN résiduel. Cet ADN ne sera pas détectable dans la plupart des applications en aval. Malgré cela, certaines applications requièrent des teneurs en ADN résiduel encore plus faibles. L’élimination de l’ADN à un niveau totalement indétectable est un défi et l’efficacité d’une digestion de l’ADN sur colonne n’est parfois pas suffisante pour les applications en aval exigeant une teneur résiduelle en ADN la plus faible possible. Un exemple typique d’une application exigeante est la réaction de RT-PCR dans laquelle les amorces ne font pas la différence entre l’ADNc (dérivé de l’ARN) et l’ADN génomique contaminant. En particulier, si • les cibles à nombre de copies élevé sont analysées (par exemple, les cibles multi-familles de gènes, mitochondriales, plastidiales ou plasmidiques (à partir de transfections)). • le gène cible a un niveau d’expression très faible • l’amplicon est relativement petit (< 200 pb). La digestion de l’ADN en solution peut dégrader efficacement l’ADN contaminant. Toutefois, un contrôle rigoureux de la RNase et une purification ultérieure de l’ARN (afin d’éliminer le tampon, les sels, la DNase et l’ADN digéré) sont généralement nécessaires. La DNase recombinante RNase-free (rDNase) de haute qualité contenue dans les kits NucleoSpin® RNA facilite cette digestion en solution afin d’éliminer même les traces d’ADN contaminant. 38 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 NucleoSpin® RNA / NucleoSpin® RNA Midi A Digérer l’ADN (Condition réactionnelle) Ajouter 6 μL de tampon de réaction rDNase et 0,6 μL de rDNase à 60 μL d’ARN élué. (Alternativement, prémix 100 μL de tampon de réaction rDNase et 10 μL de rDNase et ajouter 1/10 de volume à un volume d’éluat d’ARN). Agiter doucement le tube afin de mélanger la solution. Centrifuger doucement (environ 1 s à 1,000 × g) pour recueillir toutes les gouttelettes de la solution au fond du tube. B Incuber l’échantillon Incuber pendant 10 minutes à 37 °C. C Repurifier l’ARN Repurifier l’ARN à l’aide d’une procédure de purification de l’ARN appropriée, par exemple en utilisant les kits NucleoSpin® RNA Clean up, NucleoSpin® RNA Clean up XS (voir les informations relatives à la commande), ou par précipitation à l’éthanol. Précipitation de l’éthanol, à titre d’exemple : Ajouter 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol 96 – 100 % à un volume d’échantillon. Mélanger soigneusement. Incuber quelques minutes à quelques heures à -20 °C ou 4 °C. Note : Appliquer des temps d’incubation longs si l’échantillon contient une faible concentration d’ARN. Des temps d’incubation courts sont suffisants si l’échantillon contient une forte concentration d’ARN. Centrifuger pendant 10 minutes à vitesse maximale. Laver le culot d’ARN avec de l’éthanol à 70 %. Sécher les culots d’ARN et remettre l’ARN en suspension dans du H2O RNasefree. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 39 Extraction des ARN 8 Annexes 8.1 Guide de résolution des problèmes Problèmes Causes possible et suggestions Contamination par les RNases ARN dégradé / rendement nul • Créer un environnement de travail RNase-free. Porter des gants pendant toutes les étapes de la procédure. Changer de gants fréquemment. Il est recommandé d’utiliser des tubes en polypropylène stériles et jetables. Garder les tubes fermés dans la mesure du possible pendant la préparation. La verrerie doit être soumise à un traitement thermique pendant au moins 2 heures à 250 °C avant d’être utilisée. Mauvaise utilisation ou préparation erronée des réactifs • Les réactifs n’ont pas été correctement préparés. Ajouter le volume indiqué d’H2O RNase-free au flacon de rDNase et d’éthanol 96 % au tampon concentré RA3 et mélanger. Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée conformément aux instructions données au chapitre 3. • L’échantillon et les réactifs ont été mal homogénéisés. Toujours vortexer vigoureusement après l’ajout de chaque réactif. • L’éthanol n’a été ajouté après la lyse. La fixation de l’ARN à la membrane de silice n’est efficace qu’en présence d’éthanol. Stockage du kit ARN de faible qualité / rendement faible • Reconstituer et stocker la rDNase lyophilisée selon les instructions données au chapitre 3. • Stocker les autres composants du kit à température ambiante. Le stockage à des températures inférieures peut provoquer une précipitation de sel. • Garder les flacons bien fermés afin d’éviter l’évaporation ou la contamination des solutions. Influence de la force ionique et du pH sur l’absorption A260 sur le rapport A₂₆₀/A₂₈₀. • Pour les mesures d’absorption, utiliser 5 mM Tris pH 8,5 comme diluant. Voir aussi : - Manchester, K L. 1995. Value of A₂₆₀/A₂₈₀ ratios for measurement of purity of nucleic acids. Biotechniques 19, 208 – 209. - Wilfinger, W W, Mackey, K et Chomczyski, P. 1997. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques 22, 474 – 481. 40 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN Problèmes Causes possible et suggestions Echantillon ARN de faible qualité / rendement faible (suite) • Mauvaises conditions de stockage des échantillons. Dans la mesure du possible, utiliser du matériel frais. Si ce n’est pas possible, congeler rapidement les échantillons dans de l’azote liquide. Les échantillons doivent toujours être conservés à -70 °C. Ne jamais laisser les tissus décongeler avant l’ajout du tampon RA1. Effectuer le broyage des échantillons dans de l’azote liquide. Il est également possible de conserver les tissus dans du NucleoProtect®RNA ou des réactifs de protection similaires. • Broyage et/ou homogénéisation insuffisante de l’échantillon. Veiller à ce que l’échantillon soit bien broyé et utiliser les filtres NucleoSpin® Filters / Filters Midi pour faciliter l’homogénéisation du lysat. Contamination par du thiocyanate de guanidinium Faible ratio A260 / A230 • Déposer soigneusement le lysat sur la colonne NucleoSpin® RNA et essayer d’éviter toute contamination de la partie supérieure de la colonne et de son couvercle. • S’assurer qu’une quantité / concentration suffisante d’ARN est utilisée pour la quantification afin que la valeur A230 soit significativement plus élevée que la ligne de base. Echantillons • Quantité excessive de matériel initial. Une surcharge peut entraîner une diminution du rendement global. Réduire la Colonne quantité d’échantillon de départ ou utiliser un plus grand volume NucleoSpin® RNA colmatée / de tampon RA1. faible rendement • Broyage et/ou homogénéisation insuffisante de l’échantillon. et/ou qualité Veiller à ce que l’échantillon soit bien broyé et utiliser les filtres NucleoSpin® Filters / Filters Midi pour faciliter l’homogénéisation du lysat. rDNase inactive • Reconstituer et conserver la rDNase lyophilisée selon les instructions données au chapitre 3. Contamination de l’ARN par l’ADN génomique Solution de rDNase mal appliquée • Déposer la solution de rDNase directement au centre de la membrane de silice. Trop d’échantillon de départ • Réduire la quantité de cellules ou de tissus utilisés. MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 41 Extraction des ARN Problèmes Causes possible et suggestions Système de détection de l’ADN trop sensible • La contamination en ADN est efficacement réduite par la digestion à la rDNase effectuée sur la membrane. Cependant, il est difficile de garantir l’élimination complète de l’ADN et, pour des applications très sensibles, il peut parfois s’avérer que de l’ADN résiduel soit détecté. Contamination de l’ARN par l’ADN génomique (suite) • Le système NucleoSpin® RNA est vérifié par la procédure suivante : un million de cellules HeLa sont soumises à l’extraction d’ARN conformément au protocole. L’éluat d’ARN est utilisé comme modèle pour la détection par PCR d’un fragment de 1 kb dans une réaction de 30 cycles. En général, aucun produit PCR n’est obtenu, tandis que l’omission de la digestion par la rDNase conduit habituellement à des résultats PCR positifs. • La probabilité de détection de l’ADN par PCR augmente avec : - le nombre de copies d’ADN par préparation : cible monocopie < cible plastidiale / mitochondriale < plasmide transfecté dans les cellules - diminution de la taille de l’amplicon PCR. • Utiliser des cibles de PCR plus grandes (par exemple, > 500 pb) ou des amorces couvrant des introns si possible. • Utiliser le protocole de support 7.2 pour une digestion complémentaire en solution avec de la rDNase. Contamination par de l’éthanol ou des sels • Ne pas laisser l’embout de sortie de la colonne entrer en contact avec le filtrat après le second lavage avec le tampon RA3. Veiller à centrifuger à la vitesse et pendant la durée recommandée afin d’éliminer totalement le tampon éthanolique RA3. Performance suboptimale de l’ARN dans les applications avales • Vérifier que le tampon RA3 a été équilibré à la température ambiante avant de l’utiliser. Le lavage à des températures plus basses réduit l’efficacité de dessalage par le tampon RA3. Stocker correctement l’ARN isolé • L’ARN élué doit être conservé sur la glace pour garantir sa stabilité en raison de l’omniprésence des traces de RNases (matériel du laboratoire, traces de doigts, poussières) susceptibles de dégrader l’ARN purifié. Pour un stockage à court terme, stocker à -20 °C et à -70 °C pour une conservation à long terme. 42 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Extraction des ARN 8.2 Informations pour la commande Produit REF Paquet de NucleoSpin RNA 740955.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® RNA Midi 740962.20 20 NucleoSpin miRNA 740971.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® ARN / Protein 740933.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® TriPrep 740966.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin RNA Clean up (purification de l’ARN) 740948.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® RNA XS 740902.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin RNA Clean up XS 740903.10 / .50 / .250 10 / 50 / 250 NucleoSpin® RNA/DNA Buffer Set 740944 Convient pour 100 préparations Tampon RA1 740961 / .500 60 / 500 mL Set rDNase 740963 1 set 740395.107 107 mg NucleoProtect RNA 740400.50 / .250 50 / 250 / 500 MN Bead Tubes Type B 740812.50 50 MN Bead Type B1 (en vrac) 40 – 70 mm billes de verre 740809.B.5000 750 g MN Bead Type B2 (Bulk) 0.3 – 0.4 mm billes de verre 740812.B.1000 750 g MN Bead Tubes Type C 740813.50 50 MN Bead Type C (en vrac) Billes de corindum de 1 mm 740813.B.250 200 g MN Bead Tube Holder pour tubes de billes 740469 1 NucleoSpin® Filters 740606 50 Tubes collecteurs (2 mL) 740600 1000 ® ® ® ® TCEP ® Visitez notre site www.mn-net.com pour plus d’informations sur nos produits MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 43 Extraction des ARN 8.3 Restrictions d’utilisation / garantie Tous les produits MACHEREY‑NAGEL sont conçus uniquement pour l’usage auquel ils sont destinés. Ils ne sont pas destinés à être utilisés pour un autre usage. La description de l’usage prévu des produits est disponible dans les notices originales des produits MACHEREY NAGEL. Avant d’utiliser nos produits, veuillez lire attentivement le mode d’emploi et les consignes de sécurité figurant dans la Fiche de Données de Sécurité du produit. Ce produit MACHEREY‑NAGEL comporte une documentation énonçant les spécifications et d’autres informations techniques. MACHEREY‑NAGEL garantit la conformité du produit aux spécifications déclarées. La garantie fournie est limitée aux spécifications et descriptions des données indiquées dans la documentation originale MACHEREY‑NAGEL. Aucune autre déclaration, verbale ou écrite, par des employés, agents ou représentants de MACHEREY NAGEL n’est autorisée, à l’exception des déclarations écrites signées par un représentant dûment habilité de MACHEREY‑NAGEL. Le client ne doit pas s’y fier et elles ne font pas partie d’un contrat de vente ou de la présente garantie. La responsabilité pour tous les dommages éventuels survenant en lien avec nos produits est limitée au strict minimum, comme indiqué dans les conditions générales de vente de MACHEREY‑NAGEL, dans leur dernière version, disponibles sur le site internet de la société. MACHEREY‑NAGEL n’assume aucune autre garantie. Les produits et leur application sont susceptibles de modifications. Par conséquent, veuillez contacter notre Equipe Service Technique pour obtenir les informations les plus récentes sur les produits MACHEREY‑NAGEL. Vous pouvez également contacter votre revendeur local pour obtenir des informations scientifiques à caractère général. Les descriptions figurant dans la documentation MACHEREY‑NAGEL sont fournies à titre d’information uniquement. Dernière mise à jour : 08/2022, Rev. 04 Veuillez contacter : MACHEREY NAGEL GmbH & Co. KG Tel. : +49 24 21 969 333 [email protected] Marques déposées : NucleoSpin® est une marque déposée de MACHEREY NAGEL GmbH & Co KG Tous les noms et dénominations utilisés peuvent être des marques, des marques déposées ou des marques enregistrées par leurs propriétaires respectifs, même s’ils ne sont pas des dénominations spéciales. La mention de produits et de marques n’est qu’une information (c’est-à-dire qu’elle ne porte pas atteinte aux marques et aux marques déposées et ne peut être considérée comme une recommandation ou une évaluation). En ce qui concerne ces produits ou services, nous ne pouvons accorder aucune garantie quant à leur sélection, leur efficacité ou leur fonctionnement. 44 MACHEREY-NAGEL – 11/2023, Rev. 22 Plasmid DNA Clean up RNA DNA Viral RNA and DNA Protein High throughput Accessories Auxiliary tools www.mn-net.com A025755/113xx MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG · Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Germany DE +49 24 21 969-0 [email protected] CH +41 62 388 55 00 [email protected] FR +33 388 68 22 68 [email protected] US +1 888 321 62 24 [email protected] ">
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