NOTICE D’UTILISATION PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques de l'herpèsvirus bovin de type 1 dans le sérum et le lait de vache Référence Catalogue 7610359 Pub. Nº MAN0013868 Rév. A.0 AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Introduction L'herpèsvirus bovin de type 1 (BHV-1) est un virus de la sous-famille des Alpha-herpesvirinae, qui est responsable d'une infection virale touchant les bovins. Cette infection inclut une grande variété de symptômes dont la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR), la vulvovaginite pustuleuse infectieuse (IPV) et la balanoposthite pustuleuse infectieuse (IPB). Après infection, le virus entre dans une phase de latence. Dans certaines conditions de stress, il peut se réactiver et être excrété à intervalles irréguliers. Le dépistage des bovins porteurs du BHV-1 occupe une place essentielle dans les programmes de contrôle de l'infection et dans les activités de commerce internationales. Il doit donc s'appuyer sur des tests sérologiques très sensibles. Applied Biosystems™ PrioCHECK™ BHV−1 gB Ab Strip Kit qui est un test à la fois simple, spécifique et très sensible permet de détecter les anticorps dirigés contre la glycoprotéine de surface B du BHV-1. Les échantillons de sérums étant testés non dilués, le PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit ELISA détecte mieux les taux faibles d'anticorps que le test de neutralisation virale. Les anticorps peuvent également être détectés dans le lait de tank. PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit constitue donc un outil simple et pratique pour déterminer le statut des troupeaux de bovins par rapport à l'infection à BHV-1. Principe du test PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit est un ELISA compétition. Les microplaques sont coatées avec l'antigène BHV-1. Les sérums non dilués (ou dilués) ou les échantillons de lait dégraissé (lait de tank) non dilués, sont incubés toute la nuit dans les puits des microplaques coatées avec l'antigène BHV-1. Pendant cette phase de pré-incubation, les anticorps spécifiques du BHV-1, s'ils sont présents dans l'échantillon, vont réagir spécifiquement avec l'antigène BHV-1. Après incubation et lavage des plaques, un anticorps monoclonal dirigé contre la gB du BHV-1 et conjugué à la peroxydase est déposé dans les puits. Après le lavage des puits, le substrat chromogène (TMB) est ensuite ajouté. Le développement de la coloration est stoppé et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm. Composition du coffret Coffret de 5 plaques pour 440 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à la date d’expiration qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous). Composant Description Composant 1 : Microplaque Cinq microplaques. Composant 2 : Conjugué (30x) (concentré 30x, à diluer avant utilisation). Un flacon contenant 2.5 mL de conjugué. Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste avant utilisation. Composant 3 : Tampon de dilution (2x) Concentré 2x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 60 mL de tampon de dilution. Stabilité du tampon de dilution solution de travail : 4 heures à 22±3°C. Composant 4 : Solution de lavage (200x) Concentré 200x, à diluer avant utilization. Un flacon contenant 60 mL de solution de lavage. Stabilité de la solution de lavage : 1 semaine à 22±3°C. Composant 5 : Eau déminéralisée Deux flacons, chaque contenant 10 mL d'eau déminéralisée. Composant 6 : Sérum de cheval Lyophilisé. Cinq flacons, chaque contenant 2.5 mL de sérum de cheval lyophilisé. Stabilité sérum de cheval reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C. Composant 7 : Sérum de contrôle négatif Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 3.0 mL de sérum de contrôle négatif. Composant 8 : Sérum de contrôle positif faible Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 3.0 mL de sérum de contrôle positif faible. Composant 9 : Sérum de contrôle positif Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 3.0 mL de sérum de sérum de contrôle positif. Composant 10 : Substrat chromogène (TMB) Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de substrat chromogène (TMB). Composant 11 : Solution d'arrêt Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de solution d'arrêt. Autres composants du coffret • Notice d'utilisation • 10 films adhésifs pour couvrir les plaques Equipement nécessaire mais non fourni Description(1) Use (1) Général Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales. Incubation Incubateur de microplaque (chauffant au moins à 50°C). Analyse des résultats Lecteur de microplaques. Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire les plaques à 450 nm. Optionnel Laveur de microplaques. Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. Mode opératoire Précautions • Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte. • PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit ne doit être réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela. • Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être considéré comme potentiellement contaminé. Remarques Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit, les précautions suivantes doivent être prises : • Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi. • Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C) avant utilisation. • L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé. • Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif. • Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de péremption ou si un changement dans leur aspect est observé. • Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests. • Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau équivalente. Solutions à préparer à l'avance Tampon de dilution solution de travail Le tampon de dilution (2x) (Composant 3) doit être dilué au 1:2 dans de l'eau déminéralisée. Pour une plaque : préparer 24 mL (12 mL de tampon de dilution (2x) + 12 mL d'eau déminéralisée). Stabilité du tampon de dilution solution de travail : 4 heures à 22±3°C. Sérum de cheval Reconstituer le sérum de cheval (Composant 6) avec 2.5 mL de l'eau déminéralisée (Composant 5). Conserver à −20°C après reconstitution. Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante : 1. Ramener le flacon à T° ambiante (22±3°C). 2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon. 3. Ouvrir le flacon. 4. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée. 5. Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le lyophilisat soit entièrement dissout. 6. Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C. 7. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la formation de mousse). Tampon ELISA Ajouter le sérum de cheval reconstitué au tampon de dilution solution de travail pour obtenir une concentration finale de 10% (v/v). Pour une plaque : préparer 24 mL (2.4 mL de sérum de cheval + 21.6 mL de tampon de dilution solution de travail). Conserver le tampon ELISA non utilisé à 5±3°C pendant 24 heures. Dilution du Conjugué Préparer la dilution de travail du conjugué (Composant 2) en diluant le conjugué (30x) dans le tampon ELISA. Pour une plaque : préparer 10.5 mL de conjugué dilué. Remarque : La dilution de travail du conjugué doit être préparée juste avant utilisation. Solution de lavage La solution de lavage (200x) (Composant 4) doit être diluée 1:200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité fournie permet de préparer un volume final de 12 litres. Stabilité de la solution de lavage diluée : 1 semaine à 22±3°C. Remarque : Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques peut être fait manuellement avec 200–300 µL de solution de lavage par puits. Vider ensuite les plaques et répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est pas nécessaire d'égoutter les plaques entre les cycles de lavage. Tapoter fermement les barrettes sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. Remarque : Voir Annexe B pour la préparation et la conservation des échantillons. Jour 1 : Incubation des échantillons de sérum dans la plaque sensibilisée 1. Déposer 100 µL de tampon ELISA dans les puits A1 et B1 les barrettes (Composant 1). 2. Déposer 100 µL de sérum de contrôle négatif (Composant 7) dans les puits C1 et D1. 3. Déposer 100 µL de sérum de contrôle positif faible (Composant 8) dans les puits E1 et F1. 4. Déposer 100 µL de sérum de contrôle positif (Composant 9) dans les puits G1 et H1. 5. Déposer 100 µL de chaque échantillon dans les autres puits. - Les sérums peuvent être testés non dilués ou dilués après avoir effectué des dilutions au 1:2 dans du tampon ELISA. - Les échantillons de lait dégraissé doivent être testés non dilués. 6. Couvrir la plaque avec un film adhésif fourni dans le coffret. 7. Incuber toute la nuit (16–18 heures) à 37±1°C. Jour 2 : Incubation avec le conjugue et avec le substrat chromogène (TMB) 1. Vider la plaque après incubation et la laver 6 fois avec la solution de lavage. La tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. 2. Distribuer 100 µL de solution de travail du conjugué dans tous les puits. 3. Couvrir la plaque avec un film adhésif fourni dans le coffret. 4. Incuber 60±5 minutes à 37±1°C. 5. Vider la plaque après incubation et la laver 6 fois avec la solution de lavage. La tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. 6. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) (Composant 10) dans tous les puits. 7. Incuber 15 minutes à 22±3°C. 8. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 11) dans tous les puits. 9. Homogénéiser le contenu de la plaque avant de mesurer. Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes après avoir déposé le substrat chromogène. Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène. Lecture du test et calcul des résultats 1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la solution d'arrêt. 2. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 et B1 (= DO450 max). 3. Le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums de contrôle et des échantillons est calculé selon la formule ci-dessous. Remarque : La DO450 de chaque échantillon est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par rapport à la DO450 max. PI = 100 − (DO450 de l'échantillon / DO450 max) × 100 Interprétation des résultats Validation des critères 1. La DO450 max doit être >1.000. 2. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle négatif doit être <40%. 3. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle positif faible doit être >40%. 4. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle positif doit être >70%. Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont ininterprétables. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 8 Mars 2019 Remarque : Si la DO450 d'un échantillon est supérieure à la DO450 max, le pourcentage d'inhibition peut être considéré comme étant égal à 0%. Si la DO450 max est inférieure à 1.000, de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les barrettes plus longtemps (sans dépasser 30 minutes d'incubation). Si la DO450 max corrigée est supérieure à 2.000, il est conseillé de diminuer le temps d'incubation avec de substrat chromogène (TMB). Interprétation du pourcentage d'inhibition PI <40% PI ≥40% Négatif Positif Absence d'anticorps spécifiques du BHV-1 Présence d'anticorps spécifiques du BHV-1 Remarque : Dans le cas d'un titrage, le titre des anticorps est défini comme l'inverse de la plus grande dilution donnant un PI >40%. Annexe A – Références 1. Ackermann M, Belak S, Bitsch V, Edwards S, Moussa A, Rockborn G, Thiry E (1990). Vet Microbiol 23:361–363. 2. Kramps JA, Magdalena J, Quak J, Weerdmeester K, Kaashoek MJ, Maris-Veldhuis MA, Rijsewijk FAM, Keil G, van Oirschot JT (1994). J of Clin Microbiol 2175–2181. 3. Kramps JA, Perrin B, Edwards S, van Oirschot JT (1996). Vet Microbiol 53:153–161. Annexe B – Préparation et conservation des échantillons Sérum • Les échantillons de sérum peuvent être conservés à −20°C avant d'être testés. • Les sérums à titrer doivent être dilués de 2 en 2 dans du tampon ELISA. Lait • Les échantillons de lait dégraissé, qu'ils contiennent ou non un conservateur (par ex. l'azide de sodium), doivent être préparés par centrifugation 15 minutes à 1000 × g. Au lieu d'être centrifugés, ils peuvent être conservés au réfrigérateur pendant au moins 16 heures. Le prélèvement de lait sera effectué sous la couche de crème qui recouvre le lait, au moyen d'une pipette Pasteur. • Avant d'être testés, les échantillons de lait peuvent être conservés à −20°C une fois dégraissés. Il est également possible de les conserver à 5±3°C plusieurs jours après y avoir ajouté un conservateur (par ex. l'azide de sodium). Service clientèle et assistance technique Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment : • Numéros de téléphone partout dans le monde • Commande et Support web • Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles • Certificats d’analyse • Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques)) Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant. Garantie produit limitée Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support. Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Historique des révisions : Pub. Nº MAN0013868 (français) Rév. Date Description Nouveau document. Conversion effectuée du document existant (PrioCHECK BHV-1 gB 7610359 5 plates v1.0_f.doc) sur le modèle du A.0 8 Mars 2019 document en cours, avec mises à jour associées aux informations de licence limitée, à la garantie, aux marques et aux logos. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2019 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. ">
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