PrioCHECK® PPV Ab Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques du Parvovirus porcin dans le sérum de porcs Coffret de 2 plaques pour 176 échantillons © Prionics AG Notice d'utilisation Version 1.1_f Introduction Le parvovirus du porc (PPV) est un petit virus à ADN simple brin appartenant à la famille des Parvoviridae. C'est un agent infectieux ubiquitaire qui provoque chez le porc des troubles de la reproduction, entraînant des pertes économiques importantes dans l'industrie porcine à travers le monde. Le PPV est capable de traverser la barrière placentaire. Les conséquences d'une infection à PPV dépendent du statut immunitaire des truies en gestation infectées par le virus. Chez les truies non immunes, les infections à PPV survenant ème jour de gestation peuvent entraîner la avant le 35 mort de l'embryon. Après le 70ème jour environ, les fœtus sont immunocompétents et vont pouvoir élaborer une réponse immune en produisant des anticorps anti-PPV. Ils pourront ainsi survivre à l'infection et le porcelet qui naîtra sera sain et aura une sérologie positive en anticorps anti-PPV. ® Le test PrioCHECK PPV Ab détecte les anticorps spécifiques à partir du septième jour d'infection. Le taux d'anticorps atteint un plateau environ 10 jours après l'infection. Le statut infectieux d'un élevage peut être déterminé par titrage de 2 échantillons de sérum prélevés à plusieurs semaines d'intervalle. En fonction du résultat, la décision de vacciner les porcs pourra être prise afin de contrôler l'infection à PPV. Principe du test ® Le test PrioCHECK PPV Ab est réalisé en effectuant une seule dilution les échantillons de sérum étant dilués au 1/5 avant d'être testés. Les dilutions de sérum sont pré-incubées avec de l'antigène PPV. Pendant l'incubation, les anticorps spécifiques, s'ils sont présents, vont former des complexes immuns avec l'antigène. Après l'incubation, le mélange antigène-anticorps sériques est transféré dans une microplaque coatée avec un anticorps spécifique. Au cours d'une seconde incubation, l'antigène PPV non lié va se fixer sur la microplaque coatée avec l'anticorps spécifique, alors que l'antigène PPV complexé avec les anticorps présents dans l'échantillon de sérum (= antigène bloqué) ne se fixe pas sur la microplaque coatée. Après élimination des réactifs non fixés, le conjugué est distribué dans les puits et se lie avec l'antigène qui s'est fixé sur les plaques. Ces dernières sont incubées et lavées et le substrat chromogène (TMB) est ajouté. La coloration est stoppée au bout de 15 minutes d'incubation et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm. Composition du coffret Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à la date d’expirati on qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous). Les informations sur les risques chimiques sont données dans le paragraphe « Normes de Sécurité Risque et Sécurité » (Annexe II). Composant 1 Microplaque Deux plaques de barrettes sécables. Composant 2 Conjugué (30x) (concentré 30x, à diluer avant utilisation). Un flacon contenant 1,5 ml de conjugué. Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste avant utilisation. Composant 3 Tampon de dilution (5x) (concentré 5x, à diluer avant utilisation). Un flacon contenant 60 ml de tampon de dilution. Stabilité du tampon de dilution solution de travail: 5 heures à 22±3°C. Composant 4 Solution de lavage (200x) (concentré 200x, à diluer avant utilisation). Un flacon contenant 60 ml de solution de lavage. Stabilité de la solution de lavage: 1 semaine à 22±3°C. Composant 5 Eau déminéralisée Un flacon contenant 10 ml d'eau déminéralisée. Composant 6 Sérum de cheval (lyophilisé) Un flacon contenant 3,5 ml de sérum de cheval lyophilisé. Stabilité du sérum de cheval reconstitué: jusqu’à la date de péremption à -20°C. Composant 7 Antigène (lyophilisé) Deux flacons contenant 6,0 ml d'antigène lyophilisé. Stabilité de l’antigène reconstitué: en aliquotes jusqu’à la date de péremption à -20°C. Composant 8 Sérum de contrôle 1 (prêt à l'emploi) Un flacon contenant 1,0 ml de sérum de contrôle 1 (sérum de contrôle positif). Composant 9 Sérum de contrôle 2 (prêt à l'emploi) Un flacon contenant 1,0 ml de sérum de contrôle 2 (sérum de contrôle négatif). Composant 10 Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi) Un flacon contenant 60 ml de substrat chromogène (TMB). Composant 11 Solution d'arrêt (prête à l'emploi) Un flacon contenant 60 ml de solution d'arrêt. Autres composants du coffret: - Notice d'utilisation - 1 couvercle pour couvrir les barrettes pendant les périodes d'incubation - Certificat d'analyse Equipement nécessaire mais non fourni Equipement général: Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales. Plaques non sensibilisées Plaques non sensibilisées pour la dilution des sérums et pour l'étape de pré-incubation avec l'antigène. Nous conseillons l'utilisation de plaques à fond rond (Greiner, réf. 6501101). Mais d'autres plaques ou tubes (dont la paroi ne fixe pas les complexes immuns) peuvent être utilisés. Incubation: Incubateur de microplaque (chauffant au moins à 50°C). Analyse des résultats: Lecteur de microplaques: Multiscan EX ou équivalent. Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire les plaques à 450 nm. Equipement optionnel: Laveur de microplaques: Tecan EIA Tray Washer ou équivalent. Pour diagnostic in vitro uniquement Usage strictement vétérinaire Conserver à 5±3°C Produit No.: 7588981 Mode opératoire Précautions Les recommandations nationales pour la manipulation d'échantillons animaux doivent être suivies de façon ® stricte. Le test PrioCHECK PPV Ab ne doit être réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela. Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être considéré comme potentiellement contaminé. Les informations sur les risques chimiques sont données dans le paragraphe « Normes de Sécurité Risque et Sécurité » (Annexe II). Remarques Pour obtenir des résultats optimums avec Prio® CHECK PPV Ab, les précautions suivantes doivent être prises: Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi. Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22 ±3°C) avant utilisation. L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé. Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif. Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de péremption ou si un changement dans leur aspect est observé. Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests. Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau équivalente. SOLUTIONS A PREPARER A L'AVANCE Solution de lavage La solution de lavage (200x) (Composant 4) doit être diluée 1/200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité fournie permet de préparer un volume final de 12 litres. Stabilité de la solution de lavage diluée: 1 semaine à 22±3°C. Tampon de dilution solution de travail Diluer le tampon de dilution concentré (5x) (Composant 3) dans 1/5 de l'eau déminéralisée. Stabilité du tampon de dilution solution de travail: 5 heures à 22±3°C. Sérum de cheval 1 Reconstituer le sérum de cheval (Composant 6) dans de l'eau déminéralisée (Composant 5). Après reconstitution, stocker à -20°C jusqu’à la da te de péremption. Tampon du conjugué Pour 2 barrettes, ajouter à 1,9 ml de tampon de dilution solution de travail, 0,1 ml de sérum de cheval reconstitué [concentration finale de sérum de cheval = 5% (v/v)]. Le tampon de conjugué non utilise peut être stocké à 5±3°C pendant 24 heures. Dilution du Conjugué Diluer du conjugué (30x) (Composant 2) dans 1/30 le tampon du conjugué. Pour 2 barrettes: préparer 1.8 ml de conjugué dilué. Remarque: La dilution de travail du conjugué doit être préparée juste avant utilisation. PrioCHECK® PPV Ab Antigène 1 Reconstituer l'antigène (Composant 7) avec 6 ml le tampon de dilution solution de travail. Si le coffret n'est utilisé que partiellement, l'antigène reconstitué doit être aliquoté en volumes de 1,0 ml (pour un maximum de 6 séries de tests par plaque). Eviter les congélations-décongélations multiples et conserver l'antigène aliquoté à -20°C. Remarque: Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques peut être fait manuellement avec 200 – 300 µl de solution de lavage par puits. Vider ensuite les plaques et répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est pas nécessaire d'égoutter les plaques entre les cycles de lavage. Tapoter fermement les barrettes sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. PRE-INCUBATION DES ECHANTILLONS DE SERUM ET DE L'ANTIGENE 1.1 1.2 1.3 1.4 Mélanger 96 µl de tampon de dilution solution de travail avec 24 µl de sérum de contrôle 1 (Composant 8) et 120 µl d'antigène reconstitué. Mélanger 96 µl de tampon de dilution solution de travail avec 24 µl de sérum de contrôle 2 (Composant 9) et 120 µl d'antigène reconstitué. Mélanger 12 µl de chaque échantillon de sérum avec 48 µl de tampon de dilution solution de travail et 60 µl d'antigène reconstitué. Incuber 60±5 minutes à 37±1°C. INCUBATION DANS LA PLAQUE DE REACTION 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 Identifier chaque barrette (Composant 1) avec un marqueur fin. Déposer 100 µl de tampon de dilution solution de travail dans les puits A1 et B1. Déposer 50 µl de tampon de dilution solution de travail dans les puits C1 et D1. Ajouter 50 µl d'antigène reconstitué dans les puits C1 and D1 et mélanger. Déposer 100 µl du mélange sérum de contrôle 1 - antigène dans les puits E1 et F1. Déposer 100 µl du mélange sérum de contrôle 2 - antigène dans les puits G1 et H1. Déposer 100 µl de mélange échantillonantigène dans les autres puits. Couvrir la plaque avec un film adhésif et l'incuber 120±5 minutes à 37±1°C. INCUBATION AVEC LE CONJUGUE 3.1 3.2 3.3 Vider les barrettes et les laver 6 fois avec 200 – 300 µl la solution de lavage. Les tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. Distribuer 100 µl de conjugué dilué dans tous les puits. Couvrir la plaque de barrettes et l'incuber 60±5 minutes à 37±1°C. INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT CHROMOGENE (TMB) 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 Vider les barrettes après la période d'incubation et les laver 6 fois avec 200 – 300 µl la solution de lavage. Les tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. Distribuer 100 µl de substrat chromogène (TMB) (Composant 10) dans tous les puits. Incuber 15 minutes à 22±3°C. Distribuer 100 µl de solution d'arrêt (Composant 11) dans tous les puits. Homogénéiser le contenu des puits avant de lire la densité optique (DO). Remarque: Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes après avoir déposé de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits. Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits 1 - Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante : Ramener le flacon à 22±3°C. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon. Ouvrir le flacon. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée. Laisser le réactif lyophylisé se reconstituer. Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le lyophilisat soit entièrement dissout. Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la formation de mousse). en gardant le même ordre et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB). LECTURE DU TEST ET CALCUL DES RESULTATS 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la solution d'arrêt. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 et B1 (= DO450 blanc). Calculer la DO450 corrigée des sérums de contrôle 1 et 2 et des échantillons des sérums en soustrayant la DO450 blanc. Calculer la DO450 moyenne des puits C1 and D1 (= DO450 max). Le pourcentage d'inhibition (PI) est calculé selon la formule suivante: Remarque: La DO450 corrigée de chaque échantillon est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par rapport à la DO450 max corrigée PI = 100- DO450 corrigée de l'échantillon ----------------------------------------- x 100 DO450 max corrige INTERPRETATION DES RESULTATS Validation des critères 6.1 La DO450 blanc (puits A1 et B1) doit être < 0,300. 6.2 La DO450 max corrigée (puits C1 et D1) doit être > 1,000. 6.3 Le PI du sérum de contrôle 1 (sérum de contrôle positif) doit être > 50%. 6.4 Le PI du sérum de contrôle 2 (sérum de contrôle négatif) doit être < 50%. 6.5 Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont ininterprétables. Remarque: Si la DO450 max est inférieure à 1,000, de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les barrettes plus longtemps (sans dépasser 30 minutes d'incubation). Si la DO450 max corrigée est supérieure à 2,000, il est conseillé de diminuer le temps d'incubation avec de substrat chromogène (TMB). perte économique ou d'un dommage matériel subis par un client suite à l'utilisation de ses produits. Prionics AG et Prionics Lelystad BV sont des entreprises certifiées ISO 9001:2000. Annexe II Normes de Sécurité - Risque et Sécurité Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte. Composant 1 Microplaque Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 2 Conjugué (30x) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 3 Tampon de dilution (prêt à l'emploi) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 4 Solution de lavage (200x) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 5 Eau déminéralisée Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 6 Sérum de cheval (lyophilisé) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 7 Antigène (lyophilisé) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 8 Sérum de contrôle 1 (prêt à l'emploi) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 9 Sérum de contrôle 2 (prêt à l'emploi) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Interprétation du pourcentage d'inhibition PI ≥ 50% Positif Présence d'anticorps spécifiques du PPV dans le prélèvement. PP < 50% Négatif Absence d'anticorps spécifiques du PPV dans le prélèvement Annexe I Avertissement Les informations contenues dans cette notice sont considérées comme étant complètes et exactes au moment de leur publication. Prionics AG ne peut en aucun cas être tenu pour responsable des dommages fortuits ou indirects liés à l'utilisation de ce document ou en résultant. Responsabilité Prionics AG garantit que ses produits sont conformes aux caractéristiques décrites sous réserve qu'ils soient utilisés selon les instructions fournies et dans les délais de conservation indiqués. Prionics AG exclut toute autre garantie, explicite ou implicite, y compris la garantie d'aptitude à la vente ou de conformité pour une utilisation particulière. La garantie mentionnée ici, ainsi que les informations, spécifications et descriptions des produits commercialisés par Prionics AG figurant dans les catalogues Prionics AG ou dans tout autre document, ne peuvent pas être modifiées, sauf consentement écrit express de Prionics AG. Les présentations orales ou écrites, ou les publications non conformes à cette garantie ne sont pas autorisées et sont sujettes à caution. En cas de rupture de la garantie, l'obligation de Prionics AG se limite à la réparation ou à l'échange, à sa discrétion, du produit ou d'une partie du produit, sous réserve que le client informe rapidement Prionics AG de cette rupture de garantie. Au cas où la société Prionics AG ne pourrait pas réparer ou remplacer le produit ou une partie du produit, elle devra rembourser au client l'intégralité des sommes perçues pour ce produit ou pour partie de ce produit. Prionics AG ne peut être tenu pour responsable des dommages fortuits, particuliers ou indirects y compris ceux résultant d'une Composant 10 Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi) Code de risque: Ce produit n'est pas classé selon les normes de l'Union Européenne. Composant 11 Solution d'arrêt (prêt à l'emploi) Code de risque: R35: Provoque de graves brûlures. S26: En cas de contact avec les yeux, rincer immédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter rapidement un médecin. S36/37/39: Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux/du visage. S45: En cas d'accident ou de malaise, consulter rapidement un médecin (lui montrer l'étiquette du produit si possible). Annexe III Références bibliographiques (1) F. Westenbrink, M.A. Veldhuis and J.M.A. Brinkhof Journal of Virological Methods, 23 (1989) 169, 178. Contacts Prionics Lelystad B.V. Platinastraat 33 P.O. Box 2271 NL-8203 AG, Lelystad The Netherlands Tel. +31 320 714000 Fax +31 320 714029 Prionics AG Wagistrasse 27a CH-8952 Schlieren-Zurich Switzerland Tel. +41 44 200 2000 Fax +41 44 200 2010 www.prionics.com [email protected] Pour obtenir des informations sur notre réseau de distribution, consulter le site www.prionics.com ">
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