NOTICE D’UTILISATION PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques de la Peste Porcine Classique dans le sérum et le plasma des porcs Référence Catalogue 7610046 Pub. Nº MAN0013828 Rév. A.0 AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Introduction La peste porcine classique (PPC), encore appelée choléra du porc ou peste porcine, est transmise par un virus du genre Pestivirus - auquel appartiennent aussi le virus de la diarrhée virale bovine (BVD) et le virus du border disease - dans la famille des Flaviviridae. La PPC est une maladie virale contagieuse qui touche les porcs et dont la déclaration est obligatoire (liste A de l'OIE). Les épidémies de CSF provoquent des pertes économiques sévères dans les pays producteurs de porcs. Le dépistage rapide des porcs infectés est essentiel pour éviter la propagation du virus et contrôler la maladie. Applied Biosystems™ PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit détecte précocement les anticorps dirigés contre les souches de VPPC .de haute, moyenne ou faible virulence. La détection des anticorps dirigés contre les souches de VPPC de faible virulence a une importance primordiale pour dépister les infections subcliniques à VPPC. PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit allie un mode opératoire pratique et simple avec une sensibilité et une spécificité élevées. Le coffret est conçu pour permettre une adaptation facile sur les automates ELISA. PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit est adapté au dépistage à grande échelle. Principe du test Le réactif clé utilisé dans le test PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit est un anticorps monoclonal dirigé contre différents épitopes de la protéine d'enveloppe E2 (GP-55) du VPPC. Le nom de protéine E1 attribué à la protéine d'enveloppe. (GP-55) du CSFV a été changé en protéine E2 par le Comité International de Taxonomie des Virus (Australie, Septembre, 1995). Les sérums à tester, le conjugué et l'antigène sont distribués dans les puits d'une microplaque et incubés à T°ambiante (22±3°C). Après lavage de la plaque, la solution de substrat chromogène (TMB) prête à l'emploi est distribuée dans tous les puits et la plaque est incubée à 22±3°C. A la fin de la période d'incubation, le développement de la coloration est stoppé et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm afin de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifiques de la peste porcine classique. Composition du coffret Coffret de 5 plaques pour 440 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C jusqu’à la date d’expiration qui figure sur l’étiquette du coffret. La durée de conservation des produits du coffret, une fois qu'ils sont dilués, ouverts ou reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous). Composant 1 : Plaque de microtitration 2 : Conjugué (30x) Description Cinq plaques de microtitration conditionnées sous vide partiel dans des sachets contenant un déshydratant. Concentré 30x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 1.5 mL de conjugué. Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste avant utilisation. 3 : Tampon de dilution Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de tampon de dilution. 4 : Antigène Lyophilisé. Reconstituer et diluer avant utilisation. Un flacon contenant 1.5 mL d'antigène lyophilisé. Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste avant utilisation. 5 : Eau déminéralisée Un flacon contenant 10 mL d'eau déminéralisée. 6 : Solution de lavage (200x) Concentré 200x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 60 mL de solution de lavage. Conservation de la solution de lavage : 1 semaine à 22±3°C. 7 : Sérum de contrôle 1 Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.5 mL sérum de contrôle 1 (contrôle positif). 8 : Sérum de contrôle 2 Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.5 mL de sérum de contrôle 2 (contrôle positif faible). 9 : Sérum de contrôle 3 Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.5 mL de sérum de contrôle 3 (contrôle négatif). 10 : Sérum de contrôle 4 Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.5 mL de sérum de contrôle 4 (contrôle négatif). 11 : Substrat chromogène (TMB) Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de substrat chromogène (TMB). 12 : Solution d'arrêt Prête à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de solution d'arrêt pour stopper le développement de la coloration. Autres composants du coffret • Notice d'utilisation • 5 films adhésifs pour couvrir les plaques Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. Equipement nécessaire mais non fourni Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. Use Description Général Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales. Analyse des résultats Lecteur de microplaques. Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire les plaques à 450 nm. Optionnel Laveur de microplaques. Mode opératoire Précautions • Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte. • Le test PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit ne doit être réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela. • Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être considéré comme potentiellement contaminé. Remarques Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit, les précautions suivantes doivent être prises : • Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi. • Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C) avant utilisation. • L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé. • Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif. • Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de péremption ou si un changement dans leur aspect est observé. • Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests. • Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau équivalente. Solutions à préparer à l'avance Dilution de conjugué Préparer la dilution de travail du conjugué (30x) (Composant2) en diluant le conjugué au 1:30 dans le tampon de dilution (Composant 3). Pour une plaque : préparer 6 mL (ajouter 0.2 mL de conjugué (30x) à 5.8 mL de tampon de dilution). Remarque : La dilution de travail du conjugué doit être préparée juste avant utilisation. Antigène Interprétation des résultats Reconstituer l'antigène lyophilisé (Composant 4) avec 1.5 mL de l'eau déminéralisée (Composant 5). Aliquoter l'antigène reconstitué (12 × pour un maximum de 12 séries de tests). Eviter les congélations-décongélations multiples et conserver l'antigène aliquoté dans de petits tubes à −20°C jusqu’à la date d’expiration. Préparer la solution de travail de l'antigène en diluant au 1:30 l'antigène reconstitué dans le tampon de dilution (Composant 3). Pour une plaque : préparer 6 mL (ajouter 0.2 mL d'antigène concentré à 5.8 mL de tampon de dilution). Conserver jusqu’à 30 minutes à 22±3°C. Validation des critères Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante : 1. Ramener les flacons à 22±3°C. 2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon. 3. Ouvrir le flacon. 4. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée (Composant 5). 5. Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le lyophilisat soit entièrement dissout. 6. Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C. 7. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la formation de mousse). Solution de lavage La solution de lavage (200x) (Composant 6) doit être dilué 1:200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité fournie est suffisante pour préparer un volume final de 12 litres. La solution de lavage peut être conserve 1 semaine à 22±3°C. Remarque : Un lavage insuffisant des plaques peut être à l'origine d'un bruit de fond élevé. L'utilisation d'un laveur automatique est préférable (mais ce n'est pas indispensable) à l'utilisation de pipettes multicanaux ou à l'immersion des plaques dans de la solution de lavage dilué. Quelle que soit la méthode utilisée, il n'est pas nécessaire d'égoutter les plaques sur du papier absorbant entre les lavages. Un volume minimum de 200 µL par puits est nécessaire pour un lavage efficace des plaques. Incubation du sérum, du conjugue et de l'antigène 1. Déposer 50 µL de sérum de contrôle 1 (Composant 7) dans les puits A1 et B1. 2. Déposer 50 µL de sérum de contrôle 2 (Composant 8) dans les puits C1 et D1. 3. Déposer 50 µL de sérum de contrôle 3 (Composant 9) dans les puits E1 et F1. 4. Déposer 50 µL de sérum de contrôle 4 (Composant 10) dans les puits G1 et H1. 5. Déposer 50 µL de chaque échantillon dans un seul puits (test en simple) ou dans deux puits adjacents (test en double) de la plaque. 6. Distribuer 50 µL de solution de travail du conjugué dans tous les puits. 7. Distribuer 50 µL de solution de travail de l'antigène dans tous les puits. 8. Couvrir les plaques avec le film adhésif. 9. Les agiter doucement. 10. Incuber les plaques 90±5 minutes à 22±3°C. Incubation avec le substrat chromogène (TMB) 1. Vider les plaques et laver 6 fois avec 200 à 300 µL le liquide de lavage dilué. Les tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. 2. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) (Composant 11) dans tous les puits. 3. Incuber les plaques 20 minutes à 22±3°C. 4. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 12) dans tous les puits. 5. Homogénéiser le contenu des plaques. Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15–20 minutes après avoir déposé la solution de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits. Déposer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB). Lecture du test et calcul des résultats 1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la solution d'arrêt. 2. Calculer la DO450 moyenne du sérum de contrôle 1 (puits A1 et B1 = DO450 blanc). 3. Calculer la DO450 corrigée des sérums de contrôle 2, 3 et 4 et des échantillons en soustrayant la DO450 blanc. 4. Calculer le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums de contrôle 2 et 3 et des échantillons selon la formule ci-dessous. La DO450 corrigée des échantillons est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par rapport à la DO450 corrigée du sérum de contrôle 4. PI = 100 − (DO450 corrigée échantillon / DO450 corrigée sérum de contrôle 4) × 100 thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 18 Mars 2019 1. La DO450 moyenne du sérum de contrôle 1 (puits A1 et B1 = blanc) doit être <0.250. 2. La DO450 moyenne corrigée du sérum de contrôle 4 doit être >1.000. 3. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle 2 doit être >50%. 4. Le pourcentage d'inhibition du sérum de contrôle 3 doit être <50%. Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont ininterprétables. Remarque : Si la DO450 d'un échantillon est supérieure à la DO450 du sérum de contrôle 4, le pourcentage d'inhibition peut être interprété comme étant égal à 0%. Si la DO450 corrigée du sérum de contrôle 4 est inférieure à 1.000, la solution de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les plaques plus longtemps (sans dépasser 30 minutes d'incubation). Interprétation du pourcentage d'inhibition PI = ≤30% Négatif PI = 31%–50% Douteux PI = ≥50% Positif Absence d'anticorps spécifiques du VPPC dans le prélèvement. L'échantillon doit être testé à nouveau avec PrioCHECK™ CSFV Ab Plate Kit. Si le PI est toujours compris entre 31% et 50%, effectuer un test de neutralisation. Présence d'anticorps spécifiques du VPPC dans le prélèvement. Nous recommandons de tester à nouveau les sérums dont les résultats sont douteux ou positifs. Les résultats douteux ou positifs doivent être confirmés par un test de neutralisation afin de contrôler la spécificité des anticorps anti-VPPC. Références bibliographiques 1. 2. 3. 4. 5. Holm Jensen M (1981). Acta Vet Scand 22:85–98. Wensvoort G, Bloemraad M, Terpstra C (1988). Vet Microb 17:129–140. Wensvoort GJ (1989). Gen Virol 70:2865–2876. Wensvoort G, Boonstra J, Bodzinga BG (1990). J Gen Virol 71:531–540. Colijn E, Bloemraad M, Wensvoort G (1997). Vet Microbiol 59:15–25. Service clientèle et assistance technique Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment : • Numéros de téléphone partout dans le monde • Commande et Support web • Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles • Certificats d’analyse • Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques)) Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant. Garantie produit limitée Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support. Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Historique des révisions : Pub. Nº MAN0013828 (français) Rév. Date Description Nouveau document. Conversion effectuée du document existant (PrioCHECK CSFV Ab 7610046_v1.0_f.doc) sur le modèle du A.0 18 Mars 2019 document en cours, avec mises à jour associées aux informations de licence limitée, à la garantie, aux marques et aux logos. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. 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