GUIDE COMPLÉMENTAIRE VetMAX™ Ruminant Respiratory Screening Kit Protocoles de purification d’acides nucléiques optimisés pour une utilisation avec le kit (Réf. SRPR) Pub. nº MAN0008880 Rév. C.0 Espèces Matrices d’échantillons Type de test • Écouvillons nasaux et trachéaux Bovins • Liquide trachéal et liquide bronchoalvéolaire Individuel • Organes (poumons) AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Suivre toutes les réglementations du travail avec des échantillons biologiques locales, nationales et/ou communautaires en vigueur. ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ Objectif de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Choix de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Conservation des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Purification de l’acide nucléique avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatique) . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Préparation des échantillons en vue de leur purification avec d’autres kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Purification de l’acide nucléique avec MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatique) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Purification de l’ARN avec RNeasy™ Mini Kit (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Purification de l’ARN avec le kit NucleoSpin™ RNA (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ■ ■ Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Procédure de purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Annexe B Documentation et support ■ ■ Assistance à la clientèle et support technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Garantie limitée du produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Objectif de ce guide Ce guide décrit les protocoles de purification d’acides nucléiques pour les sept principaux pathogènes responsables des maladies respiratoires chez les bovins : Mycoplasma bovis, Histophilus somni, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, le coronavirus bovin, le virus respiratoire syncytial bovin et le virus para-influenza bovin de type 3. Les méthodes ont été validées et optimisées pour une ™ ™ utilisation en aval avec Applied Biosystems VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit (Réf. SRPR). ™ ™ • La purification automatisée des acides nucléiques est réalisée à l’aide de l’un des instruments suivants : KingFisher Flex, MagMAX ™ ™ Express-96, KingFisher mL ou KingFisher Duo Prime. • La purification manuelle des acides nucléiques utilise des colonnes de centrifugation à base de silice. Pour usage en laboratoire. Choix de l’échantillon Type d’échantillon Type d’analyse Quantité requise et équipement de prélèvement Écouvillon nasal et trachéal Individuel Écouvillon dans un tube sec Liquide trachéal et liquide bronchoalvéolaire Individuel Volume minimal : 5 ml d’aspiration transtrachéale (ATT) ou de liquide de lavage bronchoalvéolaire Organe (poumon) Individuel 20 à 30 mg de tissu Conservation des échantillons Type d’échantillon Conservation Écouvillons nasaux et trachéaux Après le prélèvement, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 48 heures maximum). Liquide trachéal et liquide bronchoalvéolaire Après le prélèvement, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 48 heures maximum). Organes (poumons) Après l’élution de l’écouvillon, utiliser directement l’éluat pour réaliser la PCR. Après utilisation ou à expiration du délai de 48 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Après utilisation ou à expiration du délai de 48 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Après le prélèvement, conserver selon le cas de figure : • conserver les échantillons entre 2°C et 8°C si l’analyse est effectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement ; • conserver les échantillons en dessous de -16°C si l’analyse est effectuée au-delà des 24 heures suivant le prélèvement. Après utilisation ou à expiration du délai de 24 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Matériels requis non fournis Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre grand fournisseur de laboratoire. Matériel nécessaire pour la collecte d’échantillon, la préparation, et la purification des acides nucléiques Tableau 1 Matériel requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons Article Source Équipement Poste de Sécurité Microbiologique de type II (PSMII) PFL Centrifugeuse de paillasse PFL Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL Micropipettes de précision ajustables (de 1 µl à 1 000 µl) PFL Consommables Embouts de pipette résistant aux aérosols, sans nucléase PFL Microtubes DNase/RNase-free de 1,5 ml et 2,0 ml PFL Réactifs Eau sans nucléase AM12450 PBS (1X), pH 7.4 2 PFL ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit Tableau 2 Matériels supplémentaires nécessaires pour la purification des échantillons d’organes Article Source Équipement Broyeur de tissus pour l’agitation avec billes, parmi les modèles suivants ou équivalent[1] : • Fisher Scientific™ Bead Mill 24 Homogenizer • Fisher Scientific 15-340-163 • Broyeur Precellys™ 24 (Bertin) • Bertin EQ03119.200.RD000.0 • Instrument FastPrep‑24 (MP Biomedical 116004500) • Fisher Scientific MP116004500 • Mixer Mill 400 (Verder 207450001) • Fisher Scientific 08 418 241 ™ Balance de précision PFL PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm), ou billes en verre de 3 mm équivalentes Fisher Scientific™ 11-312-10A Scalpels et pinces métalliques (stériles) PFL Consommables Boîte de Petri (stérile) [1] PFL Aucun broyeur de tissus n’est requis pour la purification avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit. Matériels supplémentaires nécessaires pour la purification automatisée des acides nucléiques Tableau 3 Matériel nécessaire pour la procédure MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit Article Source Instrument, l’un des suivants : KingFisher™ Flex Purification System MagMAX Express‑96 Magnetic Particle Processor ™ Contacter le représentant commercial local. KingFisher™ Duo Prime Purification System 5400110 KingFisher™ mL Purification System 5400050 Équipement Bloc chauffant à 55°C PFL Réservoir de réactifs PFL Consommables Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 : • KingFisher™ Deepwell 96 Plate • 95040450 • KingFisher 96 KF microplates • 97002540 • KingFisher™ 96 tip comb for DW magnets • 97002534 ™ Consommables pour les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Adhesive PCR Plate Foils, ou équivalent Voir Tableau 9 en page 15. AB0626 Kits et réactifs MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit A32700 ou A32702 PBS, pH 7.4 (10 fois), exempt de RNase AM9624 Tableau 4 Matériel nécessaire pour la procédure MagVet™ Universal Isolation Kit Article Source Instrument, l’un des suivants : KingFisher™ Flex Purification System MagMAX Express‑96 Magnetic Particle Processor ™ KingFisher™ mL Purification System ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit Contacter le représentant commercial local. 5400050 3 Article Source Équipement Bloc chauffant à 70℃ PFL Réservoir de réactifs PFL Kits et réactifs MagVet™ Universal Isolation Kit MV384 • Qiagen 19131 Protéinase K (PK) • Macherey Nagel 740396 Éthanol à 80 % PFL Matériels supplémentaires nécessaires pour la purification manuelle des acides nucléiques Article L’un des kits suivants : • RNeasy™ Mini Kit • Kit NucleoSpin™ RNA Source • Qiagen 74104 • Macherey Nagel 740955 Éthanol à 70 % PFL Éthanol à 96-100 % PFL 4 ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit Purification de l’acide nucléique avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatique) Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Flex ™ • MagMAX Express-96 Suivre l’Annexe A, “Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Duo Prime ™ • KingFisher mL Méthode Méthode avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit Préparation des plaques pour le traitement Préparation de l’échantillon Préparation de la Lysis/PK Solution Traitement des échantillons avec la Lysis/PK Solution Mélange des échantillons avec la solution de binding et les billes Placement des échantillons dans l’instrument Instructions • Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger. • Pour éviter toute contamination croisée : – Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement. – Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures. • Pour éviter toute contamination par les nucléases : – Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent l’acide nucléique des nucléases présentes sur la peau. – Utiliser des embouts de pipettes exempts d’acide nucléique pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés dans les récipients de réactifs. – Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer. Avant la première utilisation du kit (Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes ™ Nous recommandons l’utilisation de Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer pour un rendement maximal en acides nucléiques. Si un autre instrument est utilisé, suivre les directives du fournisseur pour déterminer les paramètres de vitesse et de temps pour obtenir une lyse de cellules suffisante. ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 5 Téléchargement et installation du script ™ Le script adéquat pour MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation. ™ 1. Sur la page internet du produit MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit (à l’adresse thermofisher.com, effectuer une recherche à partir de la référence), faire défiler jusqu’à la section Documentation du produit. 2. Faire un clic droit sur le fichier approprié pour télécharger la version la plus récente du script MagMAX_CORE pour votre instrument. Tableau 5 Scripts recommandés Instrument Nom du script KingFisher Flex MagMAX_CORE_Flex.bdz KingFisher™ 96 MagMAX_CORE_KF-96.bdz ™ MagMAX™ Express-96 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz KingFisher mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz ™ Si requis par votre laboratoire, utiliser l’un des scripts suivants, qui ne chauffent pas les échantillons lors de l’étape d’élution. Tableau 6 Scripts alternatifs sans étape d’élution chauffée Instrument Nom du script KingFisher Flex MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz KingFisher™ 96 MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz ™ MagMAX™ Express-96 KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz KingFisher mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz ™ 3. Se référer au guide de l’utilisateur de l’instrument ou contacter l’assistance technique pour connaître les instructions d’installation du script. Réalisation de la procédure de purification 1 Préparation des plaques pour le traitement a. Préparation des plaques pour le traitement. Tableau 7 Configuration de la plaque : Instrument KingFisher™ Flex ou MagMAX™ Express-96 ID de la plaque Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard [1] Placer un peigne protecteur dans la plaque. Position sur l’instrument. b. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 6 ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 2 Préparer les échantillons comme décrit. Préparation de l’échantillon Type d’échantillon Écouvillon nasal ou trachéal Action 1. Casser la pointe de l’écouvillon et l’ajouter à un tube de 2 ml. 2. Ajouter 1 ml de PBS (1X), pH 7.4 à chaque échantillon. 3. Vortexer pendant 3 minutes. 4. Procéder avec 200 µl de surnageant. ATT ou liquide de lavage bronchoalvéolaire Procéder avec 200 µl de liquide. Organe (poumon)[1] Méthode de broyage : Préparer les échantillons d’organes à l’aide d’un broyeur de tissus. 1. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7.4 : 1 ml • PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes 2. Broyer (agiter avec les billes) les échantillons. • Fisher Scientific™ Bead Mill 24 Homogenizer : 6 m/s pendant 45 secondes • Mixer Mill 400 : 30 Hz pendant 5 minutes 3. Centrifuger 1 minute à 1 000 x g. 4. Procéder avec 200 µl de surnageant. Méthodes d’échantillon non broyé avec des billes : Préparer les échantillons d’organes à l’aide d’un agitateur vortex. 1. Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide de pinces et d’un scalpel stériles. 2. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu (haché finement) : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7.4 : 500 μl • PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes 3. Vortexer vigoureusement. 4. Centrifuger 1 minute à 1 000 x g. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. [1] 3 Sélectionner la méthode de préparation convenant à votre laboratoire. Préparation de la Lysis/PK Calculer le nombre d’échantillons. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis Solution d'échantillons plus 10 % d'excédent. a. Pour chaque échantillon, mélanger les composants suivants comme indiqué. IMPORTANT ! Ajouter les composants dans l’ordre indiqué au moment de l’utilisation ; ne pas les mélanger à l’avance. ™ 1. Mélanger MagMAX CORE Lysis Solution avec le PBS (1X), pH 7.4. Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 200 μl PBS (1X), pH 7.4 200 μl Total de Lysis Solution diluée 400 μl 2. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 7 3 ™ 3. Ajouter MagMAX CORE Proteinase K à la Lysis Solution diluée. Préparation de la Lysis/PK Solution (suite) Remarque : Le PK Buffer n’est pas requis pour ce protocole. Composant Volume par échantillon Lysis Solution diluée 400 μl MagMAX CORE Proteinase K 10 μl ™ Volume total de la Lysis/PK Solution 410 μl b. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. 4 Traitement des échantillons avec la Lysis/PK Solution Suivre cette procédure dans des tubes individuels pour éviter la contamination. Ne pas utiliser de plaques. a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué. Volume par échantillon Volume par échantillon témoin purifié 200 μl — PBS (1X), pH 7.4 — 200 μl Lysis/PK Solution 410 μl 410 μl Composant Échantillon préparé b. Vortexer brièvement pour mélanger l’échantillon avec la Lysis/PK Solution. c. Incuber l’échantillon selon le type d’échantillon. Pour... Faire... • Surnageant d’écouvillon nasal ou trachéal Incuber 30 minutes à 55°C. • ATT ou liquide broncho-alvéolaire Surnageant d’organe Incuber entre 30 minutes et 2 heures à 55°C. d. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube. 5 ™ Mélange des échantillons a. Vortexer vigoureusement MagMAX CORE Magnetic Beads pour s’assurer que les billes sont complètement resuspendues. avec la solution de binding et les billes b. Mélanger les réactifs suivants dans l’ordre indiqué. Tableau 8 Volumes finaux de la plaque d’échantillon : Instrument KingFisher™ Flex ou MagMAX™ Express-96 ID de la plaque Position de la plaque[1] Plaque d’échantillon [1] Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon après lyse Jusqu’à 610 μl MagMAX CORE Binding Solution 400 μl MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 μl ™ 1 Deep well Position sur l’instrument. c. Procéder immédiatement au placement des échantillons dans l’instrument (section suivante). 8 ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 6 a. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). Placement des échantillons dans l’instrument b. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver l’acide nucléique purifié sur glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois maximum, ou à -80°C pour une conservation à long terme. Préparation des échantillons en vue de leur purification avec d’autres kits Préparer les échantillons comme décrit. Type d’échantillon Action 1. Ajouter 1 ml de PBS (1X), pH 7.4 dans un tube de 2 ml, puis éluer l’écouvillon dans le PBS pendant 5 à 10 secondes. Écouvillon nasal ou trachéal 2. Presser l’écouvillon contre la paroi du tube pour en faire sortir le liquide, puis jeter l’écouvillon. 3. Centrifuger à 1 500 × g pendant 10 minutes. 4. Retirer soigneusement le surnageant, en laissant environ 100 µl de surnageant dans le tube pour éviter l’aspiration du culot cellulaire. 5. Mélanger doucement par aspiration-refoulement pour remettre le culot cellulaire en suspension. 6. Procéder avec 100 µl de la suspension cellulaire. ATT ou liquide de lavage bronchoalvéolaire 1. Transférer un volume minimal de 5 ml par échantillon dans un tube conique, puis centrifuger à 1 500 × g pendant 10 minutes. 2. Retirer soigneusement le surnageant, en laissant environ 100 µl de surnageant dans le tube pour éviter l’aspiration du culot cellulaire. 3. Mélanger doucement par aspiration-refoulement pour remettre le culot cellulaire en suspension. 4. Procéder avec 100 µl de la suspension cellulaire. 1. Hacher finement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide de pinces et d’un scalpel stériles. Organe (poumon) 2. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml : • Tissu : 20 à 30 mg • PBS (1X), pH 7.4 : 1 ml • Microbilles en verre (3 mm de diamètre) : 1 à 3 billes 3. Bien vortexer pour mélanger. 4. Broyer (agiter avec les billes) les échantillons. • Broyeur Precellys™ 24—6 000 tr/min pendant 40 secondes • Instrument FastPrep‑24™ : 6 m/s pendant 45 secondes • Mixer Mill 400 : 30 Hz pendant 5 minutes 5. Centrifuger à 1 500 × g pendant 2 minutes. 6. Procéder avec 200 µl de surnageant. ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 9 Purification de l’acide nucléique avec MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatique) ™ ™ ™ Le protocole suivant peut être utilisé avec les instruments KingFisher Flex, KingFisher mL et MagMAX Express-96. Avant la première utilisation du kit Remarque : La PK doit être commandée séparément du kit. • Préparation du tampon NM1 Buffer : ajouter 100 ml de tampon N1 Buffer dans la bouteille contenant le tampon M1 Buffer (25 ml), puis vortexer pour bien mélanger. Conserver le tampon NM1 Buffer à température ambiante jusqu’à 1 an. • Reconstitution de la PK : suivre les recommandations du fournisseur. Avant chaque utilisation du kit Préparer le mélange NM2+Beads. Mélanger les composants suivants pour le nombre d’échantillons requis, plus 5 à 10 % d’excédent, puis vortexer afin de bien mélanger. Composant Volume par échantillon NM2 Binding Solution 600 µl NM_LSI_Beads 20 µl Éliminer le mélange NM2+Beads après utilisation. Réalisation de la procédure de purification 1 Traitement du lysat avec la a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis homogénéiser l’échantillon. PK Composant Échantillon préparé Volume par échantillon testé • 100 µl de suspension cellulaire — • 200 µl de surnageant d’organe PBS (1X), pH 7.4 Protéinase K Volume par échantillon témoin purifié — 200 µl • Qiagen : 20 µl • Qiagen : 20 µl • Macherey Nagel : 25 µl • Macherey Nagel : 25 µl Tampon NM1 Buffer 180 µl 180 µl b. Incuber à 70°C pendant 30 minutes. 2 Préparation des plaques Préparer les plaques ou barrettes de traitement à l’extérieur de l’instrument comme décrit dans le ou barrettes de traitement tableau suivant. [1] [2] 10 Position[1] Type de plaque[2] Réactif Volume par puits 2 Deep well Tampon NM3 Buffer 600 µl 3 Deep well Tampon NM4 Buffer 600 µl 4 Deep well Éthanol à 80 % 600 µl 5 Standard Tampon NM6 Buffer 100 µl 6 Deep well Placer un peigne protecteur dans la plaque ou la barrette. Position sur l’instrument. Non applicable en cas d’utilisation de barrettes de tubes. ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 3 a. Une fois l’incubation à 70°C terminée, centrifuger les échantillons brièvement pour faire diminuer la condensation. Placement des échantillons dans l’instrument b. Transférer la totalité de l’échantillon dans les cupules appropriées en position 1 de la barrette ou de la plaque 1, selon l’instrument utilisé. c. Vortexer vigoureusement le mélange NM2+Beads pour s’assurer que les billes sont complètement resuspendues. d. Ajouter 620 µl de mélange NM2+Beads pour chaque échantillon et contrôle. e. Sélectionner le script approprié sur l’instrument. ™ • KingFisher mL : NM_LSI_15prep • KingFisher Flex/MagMAX Express-96 : NM_LSI_RRC96 ™ ™ f. Démarrer le test, puis charger les plaques ou barrettes de traitement préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. g. Charger la plaque ou barrette qui contient les échantillons et les contrôles en position 1 lorsque l’instrument le demande. h. À la fin du test, lorsque l’instrument le demande, retirer la plaque ou les tubes contenant l’acide nucléique purifié. Instrument ™ KingFisher mL Procédure Enlever la barrette du portoir et transférer l’acide nucléique purifié en position 5 dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse. ™ • KingFisher Flex Enlever la plaque en position 5 puis couvrir d’un film adhésif. ™ • MagMAX Express-96 Conserver les acides nucléiques purifiés entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ARN avec RNeasy™ Mini Kit (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit Remarque : Le tampon RLT Buffer est utilisable tel quel, sans ajout de β-mercaptoéthanol. • Reconstitution du tampon RPE Buffer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 Lyse et homogénéisation des échantillons a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Composant Échantillon préparé Volume par échantillon testé • 100 µl de suspension cellulaire • 200 µl de surnageant d’organe RLT Buffer 600 µl Volume par échantillon témoin purifié — 600 µl b. Vortexer pendant 15 secondes. c. Ajouter 600 µl d’éthanol à 70 % à chaque échantillon, puis mélanger 4 à 5 fois par aspirationrefoulement. Ne pas centrifuger. ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 11 2 Liaison de l’ARN à la colonne ™ a. Insérer une colonne RNeasy Mini Kit dans un tube collecteur, puis transférer 700 µl de l’échantillon dans la colonne. b. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 10 000 × g pendant 15 secondes. c. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. d. Transférer le reste du volume de l’échantillon dans la colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 10 000 × g pendant 15 secondes. e. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3 Lavage et élution de l’ARN a. Ajouter 700 μl de tampon RW1 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 10 000 × g pendant 15 secondes. b. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. c. Ajouter 700 μl de tampon RPE Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 10 000 × g pendant 15 secondes. d. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. e. Ajouter 500 μl de tampon RPE Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 10 000 × g pendant 2 minutes. f. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. g. Centrifuger à 13 000 × g pendant 1 minute pour sécher la membrane. h. Jeter le tube collecteur. i. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 100 µl d’eau sans nucléase. j. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. k. Centrifuger à 8 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ARN purifié se trouve dans le microtube. Conserver l’ARN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ARN avec le kit NucleoSpin™ RNA (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit Remarque : Le tampon RA1 Buffer est utilisable tel quel, sans ajout de β-mercaptoéthanol. • Reconstitution du tampon RA3 Buffer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 Lyse et homogénéisation des échantillons a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Composant Échantillon préparé Tampon RA1 Buffer 12 Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin purifié • 100 µl de suspension cellulaire — • 200 µl de surnageant d’organe 350 µl 350 µl ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 1 2 Lyse et homogénéisation des échantillons (suite) b. Vortexer pendant 15 secondes. Liaison de l’ARN à la colonne a. Insérer une colonne de kit NucleoSpin RNA dans un tube collecteur, puis transférer 700 µl de l’échantillon dans la colonne. c. Ajouter 350 µl d’éthanol à 70 % à chaque échantillon, puis mélanger 4 à 5 fois par aspirationrefoulement. Ne pas centrifuger. ™ b. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 8 000 × g pendant 30 secondes. c. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. d. Transférer le reste du volume de l’échantillon dans la colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 8 000 × g pendant 30 secondes. e. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 3 Lavage et élution de l’ARN a. Ajouter 200 μl de tampon RAW2 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 8 000 × g pendant 30 secondes. b. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. c. Ajouter 600 μl de tampon RA3 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 8 000 × g pendant 30 secondes. d. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. e. Ajouter 250 μl de tampon RA3 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 8 000 × g pendant 2 minutes. f. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. g. Centrifuger à 10 000 × g pendant 2 minutes pour sécher la membrane. h. Jeter le tube collecteur. i. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 100 µl d’eau sans nucléase. j. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. k. Centrifuger à 8 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ARN purifié se trouve dans le microtube. Conserver l’ARN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des consommables dédiés pour les types suivants : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 13 • Utiliser une pipette à piston ou des pointes de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. 14 ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ™ ™ Suivre cette procédure pour la purification avec MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit à l’aide de l’instrument KingFisher Duo ™ Prime ou KingFisher mL. Matériels requis non fournis Tableau 9 Matériels requis pour le traitement avec les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Article Source[1] Consommables pour l’instrument KingFisher™ Duo Prime KingFisher™ Duo Pack Combi pour plaque Microtiter 96 Deepwell (peignes, plaques et barrettes d’élution pour 96 échantillons) 97003530 KingFisher™ Duo Elution Strip (pack de 40)[2] 97003520 KingFisher™ Duo Peigne à 12 pointes pour plaque Microtiter 96 Deepwell (pack de 50)[2] 97003500 KingFisher™ Flex Microtiter Deepwell 96 plates[2] 95040460 Consommables pour l’instrument KingFisher mL ™ KingFisher™ mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141 KingFisher mL Peigne (800 unités) 97002111 KingFisher™ mL Tube (20 x 45 unités) 97002121 ™ [1] [2] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre grand fournisseur de laboratoire. Inclus dans le pack KingFisher™ Duo Combi (Réf. 97003530). ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit 15 Procédure de purification ™ Remarque : Quand le protocole de traitement est réalisé à l’aide d’un instrument KingFisher mL, mélanger les échantillons par aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument. 1. Suivre le protocole, de la préparation du lysat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution de lyse. Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons. ™ ™ 2. Ajouter les MagMAX CORE Wash Solutions et MagMAX CORE Elution Buffer aux emplacements indiqués, selon votre instrument. Charger le peigne et toutes les plaques ou les barrettes de tubes au même moment. L’instrument ne vous invite pas à charger les éléments individuellement. Tableau 10 Configuration de la plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon A Deep well Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution[1] Barrette de tubes séparée[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne H Deep well [1] [2] Placer un peigne protecteur dans la plaque. S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution. Placée sur l’élément chauffant. Tableau 11 Configuration de la barrette de tubes : Instrument KingFisher™ mL ID de la position Position de la barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits Échantillon 1 Standard Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 3 MagMAX CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne S/O ™ S/O Glisser le peigne dans le support pour peigne. 3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). 4. Démarrer le test, puis charger les plaques ou barrettes de tubes préparées sur leur position lorsque l’instrument le demande. Conserver l’acide nucléique purifié sur glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois maximum, ou à -80°C pour une conservation à long terme. Annexe B Documentation et support Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse 16 ™ Guide complémentaire de VetMAX Ruminant Respiratory Screening Kit – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288 Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ: DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Traduit de l’anglais, publication numéro MAN0019167 Rév. A.0. Historique des révisions: Pub. Nº MAN0019167 Révision Date A.0 24 avril 2020 Description Nouveau document traduit à partir d’un document en français (MAN0008880 Rev. B.0) avec les mises à jour suivantes : • Ajout du protocole MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit. • Modifications mineures de la formulation et de la mise en page pour plus de cohérence avec les documents connexes. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2020 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. FastPrep-24 est une marque de MP Biomedicals, LLC. Precellys est une marque de Bertin Technologies. RNeasy est une marque de QIAGEN GmbH. Nucleospin est une marque de MACHEREYNAGEL. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 13 Juillet 2020 ">
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