Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Besnoitia Ab 2.0 serum plasma bovine 7610530 Mode d'emploi

PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0
Test ELISA pour la détection in vitro d’anticorps dirigés contre Besnoitia besnoiti
dans les échantillons de sérum et de plasma des bovins
Coffret de 5 plaques pour 480 tests
©
Prionics AG
Notice d'utilisation
Version 2.0_f
Introduction
La besnoitiose bovine est causée par l’infection de
Besnoitia besnoiti, un parasite protozoaire apicomplexe. La transmission de cette maladie et le cycle de
vie de ce parasite ne sont pas encore entièrement
compris à ce jour. Il pourrait y avoir un transfert mécanique de la maladie par des mouches piqueuses,
telles que Tabanus et Stomoxys. Toutes les races
bovines, indépendamment du sexe et de l’âge, peuvent être infectées. Les bovins touchés subissent
différents stades de maladie avec une variété de
symptômes comprenant l’épaississement de la peau,
les œdèmes, la chute des poils et la nécrose cutanée.
L’infection chez les taureaux peut conduire à
l’infertilité. Dans des cas sévères, la maladie conduit à
la mort de l’animal. Des kystes de Besnoitia besnoiti
(de 200 à 600 µm de diamètre) sont trouvés dans la
sclérotique conjonctivale des yeux, le tissu souscutané, le fascia et les muqueuses des animaux
infectés et restent dans l’animal pendant des années.
Les infections par Besnoitia besnoiti sont susceptibles
de causer des pertes économiques substantielles et
une détérioration de la santé du bovin.
Le PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0 a été conçu pour
détecter les anticorps dirigés spécifiquement contre
Besnoitia besnoiti dans le sérum ou le plasma des
bovins. Le PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0 est un
excellent outil pour déterminer le statut des troupeaux
dans le but d’identifier des animaux infectés.
L’identification d’animaux infectés est importante pour
éviter la propagation de la maladie et aussi éviter
l’introduction d’animaux infectés dans un nouveau
troupeau.
Principe du test
Le test de diagnostic pour la détection d’anticorps
dirigés contre Besnoitia besnoiti dans le sérum ou le
plasma des bovins est basé sur la technologie ELISA.
L’antigène besnoitia tapisse la plaque ELISA. Les
échantillons de sérum ou de plasma sont incubés sur
la plaque. Un anticorps anti-bovin marqué à la peroxydase (POD) est utilisé pour la détection des anticorps
liés à l’antigène. La réaction colorée utilisant du
substrat TMB mesurée optiquement à une longueur
d’onde de 450 nm montre la présence d’anticorps
dirigés contre Besnoitia besnoiti.
Le PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0 suit un protocole en
quatre étapes, consistant en une préparation de
l’échantillon, une incubation de l’échantillon, une
incubation du conjugué et une révélation. Une plaque
avec 90 échantillons préparés peut être analysée en
l’espace de 120 minutes.
Composition du coffret
Conserver le coffret à 5±3°C jusqu’à la date de péremption qui figure sur l'étiquette. La durée de conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts
ou reconstitués, est mentionnée au chapitre s’y référant (voir ci-dessous « Préparation des réactifs »).
Composant 1
Plaque de test (en barrettes sécables)
Cinq microplaques sont conditionnées sous vide dans
des sachets contenant un dessicant.
Composant 2
Tampon diluant pour échantillon (Jaune)
Deux flacons contenant 60 ml de diluant échantillon
(Prêt à l’emploi).
Composant 3
Tampon de lavage
2 flacons contenant 60 ml de tampon de lavage
(concentré 20x)
À diluer avec de l’eau déminéralisée ou de qualité
équivalente (osmosée).
Composant 4
Diluant conjugué (rouge)
Un flacon contenant 60 ml de diluant pour conjugué
(Prêt à l’emploi).
Pour diagnostic in-vitro uniquement
Usage strictement vétérinaire
Conserver à 5±3°C
No Produit : 7610530
Composant 10
Contrôle négatif
Un flacon contenant 350 μl de sérum de contrôle
négatif (Prêt à l’emploi).
Autres composants du coffret :
- Notice d’utilisation
- Fiche de contrôle qualité du lot
Équipement nécessaire (non fourni)
Équipement de laboratoire utilisé et contrôlé conformément à la norme NF U 47-019 « Guide des
bonnes pratiques pour la mise en œuvre des
techniques ELISA ».
Équipement général :
 Eau déminéralisée ou eau de qualité équivalente
 Microplaques non-sensibilisée, utilisées pour la
dilution de l'échantillon (par ex. microplaque 96
puits à fond arrondi transparent) ou équivalent, à
titre indicatif
 Micropipettes monocanal et multicanaux adaptées
pour pipeter les volumes requis
 Embouts de micropipette (conformes aux recommandations du fabricant)
 Réservoirs pour les solutions
 Verrerie diverse adaptée
 Feuilles adhésives pour microplaques
 Vortex
Prise de l'échantillon :
Tubes dédiés au prélèvement sanguin.
Analyse des résultats :
Lecteur de microplaque équipé d'un filtre permettant
de lire les microplaques à 450 nm (Référence optionnelle à 620/650 nm).
Équipement optionnel :
Laveur de microplaques
Agitateur de microplaques.
Mode opératoire
Composant 5
Conjugué
Un flacon contenant 2 ml de conjugué (concentré 30x)
À diluer avec du diluant pour conjugué.
Remarques :
Les recommandations nationales pour la manipulation
d'échantillons animaux doivent être suivies de façon
stricte. Le test PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0 ne doit
être réalisé que dans des laboratoires équipés à cet
effet, conformément à la norme NF EN ISO/CEI 17025
« Exigences générales concernant la compétence
des laboratoires d’étalonnages et d’essais ».
Composant 6
Substrat chromogène (TMB)
Un flacon contenant 60 ml de substrat chromogène
(Prêt à l’emploi).
Les échantillons doivent être considérés comme
potentiellement infectieux et tout élément en contact
avec ces échantillons comme potentiellement contaminé.
Composant 7
Solution d’arrêt
Un flacon contenant 60 ml de solution d'arrêt (Prêt à
l’emploi).
Les informations sur les risques chimiques sont
indiquées en Annexe IV.
Composant 8
Contrôle positif
Un flacon contenant 350 μl de sérum de contrôle
positif (Prêt à l’emploi).
Composant 9
Contrôle faiblement positif
Un flacon contenant 350 μl de sérum de contrôle
faiblement positif (Prêt à l’emploi).
Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0, certaines précautions
techniques indiquées doivent être respectées (Voir
annexe I).
PRÉPARATION DES RÉACTIFS
Ramener tous les réactifs à température ambiante
(22±3°C) à l’exception du conjugué concentré 30x.
1
PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0
1. Microplaques sensibilisées
Ramener les plaques à température ambiante pendant au moins 30 min avant d’ouvrir le sachet en
plastique. Enlever les barrettes non-utilisées du
cadre et refermer le sachet en plastique contenant
son dessicant.
2. Contrôles positifs et négatif
Ramener à température ambiante et mélanger soigneusement chaque contrôle (Prêts à l’emploi).
3. Diluant pour échantillons
Tampon diluant pour échantillon. Ramener à température ambiante et mélanger soigneusement
(Prêt à l’emploi).
1.6
6. Tampon de lavage
Préparer la solution de travail du tampon de lavage
en mélangeant 1 volume de tampon de lavage
(concentrée 20x) avec 19 volumes d'eau déminéralisée ou de qualité équivalente. (Voir annexe II)
Remarque : si la solution de lavage (20x) fait apparaître la présence d'un précipité, chauffer le flacon
dans un bain-marie à 30°C jusqu'à dissolution
complète du précipité.
Utiliser une plaque non-sensibilisée pour la pré-dilution
des échantillons – des volumes inférieurs à 10 µl
devant être évités (augmentation des incertitudes).– à
raison de 1 puits par échantillon et 2 puits pour chacun
des contrôles (Voir annexe III)
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
2
6.2
Le contrôle faiblement positif (CFP) est considéré comme un échantillon pouvant servir à ce titre
de contrôle interne (CI) ; sa DO450 moyenne est
donc utilisée pour calculer son pourcentage de
positivité (E/P) dont la valeur doit être >35.
6.2
La DO450 moyenne des contrôles négatifs (CN)
doit être <0.15
INCUBATION DU CONJUGUÉ
3.1. Déposer 100 µl de conjugué dilué dans chacun
des puits de la microplaque. Couvrir à l’aide d’un
couvercle (ou d’une feuille adhésive) et agiter
légèrement la microplaque (5-10 sec. à ~300
rpm).
-
-
Si les résultats obtenus sont supérieurs ou
égaux au seuil de 23% de positivité (E/P ≥ 23%),
le test est considéré positif.
Si les résultats obtenus sont inférieurs au seuil
de 17 % de positivité (E/P < 17%), le test est
considéré négatif.
Si les résultats obtenus sont inférieurs au seuil
de 23 % de positivité et supérieurs ou égaux au
seuil de 17% de positivité (17% ≤ E/P < 23%), le
test est considéré douteux.
NOTE : Il est recommandé de retester cet animal douteux à partir d‘un nouvel échantillon prélevé 4 semaines plus tard (afin d’éliminer les cas
de séroconversion).
3.3
Laver la microplaque 3 fois avec 300 µl de
solution de travail du tampon de lavage par puits
comme au point 2.2.
Remarque : Faire attention à bien enlever tous
résidus de solution de lavage, ceux-ci pouvant
perturber la réaction du substrat lors de l’étape
de révélation !
Veuillez suivre les instructions mentionnées dans le
coffret PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0 aussi strictement
que possible étant donné que tout écart peut réduire la
performance du test et conduire à des résultats erronés.
RÉVÉLATION
Réaction du substrat
4.1 Distribuer 100 µl de substrat chromogène (TMB)
dans chacun des puits de la microplaque et agiter légèrement la microplaque (5-10 sec. à ~300
rpm).
4.2
Incuber la microplaque 15±1min. à température
ambiante (22±3°C).
Remarque : Protéger des rayons directs du soleil
4.3
Déposer 100 µl de solution d'arrêt dans chacun
des puits de la microplaque.
Remarque : La solution d’arrêt doit être ajoutée
dans les puits dans le même ordre et à la même
vitesse que la solution substrat. La couleur des
contrôles positifs doit virer du bleu au jaune.
LECTURE ET CALCUL DES RÉSULTATS
5.1
Agiter (à~300 rpm) la microplaque un court
instant (5-10 secondes).
5.2
Mesurer la densité optique (DO) des puits à
l’aide d’un lecteur de microplaques à 450 nm
dans les 15 min. qui suivent.
(Recommandation : utiliser un filtre de référence
à 620/650 nm).
Calculer la valeur DO450nm moyenne des puits
attribués au contrôle positif
(CP = DO450nm moyenne des contrôles positifs).
Déposer 10 µl d’échantillons de sérum ou de
plasma dans les puits restants de la microplaque
de dilution.
5.4
Calculer la valeur DO450nm moyenne des puits
attribués au contrôle faiblement positif
(CFP = DO450nm moyenne des contrôles faiblement positifs).
5.5
Calculer la valeur DO450nm moyenne des puits
attribués au contrôle négatif
(CN = DO450nm moyenne des contrôles négatifs).
5.6
Le pourcentage de positivité (E/P) des échantillons est calculé selon la formule ci-après.
Distribuer 90 µl de diluant pour échantillons dans
tous les puits de la microplaque sensibilisée.
-
Annexe I
5.3
Couvrir la microplaque de dilution à l’aide d’une
feuille adhésive et l’agiter à vitesse modérée
(~300 rpm) pendant au moins 1 min. à l'aide d'un
agitateur de microplaques.
Interprétation du pourcentage E/P
Incuber la microplaque pendant 30±1 min à
température ambiante (22±3°C).
Déposer 20 µl de contrôles positif, faiblement
positif et négatif dans les puits correspondants
de la microplaque de dilution.
Ajouter 90 µl de diluant pour échantillons à
chacun des puits de la microplaque de dilution, à
l’exception de ceux contenant les contrôles.
Si ces critères ne sont pas validés, les résultats sont
ininterprétables et la microplaque devra être testée à
nouveau.
3.2
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Dilution des échantillons de sérum ou de plasma :
Une dilution au 1:100 est appliquée pour les échantillons de sérum ou de plasma, la dilution des contrôles
restant au 1:10.
INCUBATION DES ÉCHANTILLONS
Laver la microplaque 3 fois avec 300 µl de
solution de travail du tampon de lavage par puits
à l’aide d’un laveur de microplaque avec un programme de lavage adapté.
Remarques : Si vous utilisez un laveur de microplaques, assurez vous qu’aucune aiguille n’est
obstruée. En cas de lavage manuel, prendre
garde aux contaminations croisées entre puits
adjacents. Après le dernier lavage, tapoter plusieurs fois la plaque retournée face vers le bas
sur du papier absorbant non-pelucheux afin de
retirer autant que possible tout résidu de liquide
de lavage restant à l’intérieur des puits (voir annexe I)
7. Solution Substrat chromogène
Ramener la solution à température ambiante
(22±3°C) au moins 30 min avant utilisation (Prête à
l’emploi).
Les échantillons de sérum ou de plasma peuvent être
obtenus en utilisant les méthodes de prélèvement
standards conformément à la norme NF U 47-020
« Conditions d’acceptabilité des échantillons pour
analyses ELISA ».
La DO450 moyenne des contrôles positifs (CP)
doit être >1.2
2.2
NOTE : La stabilité de la solution de lavage diluée
est de 2 semaines à 22±3°C.
NOTE : La solution substrat doit être claire et incolore. L’éliminer si une coloration bleue ou une forme
de précipitation apparaît. Verser la quantité nécessaire dans un récipient. Ne pas prélever à la pipette
directement dans le flacon et ne pas reverser la
solution non-utilisée dans le flacon.
6.1
Incuber les échantillons sur la microplaque
pendant 60±1 min. à température ambiante
(22±3°C).
5. Préparation du conjugué
Préparer la solution de travail du conjugué en mélangeant 1 volume de conjugué (concentré 30x)
avec 29 volumes de diluant pour conjugué (Voir
annexe II).
NOTE : La solution du réactif conjugué doit être
préparée extemporanément avant chaque série
d’analyses.
Elle peut être conservée jusqu’à 8 heures à température ambiante (22±3°C).
Critères de validation
2.1
4. Diluant pour conjugué
Tampon diluant pour conjugué. Ramener à température ambiante et mélanger soigneusement (Prêt à
l’emploi).
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Transférer 10 µl des échantillons pré-dilués et
des contrôles dans les puits correspondants de
la microplaque sensibilisée. Couvrir à l’aide
d’une feuille adhésive et agiter légèrement la microplaque (voir annexe I-3)
 OD450nm Échantillo n  OD450nm CN 
E/P  
 100
OD450nm CP  OD450nm CN


1. Le mélange par vortex doit être effectué à une
vitesse modérée, en sélectionnant « arrêt – départ » 3 ou 4 fois afin d’éviter ou de minimiser
l’apparition de mousse au niveau du diluant. Cette
démarche devrait être suivie à chaque fois qu’une
opération de mélange par vortex doit être appliquée
sur des réactifs biologiques.
Cependant, un mélange insuffisant peut également
s’avérer problématique.
Remarque : Il est impossible de « trop » mélanger
pour autant que cette action soit réalisée en douceur. Pour des résultats précis et reproductibles,
vérifier toujours que le conjugué a été mélangé de
façon homogène.
2. Éviter de placer les microplaques sensibilisées
(avec ou sans film adhésif) directement sur la surface de travail. Le froid du revêtement solide pourrait conduire à une baisse de la température et produire un phénomène couramment appelé “effet de
bords”.
3. Les instructions du coffret spécifient que lorsque les
réactifs sont ajoutés dans la microplaque, celle-ci
doit ensuite être mélangée en agitant. Le nonrespect de cette instruction peut diminuer la reproductibilité de l’essai et conduire à des résultats erronés. Après ajout de chaque réactif, la microplaque doit être placée dans un agitateur de plaque
et agitée comme indiqué. La microplaque doit également être mélangée de cette même façon avant
toute lecture optique.
4. L’utilisation d’une pissette en plastique au moment
de l’application du tampon de lavage dans les
plaques à la place d’un laveur d’EIE, peut laisser
une trop grande quantité de tampon de lavage dans
les puits après le nettoyage et ainsi provoquer un
nombre important de bulles. Une trop grande quantité de résidus de tampon de lavage peut affecter la
performance de la solution enzyme substrat. Ceci
pourrait conduire à une réduction significative de la
quantité de coloration développée par l’EIE pouvant
induire des valeurs inférieures et ainsi rendre les
résultats invalides.
PrioCHECK® Besnoitia Ab 2.0
Nous recommandons donc la méthodologie
suivante :
Laver les plaques comme expliqué dans les instructions du coffret. En fin de phase de lavage, tapoter
ou aspirer le contenu des puits. Évacuer le contenu
des puits en agitant fermement plusieurs fois jusqu’à ce que le tampon de lavage soit complètement
enlevé. Il ne doit plus y avoir de résidus du tampon
de lavage ni de bulles visibles dans les puits. Essuyer doucement dessus et dessous la plaque et
ajouter le conjugué ou le substrat. Placer la plaque
sur un agitateur pendant environ 1 min. pour bien
mélanger le contenu des puits.
5. Le papier absorbant tout comme les serviettes en
papier ne sont pas adaptés au séchage par touche
des plaques. Le papier libère des peluches qui
peuvent adhérer aux surfaces humides des puits et
provoquer un changement de couleur du substrat.
Utiliser un papier absorbant sans peluche ou un
matériau similaire pour essuyer les plaques.
6. La remise à zéro des lecteurs d'EIE peut être
problématique. Il s'avère que différents lecteurs
remettent différemment à zéro les résultats au niveau de lectures d'absorbance du contrôle négatif.
Tous les lecteurs doivent être remis à zéro en utilisant une nouvelle plaque ou bande non utilisée.
Annexe II
Préparation des solutions de travail du tampon de
lavage et du conjugué
Solution de travail du tampon de lavage :
Mélanger les volumes indiqués d'eau déminéralisée
ou de qualité équivalente (osmosée) et de liquide de
lavage 20x (Composant 3).
Pour préparer 1 litre de solution de travail de lavage:
 Transférer 50 ml de solution de lavage (20x) dans
un flacon de 1 l.
 Ajouter 950 ml d'eau déminéralisée ou de qualité
équivalente (osmosée) et mélanger jusqu'à obtention d'une solution claire (env. 30 min).
Pour d'autres volumes de solution de travail du tampon de lavage, veuillez vous référer au tableau cidessous.
Volume de solution
de liquide de lavage
0.3 l
0.5 l
1.0 l
2.0 l
=
=
=
=
Quantité de
liquide de lavage
15 ml
25 ml
50 ml
100 ml
Quantité d'eau
déminéralisée
285 ml
475 ml
950 ml
1900 ml
+
+
+
+
Solution de travail du conjugué :
Mélanger les volumes indiqués de conjugué 30x
(Composant 5) avec la quantité appropriée de diluant
pour conjugué (Composant 4) afin d'obtenir la quantité
désirée de conjugué.
Nb de
plaques
1
2
3
4
5
Conjugué
nécessaire
12 ml
24 ml
36 ml
48 ml
60 ml
=
=
=
=
=
Conjugué (30x)
0.4 ml
0.8 ml
1.2 ml
1.6 ml
2.0 ml
+
+
+
+
+
Diluant
pour conjugué
11.6 ml
23.2 ml
34.8 ml
46.4 ml
58.0 ml
Annexe IV
Réglementation de Sécurité
Risques et de Sécurité
:
Consignes
de
Les Normes de Sécurité Nationales doivent être
appliquées de façon stricte.
Composant 1
Microplaque
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 2
Tampon diluant pour échantillon (Prêt à l’emploi)
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 3
Solution de lavage (20x)
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 4
Diluant conjugué (Prêt à l’emploi)
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 5
Conjugué (30x)
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 6
Substrat (TMB) chromogène (Prêt à l’emploi)
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 7
Solution d’arrêt (Prêt à l’emploi)
Code de risque : R35 : Provoque des brûlures sévères.
S26 : En cas de contact avec les yeux, rincer immédiatement et abondamment avec de l’eau, et contacter
rapidement un médecin.
S35 : Ne se débarrasser de ce produit et de son
récipient qu'en prenant toutes les précautions d'usage.
S36/37/39 : Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux /
du visage.
S45 : En cas d’accident ou de malaise, consulter
rapidement un médecin (lui montrer l’étiquette du
produit si possible).
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Composant 8
Contrôle positif
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 9
Contrôle faiblement positif
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Composant 10
Contrôle négatif
Code de risque : Ce produit n’est pas classé d’après la
règlementation de l’Union Européenne.
Annexe V
Annexe III
Schéma de plaque donné à titre indicatif :
Les contrôles positif, faiblement positif et négatif
doivent être testés en double. De façon à compenser
les temps de distribution d’une série, il est conseillé de
placer chacun d’entre eux au début et à la fin de
chaque série d’échantillons.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
CN
E6
E 14
E 22
E 30
E 38
E 46
E 54
E 62
E 70
E 78
E 86
B
CFP
E7
E 15
E 23
E 31
E 39
E 47
E 55
E 63
E 71
E 79
E 87
C
CP
E8
E 16
E 24
E 32
E 40
E 48
E 56
E 64
E 72
E 80
E 88
D
E1
E9
E 17
E 25
E 33
E 41
E 49
E 57
E 65
E 73
E 81
E 89
E
E2
E 10
E 18
E 26
E 34
E 42
E 50
E 58
E 66
E 74
E 82
E 90
F
E3
E 11
E 19
E 27
E 35
E 43
E 51
E 59
E 67
E 75
E 83
CN
G
E4
E 12
E 20
E 28
E 36
E 44
E 52
E 60
E 68
E 76
E 84
CFP
H
E5
E 13
E 21
E 29
E 37
E 45
E 53
E 61
E 69
E 77
E 85
CP
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