NOTICE D’UTILISATION PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit Test ELISA pour la détection in vitro de l'antigène de la Peste Porcine Classique dans le sang total, le sérum, le plasma et les échantillons de tissus des porcs Référence Catalogue 7610047 Pub. Nº MAN0013832 Rév. A.0 AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Introduction La détection précoce des porcs infectés par le virus de la peste porcine classique (VPPC) est essentielle pour éviter la propagation du virus. Le dépistage précoce des porcs infectés doit donc reposer sur la détection antigénique du VPPC plutôt que sur la recherche des anticorps anti-VPPC qui ne sont détectables que 14 jours environ après le début de l'infection. Applied Biosystems™ PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit est un outil précieux qui permet de poser le diagnostic d'infection à VPPC avec plus de certitude et qui a été conçu pour donner le minimum de résultats faussement positifs (spécificité et sélectivité élevées) tout en préservant la plus grande sensibilité possible. PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit peut être utilisé pour contrôler les élevages de porcs suspectés d'être infectés par le VPPC. Dans les pays (ou régions) d'endémie de la peste porcine où la vaccination est souvent pratiquée, le test peut être utilisé pour rechercher les foyers résiduels de VPPC. Les résultats positifs doivent être confirmés par un test de référence (isolement du virus par culture cellulaire). Principe du test PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit est un test ELISA de type sandwich. Un anticorps spécifique du VPPC est fixé sur les barrettes. Dans un premier temps, le diluant échantillons et les échantillons (sang total, sérum, plasma, concentré leucocytaire ou extrait tissulaire) sont distribués dans les puits et incubés. Les barrettes sont ensuite lavées et un conjugué anti-VPPC très spécifique est ajouté dans tous les puits. Après incubation et lavage des barrettes, le conjugué fixé est révélé par addition d'un substrat chromogène (TMB). A la fin de la période d'incubation du substrat, le développement de la coloration est stoppé et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm afin de mettre en évidence la présence d'antigène spécifique de la peste porcine classique. Composition du coffret Coffret de 2 plaques pour 180 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C jusqu’à la date d’expiration qui figure sur l’étiquette du coffret. La durée de conservation des produits du coffret, une fois qu'ils sont dilués, ouverts ou reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous). Composant 1 : Plaque de microtitration 2 : Conjugué (30x) 3 : Tampon de dilution 4 : Additif du conjugué 5 : Eau déminéralisée 6 : Solution de lavage (200x) 7 : Diluant échantillons 8 : Sérum de contrôle 1 9 : Sérum de contrôle 2 10 : Sérum de contrôle 3 11 : Substrat chromogène (TMB) 12 : Solution d'arrêt Autres composants du coffret Description Deux plaques de barrettes sécables. Concentré 30x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 1.2 mL de conjugué. Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste avant utilisation. Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de tampon de dilution. Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 6.0 mL d'additif du conjugué. Un flacon contenant 10 mL d'eau déminéralisée. Concentré 200x, à diluer avant utilisation. Un flacon contenant 60 mL de solution de lavage. Conservation de la solution de lavage : 1semaine à 22±3°C. Prêt à l'emploi. Deux flacons contenant 10 mL de diluant échantillons. Lyophilisé. Un flacon contenant 1.5 mL de sérum de contrôle 1 (contrôle positif fort). Conservation du sérum de référence 1 reconstitué : à −20°C jusqu’à la date d’expiration. Lyophilisé. Un flacon contenant 1.5 mL de sérum de contrôle 2 (blanc). Conservation du sérum de référence 2 reconstitué : à −20°C jusqu’à la date d’expiration. Lyophilisé. Un flacon contenant 1.5 mL de sérum de contrôle 3 (contrôle positif faible). Conservation du sérum de référence 3 reconstitué : à −20°C jusqu’à la date d’expiration. Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de substrat chromogène (TMB). Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de solution d'arrêt. • 1 couvercle pour couvrir les barrettes pendant les périodes d'incubation • Notice d'utilisation Equipement nécessaire mais non fourni Use Description(1) Général Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales. Analyse des Lecteur de microplaques. Le lecteur doit être équipé d'un filtre résultats permettant de lire les plaques à 450 nm. Optionnel Laveur de microplaques. (1) Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement. Mode opératoire Précautions • Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte. • PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit ne doit être réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela. • Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être considéré comme potentiellement contaminé. La décontamination peut être faite avec de l'halamid à 1%, de l'hydroxyde de sodium à 0.4% ou du glutaraldéhyde à 1% (baisse de la concentration de VPPC de 4 à 5 log en 6 minutes). • Les échantillons à analyser doivent être conservés stérilement afin de pouvoir confirmer ultérieurement les résultats par isolement du virus. Remarques Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit, les précautions suivantes doivent être prises : • Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi. • Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C) avant utilisation. • L'embout des pipettes doit être changé à chaque fois qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé. • Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif. • Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de péremption ou si un changement dans leur aspect est observé. • Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests. • Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau équivalente. Solutions à préparer à l'avance Contrôles Reconstituer les contrôles (Composant 8–10) avec 1.5 mL de l'eau déminéralisée (Composant 5). Les sérums de contrôle lyophilisés, une fois reconstitués, doivent être aliquotés en petits tubes et conservés à −20°C jusqu’à la date d’expiration. Le nombre d'aliquots dépend du nombre de séries de tests prévu (max. 12 séries de tests). Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante : 1. Ramener le flacon à 22±3°C. 2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter doucement contre le plan de travail pour s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon. 3. Ouvrir le flacon. 4. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée (voir l'étiquette du flacon). 5. Reboucher le flacon et laisser le lyophilisat se dissoudre. 6. Agiter doucement le flacon jusqu'à dissolution complète du lyophilisat. 7. Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C. 8. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la formation de mousse). Dilution du conjugué Préparer la dilution de travail du conjugué en diluant le conjugué (30x) (Composant 2) dans le tampon de dilution (Composant 3) auquel aura été ajouté au préalable 20% (v/v) d'additif du conjugué. Pour deux barrettes : ajouter 400 µL d'additif du conjugué à 1.63 mL de tampon de dilution. Puis ajouter 70 µL de conjugué concentré (30x). Solution de lavage La solution de lavage (200x) (Composant 6) doit être dilué 1:200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité fournie est suffisante pour préparer un volume final de 12 litres. Stabilité de la solution de lavage diluée : 1 semaine à 22±3°C. Remarque : Le lavage des puits après incubation est une étape essentielle. Si la DO du blanc (sérum de contrôle 2) est >0.300, cela peut signifier que le lavage des puits est insuffisant. En cas de lavage manuel, laver les barrettes au moins 6 fois : distribuer 300 µL de solution de lavage dans chaque puits, vider les barrettes puis les tapoter soigneusement sur du papier absorbant avant de les remplir à nouveau. Eviter la formation de bulles d'air lors du remplissage des puits. Après le dernier lavage, veiller à ce qu'il ne reste plus de liquide de lavage au fond des puits en tapotant les barrettes sur du papier absorbant. Si, lorsque le lavage est effectué avec un laveur automatique, la DO du blanc est >0.300, opter pour le lavage manuel (voir ci-dessus). Remarque : Voir Annexe B pour la préparation et la conservation des échantillons Incubation des sérums 1. Identifier chaque barrette (Composant 1) avec un marqueur fin. 2. Distribuer 50 µL de diluant échantillons (Composant 7) dans tous les puits. 3. Déposer 50 µL de contrôle 1 dans les puits A1 et B1. 4. Déposer 50 µL de contrôle 2 dans les puits C1 et D1. 5. Déposer 50 µL de contrôle 3 dans les puits E1 et F1. 6. Déposer 50 µL d'échantillon dans les autres puits. 7. Couvrir et agiter doucement les barrettes. 8. Incuber 180±5 minutes à 22±3°C. Remarque : Si l'échantillon est du sang total, vérifier qu'il ne reste plus de sang dans l'embout de la pipette après avoir déposé l'échantillon dans le puits. Incubation avec le conjugue 1. Vider les barrettes et laver 6× avec 300 µL de solution de lavage dilué par puits. Tapoter fermement les plaques après le dernier cycle de lavage. Remarque : Il ne doit pas rester de sang dans les puits. 2. Distribuer 100 µL de conjugué dilué dans tous les puits. 3. Couvrir les barrettes. 4. Incuber 60±5 minutes à 22±3°C. Incubation avec le substrat chromogène (TMB) 1. Vider les barrettes et laver 6× avec 300 µL de liquide de lavage dilué par puits. Tapoter fermement les plaques sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage. 2. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) (Composant 11) dans tous les puits. 3. Incuber 15 minutes à 22±3°C. Ne pas agiter. 4. Ajouter 100 µL de solution d'arrêt (Composant 12). 5. Homogénéiser le contenu des barrettes. Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes après avoir déposé la solution de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits. Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB). Lecture du test et calcul des résultats 1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la solution d'arrêt. 2. Calculer la DO450 moyenne des puits C1 et D1 (contrôle 2 = DO450 blanc). 3. Calculer la DO450 corrigée de tous les échantillons en soustrayant la DO450 blanc. 4. Le pourcentage de positivité (PP) du contrôle 3 et des échantillons est calculé selon la formule ci-dessous. La DO450 corrigée des échantillons est exprimée en pourcentage de positivité (PP) par rapport à la DO450 du contrôle 1. PP = (DO450 corrigée de l'échantillon / DO450 corrigée du contrôle 1) × 100 Interprétation des résultats Validation des critères 1. La DO450 du contrôle 2 doit être <0.350. 2. La DO450 corrigée du contrôle 1 doit être au moins égale à 0.750. 3. Le PP du contrôle 3 doit être >20%. Remarque : Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de test sont ininterprétables. Remarque : Si la DO450 moyenne corrigée du contrôle 1 est inférieure à 0.750, la solution de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les barrettes plus longtemps (sans dépasser 30 minutes d'incubation). Si la DO450 moyenne corrigée du contrôle 1 est supérieure à 2.000, il est conseillé de réduire le temps d'incubation avec le substrat chromogène (TMB). thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 18 Mars 2019 Interprétation du pourcentage de positivité PP = <15% Négatif PP = ≥15% Positif Absence d'antigène du VPPC détectable dans l'échantillon testé. Présence d'antigène du VPPC dans l'échantillon testé. La présence d'antigène du VPPC dans les échantillons positifs doit être confirmée par l'isolement du virus. Annexe A - Références bibliographiques 1. 2. 3. 4. Ressang, A.A., (1973). Zbl Vet Med B 20:256–271. Wensvoort et al, (1986). Vet Microbiol 12:101–108. Kaden et al, (1999). Berl Münch Tierärtzl Wschr 112:52–57. Martin et al, (1992). Prev Vet Med 14:33–34. Annexe B - Préparation et conservation des échantillons Il existe plusieurs techniques pour préparer un extrait tissulaire. Ce dernier pourra être utilisé pour effectuer d'autres tests avec PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit et pour isoler le virus par culture. La technique décrite ci-dessous est basée sur celle qui est utilisée en routine au Laboratoire de Référence de la PPC à l'Institut pour la Santé Animale et pour la Science aux Pays-Bas. Echantillons de sang et de plasma Il est préférable de ne pas congeler les échantillons de sang total prélevés sur anticoagulant (héparine de préférence) ou le plasma. Les conserver à 5±3°C (max. 7 jours) avant de les tester. Sérums Les échantillons de sérum peuvent être testés directement ou après stockage à −70°C. Une fois testés, ils peuvent être conservés à −70°C (afin de maintenir les virus vivants). Préparation de l'extrait tissulaire 1. Découper 1 à 2 grammes de tissus en petits morceaux et les broyer, avec une faible quantité de milieu, dans un mortier avec un pilon, jusqu'à obtention d'une pâte homogène. Utiliser du sable stérile comme abrasif si nécessaire. 2. Par gramme de tissus, ajouter 9 mL de milieu de Earle (MEM) (additionné de 5x la concentration normale de streptomycine, pénicilline et mycostatine). 3. Incuber 1 heure à 22±3°C. 4. Centrifuger la suspension 20±1 minutes à 6000 × g. 5. Prélever délicatement le surnageant et jeter le culot. 6. Aliquoter la suspension en petits tubes (au moins 2 tubes). 7. Conserver les tubes à −70°C. Préparation du concentré leucocytaire Avant la réalisation du test, congeler la fraction leucocytaire d'un prélèvement de sang total, de préférence à −20°C, puis la décongeler. 1. Mettre 8 mL de solution de NH4CL à 0.83% dans un tube de 15 mL. 2. Ajouter 4 mL d'échantillon de sang total prélevé sur anticoagulant. 3. Mélanger le contenu du tube et incuber 30 minutes à T° ambiante afin d'obtenir une lyse complète des globules rouges. 4. Centrifuger 10 minutes à 500 × g à 22±3°C. 5. Jeter le surnageant. 6. Remettre le culot leucocytaire en suspension dans 400 µL de milieu de Earle (MEM) (additionné de 5% de sérum fœtal de veau et de streptomycine, pénicilline et mycostatine). 7. Conserver à −70°C (afin de maintenir les virus vivants). Service clientèle et assistance technique Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment : • Numéros de téléphone partout dans le monde • Commande et Support web • Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles • Certificats d’analyse • Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques)) Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant. Garantie produit limitée Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support. Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Historique des révisions : Pub. Nº MAN0013832 (français) Rév. Date Description Nouveau document. Conversion effectuée du document existant (PrioCHECK CSFV Ag 7610047_v1.1_f.doc) sur le modèle du document en A.0 18 Mars 2019 cours, avec mises à jour associées aux informations de licence limitée, à la garantie, aux marques et aux logos. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2019 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. ">
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