GUIDE COMPLÉMENTAIRE VetMAX™ C. burnetii Feces Kit Protocoles de purification des acides nucléiques optimisés pour une utilisation avec le kit (réf. n° FQPE) Pub. nº MAN0008769 Rév. D.0 Espèces Matrices d’échantillons • Bovins • Fèces • Petits ruminants (ovins, caprins) • Lingettes et pédichiffonnettes Type de test Individuel AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support. AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur thermofisher.com. Suivre toutes les réglementations du travail avec des échantillons biologiques locales, nationales et/ou communautaires en vigueur. ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ Objectif de ce guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Choix de l’échantillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Conservation des échantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Protocoles de purification d’ADN recommandés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Instructions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Purification de l’acide nucléique avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Préparation des échantillons en vue de leur purification avec d’autres kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Purification de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Purification de l’ADN avec le QIAamp™ 96 DNA Swab BioRobot Kit (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ 8 Tissue/NucleoSpin™ 96 Tissue (méthode manuelle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ■ ■ Matériels requis non fournis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Procédure de purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Annexe B Documentation et support ■ ■ Assistance à la clientèle et support technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Garantie limitée du produit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Objectif de ce guide Ce guide décrit les protocoles de purification d’ADN bactérien de Coxiella burnetii validés et optimisés pour une utilisation en aval avec le ™ ™ Applied Biosystems VetMAX C. burnetii Feces Kit (réf. n° FQPE). ™ • La purification automatisée des acides nucléiques est réalisée à l’aide de l’un des instruments suivants : KingFisher Flex, MagMAX ™ ™ Express-96, KingFisher mL ou KingFisher Duo Prime. • La purification manuelle d’acides nucléiques utilise des colonnes ou des plaques de centrifugation à base de silice. Pour usage en laboratoire. ™ Choix de l’échantillon Type d’échantillon Type d’analyse Quantité requise Fèces Individuel 1 ml de fèces liquides ou 1 g de fèces solides[1] Lingettes et pédichiffonnettes Individuel 200 µl d’éluat [1] Selon le protocole de purification utilisé. Conservation des échantillons Type d’échantillon Fèces Conservation Après le prélèvement, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 2 jours maximum). Après utilisation ou à expiration du délai de 2 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Lingettes et pédichiffonnettes Après le prélèvement, placer la lingette ou l’écouvillon dans un sac stérile, puis décontaminer l’extérieur du sac avec une solution à base d’eau de Javel diluée. Conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 2 jours maximum). Après utilisation ou à expiration du délai de 2 jours, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme. Matériels requis non fournis Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Les références catalogue qui s’affichent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits. Matériel nécessaire pour la collecte d’échantillon, la préparation, et la purification des acides nucléiques Tableau 1 Matériel requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons Article Source Équipement Poste de Sécurité Microbiologique de type II (PSMII) PFL Centrifugeuse de paillasse PFL Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL Micropipettes de précision ajustables (gamme de 1 µl à 1 000 µl) PFL Balance de précision PFL Consommables Embouts de pipette résistant aux aérosols, sans nucléase PFL Microtubes DNase/RNase-free de 1,5 ml et 2,0 ml PFL Tubes de 10 ml PFL Réactifs 5 – IPC Cox b. FE 4d – EPC Cox b. FE Eau sans nucléase PBS (1X), pH 7.4 2 À partir du VetMAX™ C. burnetii Feces Kit (réf. n° FQPE) AM9932 PFL ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit Matériel supplémentaire nécessaire pour la purification automatisée des acides nucléiques Tableau 2 Matériel nécessaire pour le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit Article Source Instrument, l’un des suivants : KingFisher™ Flex Purification System MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor KingFisher Duo Prime Purification System ™ Contacter votre représentant commercial local. KingFisher™ mL Purification System Équipement Bloc chauffant à 55°C PFL Réservoir de réactifs PFL PYREX Solid Glass Beads for Distillation Columns (5 mm) ou billes en verre de 5 mm équivalentes ™ Fisher Scientific™ 11‑312‑10C Consommables Adhesive PCR Plate Foils, ou l’équivalent AB0626 Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 : • KingFisher™ 96 Deep-Well Plate • 95040450 • KingFisher™ 96 KF microplates • 97002540 • KingFisher 96 tip comb for deep-well magnets • 97002534 ™ Consommables pour les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Voir Tableau 8 en page 16. Kits et réactifs MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit A32700 ou A32702 PBS, pH 7.4 (10X), exempt d’ARNase AM9624 PK Buffer for MagMAX™-96 DNA Multi-Sample Kit 4489111 UltraPure™ SDS Solution, 10% 24730020 Matériel supplémentaire nécessaire pour la purification manuelle des acides nucléiques Tableau 3 Matériel nécessaire pour toutes les méthodes manuelles (formats individuels, plaques et barrettes de tubes) Source Élément Équipement Bloc chauffant à 70°C PFL Kits et réactifs L’un des kits suivants : • QIAamp™ DNA Mini Kit • Qiagen 51304 • Kit NucleoSpin Tissue • Macherey Nagel 740952 • QIAamp™ 96 DNA Swab BioRobot Kit • Qiagen 965842 • Kit NucleoSpin 96 Tissue • Macherey Nagel 740741.4 • Kit NucleoSpin™ 8 Tissue • Macherey Nagel 740740 ™ ™ Éthanol à 96–100 % PFL Tableau 4 Matériel nécessaire pour la purification manuelle dans les formats plaque ou barrette de tubes Article Source Centrifugeuse pour plaques PFL Film adhésif PFL ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 3 Protocoles de purification d’ADN recommandés Type d’échantillon Purification automatisée Purification manuelle • QIAamp™ DNA Mini Kit (page 9) • Kit NucleoSpin™ Tissue (page 11) Fèces MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit (page 4) ™ • QIAamp™ 96 DNA Swab BioRobot Kit (page 12) • Kit NucleoSpin™ 8 Tissue / NucleoSpin™ 96 Tissue (page 13) Lingettes et pédichiffonnettes – • QIAamp™ DNA Mini Kit (page 9) • Kit NucleoSpin™ Tissue (page 11) Instructions Traiter les contrôles suivants en même temps que les échantillons testés, en utilisant le même protocole de purification : • Préparer au moins un échantillon témoin purifié à utiliser en tant que contrôle négatif d’extraction. Utiliser PBS (1X), pH 7.4 ou de l’eau sans nucléase au lieu de l’échantillon testé, sauf indication contraire. ™ • Contrôle positif externe (EPC). Utiliser 4d – EPC Cox. b. FE qui est fourni avec le VetMAX C. burnetii Feces Kit. L’EPC purifié peut être stocké pour une utilisation dans les tests PCR temps réel avec les échantillons qui sont purifiés à l’aide du même protocole. Purification de l’acide nucléique avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit (méthode automatisée) Cette procédure est conçue pour une purification rapide de l’ADN bactérien des fèces. Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Flex ™ • MagMAX Express-96 Suivre l’Annexe A, “Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” si les instruments suivants sont utilisés : ™ • KingFisher Duo Prime ™ • KingFisher mL 4 ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit Méthode Méthode avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit Préparation des plaques pour le traitement Préparation de la solution de Lysis / Binding / Bead / IPC Préparation de la PK Solution Préparation de l’échantillon Traitement des échantillons avec la PK Solution Mélange des échantillons traités à la PK avec la solution de Lysis / Binding / Bead / IPC Placement des échantillons dans l’instrument Instructions • Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger. • Pour éviter toute contamination croisée : – Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement. – Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures. • Pour éviter toute contamination par les nucléases : – Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent l’acide nucléique des nucléases présentes sur la peau. – Utiliser des embouts de pipettes exempts d’acide nucléique pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés dans les récipients de réactifs. – Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer. ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 5 Téléchargement et installation du script ™ Le script adéquat pour le MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation. ™ 1. Sur la page internet du produit MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit (à l’adresse thermofisher.com, effectuer une recherche à partir de la référence), faire défiler jusqu’à la section Documentation du produit. 2. Faire un clic droit sur le fichier approprié pour télécharger la version la plus récente du script MagMAX_CORE pour votre instrument. Tableau 5 Scripts recommandés Instrument Nom du script KingFisher™ Flex MagMAX_CORE_Flex.bdz KingFisher 96 MagMAX_CORE_KF-96.bdz ™ MagMAX Express-96 ™ KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz Si requis par votre laboratoire, utiliser l’un des scripts suivants, qui ne chauffe pas le liquide lors de l’étape d’élution. Tableau 6 Scripts alternatifs sans étape d’élution chauffée Nom du script Instrument KingFisher™ Flex MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz KingFisher 96 MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz ™ MagMAX Express-96 ™ KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz 3. Se référer au guide de l’utilisateur de l’instrument ou contacter l’assistance technique pour connaître les instructions d’installation du script. Réalisation de la procédure de purification 1 Préparation des plaques pour le traitement 1.1. Préparation des plaques pour le traitement. Tableau 7 Configuration de la plaque : Instrument KingFisher™ Flex ou MagMAX™ Express-96 [1] ID de la plaque Position de la plaque[1] Type de plaque Réactif Volume par puits Plaque de lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Plaque de lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque. Position sur l’instrument. Remarque : Pour configurer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument KingFisher ™ Duo Prime ou KingFisher mL, voir Annexe A, “Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo ™ Prime ou KingFisher mL”. ™ 1.2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument. 6 ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 2 ™ 2.1. Bien vortexer les MagMAX CORE Magnetic Beads afin que toutes les billes soient resuspendues. Préparation de la solution de Lysis / Binding / Bead / IPC 2.2. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons, plus jusqu’à 10 % d’excédent. Composant Volume par échantillon MagMAX™ CORE Lysis Solution 350 µl MagMAX™ CORE Binding Solution 350 µl MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 μl 5 – IPC Cox b. FE 5 µl Solution de Lysis / Binding / Beads / IPC totale 725 µl 2.3. Homogénéiser en retournant le tube ou la bouteille au moins 10 fois. 3 Préparation de la PK Solution Préparer la PK Solution immédiatement avant utilisation. 3.1. Mélanger les composants suivants pour le nombre requis d’échantillons plus 10 % d’excédent (recommandé). Composant Volume par échantillon PK Buffer for MagMAX™-96 DNA Multi-Sample Kit 90 µl ™ MagMAX CORE Proteinase K 10 µl PK Solution totale 100 µl 3.2. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour rassembler le contenu au fond du tube. 3.3. Passer immédiatement à l’étape suivante. 4 4.1. Ajouter les composants suivants dans un tube conique de 10 ml. Préparation de l’échantillon • Fèces : 1 ± 0,1 ml d’échantillon liquide ou 1 ± 0,1 g d’échantillon solide • SDS (1 %) : 4 ml ™ • PYREX Solid Glass Beads for Distillation Columns (5 mm) : 3 billes 4.2. Vortexer vigoureusement pendant 5 minutes. 4.3. Centrifuger à 1 500 × g pendant 1 minute. Sinon, incuber les échantillons sur une surface exempte de vibrations pendant 5 minutes. 4.4. Procéder immédiatement à l’étape suivante avec 200 µl de surnageant. 5 Traitement des échantillons avec la PK Solution ™ 5.1. Transférer le volume approprié de chaque échantillon vers un nouveau tube ou puits d’une plaque deep well. Pour… Utiliser… Les fèces 200 µl de surnageant L’échantillon témoin purifié 200 μl de PBS (1X), pH 7.4 ou rien Le contrôle positif 200 μl de 4d – EPC Cox b. FE Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 7 5 Traitement des échantillons avec la PK Solution (suite) 5.2. Traiter l’échantillon avec la PK Solution. Pour… Traitement du tube Procéder ainsi… 1. Ajouter 100 µl de PK Solution à chaque échantillon, puis vortexer brièvement pour mélanger. 2. Incuber 30 minutes à 55°C. 3. Centrifuger brièvement pour rassembler le contenu au fond du tube. 4. Procéder avec 300 µl d’échantillon traité à la PK. Traitement d’une plaque 1. Ajouter 100 µl de PK Solution à chaque échantillon, puis mélanger par aspiration-refoulement. 2. Sceller la plaque avec une feuille adhésive. 3. Incuber 30 minutes à 55°C. 4. Centrifuger brièvement pour rassembler le contenu au fond du tube. 5. Procéder avec 300 µl d’échantillon traité à la PK. 6 Mélange des échantillons traités à la PK avec la solution de Lysis / Binding / Bead / IPC 6.1. Ajouter 300 µl de chaque échantillon traité à la PK dans les puits appropriés de la plaque d’échantillons ou dans la barrette de tubes. 6.2. Vortexer soigneusement la solution de Lysis / Binding / Bead / IPC pour s’assurer que les billes sont complètement resuspendues. 6.3. Ajouter 725 µl de solution de Lysis / Binding / Bead / IPC à chaque échantillon. 6.4. Procéder immédiatement au traitement des échantillons sur l’instrument (section suivante). 7 Placement des échantillons dans l’instrument 7.1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). 7.2. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque l’instrument vous invite à le faire. Conserver l’acide nucléique purifié sur glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois maximum, ou à -80°C pour une conservation à long terme. 8 ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit Préparation des échantillons en vue de leur purification avec d’autres kits Préparer les échantillons comme décrit. Type d’échantillon Méthode de purification Fèces Action 1. Ajouter les composants suivants dans un tube conique de 50 ml. • Fèces : 1 g d’échantillon solide Automatisée • PBS (1X), pH 7.4 : 10 ml • PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 3 billes 2. Vortexer pendant 1 minute. 3. Transférer immédiatement 1 ml de la suspension dans un tube de 1,5 ml. 4. Centrifuger à 1 000 × g pendant 2 minutes. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. 1. Ajouter les composants suivants dans un tube conique de 10 ml. • Fèces : 1 g d’échantillon solide Manuelle • PBS (1X), pH 7.4 : 4 ml 2. Vortexer pendant 1 minute. 3. Transférer immédiatement 400 µl de la suspension dans un tube de 1,5 ml. 4. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. Lingettes ou pédichiffonnettes 1. Ajouter 40 ml de PBS (1X), pH 7.4 dans le sac contenant la lingette ou pédichiffonnette sèche. Manuelle 2. Malaxer le sac pendant 1 minute. 3. Transférer 400 µl de la suspension dans un tube de 1,5 ml. 4. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute. 5. Procéder avec 200 µl de surnageant. Purification de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit Reconstitution des tampons AW1 et AW2 Buffers : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 1.1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Lyse et homogénéisation des échantillons (fèces) Composant Échantillon préparé Volume par échantillon Volume par échantillon de test témoin purifié Volume par contrôle positif 200 µl de surnageant – – PBS (1X), pH 7.4 – 200 µl – 4d – EPC Cox b. FE – – 200 µl 5 µl 5 µl 5 µl AL Buffer 200 µl 200 µl 200 µl Protéinase K 20 μl 20 μl 20 μl 5 – IPC Cox b. FE 1.2. Vortexer pendant 15 secondes. 1.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes. ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 9 1 2 Lyse et homogénéisation des échantillons (fèces) (suite) 1.4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. Lyse et homogénéisation des échantillons (lingettes ou pédichiffonnettes) 2.1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. 1.5. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis centrifuger brièvement pour rassembler le contenu. Composant Échantillon préparé Volume par échantillon Volume par échantillon de test témoin purifié Volume par contrôle positif 200 µl de surnageant – – PBS (1X), pH 7.4 – 200 µl – 4d – EPC Cox b. FE – – 200 µl 5 µl 5 µl 5 µl ATL Buffer 180 µl 180 µl 180 µl Protéinase K 20 μl 20 μl 20 μl 5 – IPC Cox b. FE 2.2. Vortexer pendant 15 secondes. 2.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes. 2.4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 2.5. Ajouter 200 µl d’AL Buffer, puis vortexer pendant 15 secondes. 2.6. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis centrifuger brièvement pour rassembler le contenu. 3 Liaison de l’ADN à la colonne ™ 3.1. Insérer une colonne QIAamp DNA Mini Kit dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du volume de l’échantillon dans la colonne. 3.2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 15 000 × g pendant 1 minute. 3.3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 4 Lavage et élution de l’ADN 4.1. Ajouter 500 μl d’AW1 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g pendant 1 minute. 4.2. Jeter le tube collecteur, puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 4.3. Ajouter 500 μl d’AW2 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g pendant 1 minute. 4.4. Jeter le tube collecteur, puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 4.5. Centrifuger à 15 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane. 4.6. Jeter le tube collecteur. 4.7. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl d’AE Buffer. 4.8. Boucher la colonne, puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. 4.9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ADN purifié se trouve dans le microtube. 10 ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 4 Lavage et élution de l’ADN (suite) Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit • Reconstitution du tampon B5 Buffer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. • Reconstitution de la PK : ajouter le volume requis de tampon PB Buffer selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 1.1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Lyse et homogénéisation des échantillons (fèces) Composant Échantillon préparé Volume par échantillon Volume par échantillon de test témoin purifié Volume par contrôle positif 200 µl de surnageant – – PBS (1X), pH 7.4 – 200 µl – 4d – EPC Cox b. FE – – 200 µl 5 µl 5 µl 5 µl B3 Buffer 200 µl 200 µl 200 µl Protéinase K 25 μl 25 μl 25 μl 5 – IPC Cox b. FE 1.2. Vortexer pendant 15 secondes. 1.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes. 1.4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 1.5. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis centrifuger brièvement pour rassembler le contenu. 2 2.1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Lyse et homogénéisation des échantillons (lingettes ou pédichiffonnettes) Composant Échantillon préparé Volume par échantillon Volume par échantillon de test témoin purifié Volume par contrôle positif 200 µl de surnageant – – PBS (1X), pH 7.4 – 200 µl – 4d – EPC Cox b. FE – – 200 µl 5 µl 5 µl 5 µl T1 Buffer 180 µl 180 µl 180 µl Protéinase K 25 μl 25 μl 25 μl 5 – IPC Cox b. FE 2.2. Ajouter 200 µl de B3 Buffer, puis vortexer pendant 15 secondes. 2.3. Incuber à 70°C pendant 10 minutes. ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 11 2 3 Lyse et homogénéisation des échantillons (lingettes ou pédichiffonnettes) (suite) 2.4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. Liaison de l’ADN à la colonne 3.1. Insérer une colonne de kit NucleoSpin Tissue dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du volume de l’échantillon dans la colonne. 2.5. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis centrifuger brièvement pour rassembler le contenu. ™ 3.2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 11 000 × g pendant 1 minute. 3.3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 4 Lavage et élution de l’ADN 4.1. Ajouter 500 μl de tampon BW Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 11 000 × g pendant 1 minute. 4.2. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 4.3. Ajouter 600 μl de tampon B5 Buffer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 11 000 × g pendant 1 minute 4.4. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur. 4.5. Centrifuger à 11 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane. 4.6. Jeter le tube collecteur. 4.7. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl de tampon BE Buffer. 4.8. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute. 4.9. Centrifuger à 11 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne. L’ADN purifié se trouve dans le microtube. Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ADN avec le QIAamp™ 96 DNA Swab BioRobot Kit (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit Reconstitution des tampons AW1 et AW2 Buffers : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. Réalisation de la procédure de purification 1 Lyse et homogénéisation des échantillons 1.1. Mélanger les composants suivants dans une plaque de lyse (S-Block 1), puis passer immédiatement à l’étape suivante. Composant Échantillon préparé 12 Volume par échantillon Volume par échantillon de test témoin purifié Volume par contrôle positif 200 µl de surnageant – – PBS (1X), pH 7.4 – 200 µl – 4d – EPC Cox b. FE – – 200 µl 5 – IPC Cox b. FE 10 µl 10 µl 10 µl AL Buffer 200 µl 200 µl 200 µl Protéinase K 20 μl 20 μl 20 μl ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 1 Lyse et homogénéisation des échantillons (suite) 1.2. Mélanger par aspiration-refoulement 5 fois, puis sceller la plaque avec un film adhésif. 1.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes ou à 56°C pendant 16–18 heures. 1.4. Laisser refroidir les échantillons, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 1.5. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % à chaque échantillon, puis mélanger par aspirationrefoulement 5 fois. 2 ™ 2.1. Placer une plaque QIAamp ‑96 (plaque d’extraction) sur un nouveau S‑Block, puis transférer chaque broyat de S‑Block 1 vers les puis appropriés de la plaque d’extraction. Liaison de l’ADN à la colonne 2.2. Sceller la plaque avec un film adhésif, puis centrifuger la plaque/le S-Block à 6 000 x g pendant 4 minutes. 2.3. Jeter le S‑Block, puis placer la plaque d’extraction sur un nouveau S‑Block. 3 3.1. Ajouter 500 µl de tampon AW1 dans chaque puits, fermer à l’aide d’un film adhésif, puis centrifuger 2 minutes à 6 000 × g. Lavage et élution de l’ADN 3.2. Jeter le S‑Block, puis placer la plaque d’extraction sur un nouveau S‑Block. 3.3. Ajouter 500 µl de tampon AW2 dans chaque puits, fermer à l’aide d’un film adhésif, puis centrifuger 2 minutes à 6 000 × g. 3.4. Jeter le S‑Block, puis placer la plaque d’extraction sur un nouveau S‑Block. 3.5. Retirer le film adhésif, puis centrifuger à 6 000 × g pendant 10 minutes pour sécher la membrane. 3.6. Jeter le S-Block. 3.7. Placer la plaque d’extraction sur les tubes d’élution, puis ajouter 100 μl de tampon AE à chaque puits. 3.8. Sceller la plaque d’extraction avec du film adhésif, puis incuber à température ambiante pendant 2 minutes. 3.9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 3 minutes, puis jeter la plaque d’extraction. L’ADN purifié se trouve dans les tubes d’élution. Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Purification de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ 8 Tissue/NucleoSpin™ 96 Tissue (méthode manuelle) Avant la première utilisation du kit • Reconstitution du tampon B5 Buffer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur. • Reconstitution de la PK : ajouter le volume requis de tampon PB Buffer selon les recommandations du fournisseur. ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 13 Réalisation de la procédure de purification 1 Lyse et homogénéisation des échantillons 1.1. Mélanger les composants suivants dans une plaque de lyse (MN Round‑Well Block) ou une barrette de lyse, puis passer immédiatement à l’étape suivante. Volume par échantillon Volume par échantillon de test témoin purifié Composant Échantillon préparé Volume par contrôle positif 200 µl de surnageant – – PBS (1X), pH 7.4 – 200 µl – 4d – EPC Cox b. FE – – 200 µl 5 – IPC Cox b. FE 10 µl 10 µl 10 µl BQ1 Buffer 200 µl 200 µl 200 µl Protéinase K 25 μl 25 μl 25 μl 1.2. Mélanger par aspiration-refoulement 5 fois, puis sceller la plaque avec un film adhésif. 1.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes ou à 56°C pendant 16–18 heures. 1.4. Laisser refroidir les échantillons, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la condensation. 1.5. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % à chaque échantillon, puis mélanger par aspirationrefoulement 5 fois. 2 Liaison de l’ADN à la colonne ™ ™ 2.1. Placer une NucleoSpin Tissue Binding Plate (plaque d’extraction) ou une NucleoSpin Tissue Binding Strip (barrette d’extraction) sur un nouveau MN Square‑Well Block, puis transférer chaque broyat vers les puits appropriés de la plaque/barrette d’extraction. 2.2. Sceller la plaque/barrette d’extraction avec un film adhésif, puis centrifuger l’ensemble à 6 000 x g pendant 2 minutes. 2.3. Jeter le MN Square‑Well Block, puis placer la plaque/barrette d’extraction sur un nouveau MN Square‑Well Block. 3 Lavage et élution de l’ADN 3.1. Ajouter 600 µl de tampon BW dans chaque puits, fermer à l’aide d’un film adhésif, puis centrifuger 2 minutes à 6 000 × g. 3.2. Jeter le MN Square‑Well Block, puis placer la plaque/barrette d’extraction sur un nouveau MN Square‑Well Block. 3.3. Ajouter 900 µl de tampon B5 dans chaque puits, fermer à l’aide d’un film adhésif, puis centrifuger 2 minutes à 6 000 × g. 3.4. Jeter le MN Square‑Well Block, puis placer la plaque/barrette d’extraction sur un nouveau MN Square‑Well Block. 3.5. Centrifuger à 6 000 × g pendant 10 minutes pour sécher la membrane. 3.6. Jeter le MN Square‑Well Block. 3.7. Placer la plaque/barrette d’extraction sur une plaque ou barrette d’élution, puis ajouter 100 μl de tampon BE à chaque puits. 3.8. Sceller la plaque/barrette d’extraction avec du film adhésif, puis incuber à température ambiante pendant 3 minutes. 3.9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 3 minutes, puis jeter la plaque/barrette d’extraction. L’ADN purifié se trouve dans la plaque/barrette d’élution. 14 ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 3 Lavage et élution de l’ADN (suite) Conserver l’ADN purifié entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour une conservation à long terme. Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR • Porter des gants et une blouse de laboratoire propres. – Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits amplifiés ou préparer des échantillons. • Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible. • Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes : – Préparation des échantillons et configuration de la réaction. – Amplification et analyse des produits. • Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone pré-PCR de la réaction. • Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols. • Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible. • Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols. • Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de décontamination ADN. ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 15 Annexe A Purification avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL ™ ™ Suivre cette procédure pour la purification avec le MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit à l’aide de l’instrument KingFisher Duo ™ Prime ou KingFisher mL. Matériels requis non fournis Tableau 8 Matériels requis pour le traitement avec les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Source[1] Article Consommables pour l’instrument KingFisher™ Duo Prime KingFisher™ Duo Pack Combi pour plaque Microtiter 96 Deepwell (peignes, plaques et barrettes d’élution pour 96 échantillons) 97003530 KingFisher™ Duo Elution Strip (pack de 40)[2] 97003520 KingFisher™ Duo Peigne à 12 pointes pour plaque Microtiter 96 Deepwell (pack de 50)[2] 97003500 KingFisher™ Flex Microtiter Deep-Well 96 plates[2] 95040460 Consommables pour l’instrument KingFisher mL ™ KingFisher™ mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141 KingFisher mL Peigne (800 unités) 97002111 KingFisher™ mL Tube (20 x 45 unités) 97002121 ™ [1] [2] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire. Inclus dans le pack KingFisher™ Duo Combi (Réf. 97003530). Procédure de purification ™ Remarque : Pour la réalisation de cette procédure pour un traitement sur l’instrument KingFisher mL, mélanger les échantillons par aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument. 1. Suivre le protocole, de la préparation du broyat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution de lyse. Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons. 16 ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit ™ ™ ™ 2. Ajouter la MagMAX CORE Wash Solution 1, la MagMAX CORE Wash Solution 2 et le MagMAX CORE Elution Buffer aux positions indiquées, selon votre instrument. Tableau 9 Configuration de la plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits Échantillon A Deep Well Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution[1] Barrette de tubes séparée[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne H Deep Well [1] [2] Placer un peigne protecteur dans la plaque. S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution. Placée sur l’élément chauffant. Tableau 10 Configuration de la barrette de tubes : Instrument KingFisher™ mL ID de la position Position de la barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits Échantillon 1 Standard Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buffer 90 µl Peigne S.o. S.o. Glisser le peigne dans le support pour peigne. 3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6). 4. Démarrer le test, puis charger en même temps les plaques ou les barrettes de tubes préparées dans l’instrument. L’instrument ne vous invite pas à charger les éléments individuellement. Conserver l’acide nucléique purifié sur de la glace pour une utilisation immédiate, à –20°C pendant 1 mois au maximum ou à –80°C pour un stockage à long terme. Annexe B Documentation et support Assistance à la clientèle et support technique Visiter thermofisher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support. • Numéros de téléphone de contact internationaux • Informations sur le support produit – FAQ relatives aux produits – Logiciels, correctifs et mises à jour – Formations sur de nombreux instruments et applications • Commandes et assistance en ligne • Documentation produit – Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles – Certificats d’analyse – Fiches de données de sécurité (FDS) Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers. Garantie limitée du produit Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermofisher.com/support. ™ Guide complémentaire de VetMAX C. burnetii Feces Kit 17 Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils – Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – France Pour les descriptions des symboles sur les étiquettes et les documents du produit, consultez thermofisher.com/symbols-definition. Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis. CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ: DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT. Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0019383, révision B.0. Historique des révisions: Pub. n° MAN0019383 Révision Date B.0 20 octobre 2022 Description • Mise à jour de la quantité d’échantillon traité à la PK (voir “Traitement des échantillons avec la PK Solution” en page 7 et “Mélange des échantillons traités à la PK avec la solution de Lysis / Binding / Bead / IPC” en page 8). • Mise à jour de l’instruction de lyse et d’homogénéisation pour les lingettes ou pédichiffonnettes (voir “Lyse et homogénéisation des échantillons (lingettes ou pédichiffonnettes)” en page 10). • Suppression des protocoles du MagVet™ Universal Isolation Kit de ce document. A.0 18 août 2020 Nouveau document traduit à partir d’un document en français (MAN0008769 rév. B.0) avec les mises à jour suivantes : • Ajout du protocole du MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit. • Modifications mineures de la formulation et de la mise en page pour plus de cohérence avec les documents connexes. Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes les licences à usage limité. ©2022 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques commerciales sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire. QIAamp et QIAGEN sont des marques de QIAGEN GmbH. NucleoSpin est une marque de MACHEREY‑NAGEL. thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion thermofisher.com 20 octobre 2022 ">
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