Flux de travail de Real-Time Analysis
Génération du modèle
Enregistrement et extraction des intensités
Correction de la mise en phase
Définition des bases
Notation de la qualité
Établit les emplacements des amplifiats.
Enregistre l’emplacement de chaque amplifiat sur la Flow Cell et détermine une valeur d’intensité pour chaque amplifiat.
Corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase.
Détermine une définition des bases pour chaque amplifiat.
Attribue un score de qualité à chaque définition des bases.
Génération du modèle
La première étape du flux de travail RTA est la génération du modèle, qui définit la position de chaque amplifiat dans une plaque à l’aide des coordonnées X et Y.
La génération du modèle nécessite les données d’image des cinq premiers cycles de l’analyse. Une fois l’imagerie du dernier cycle de modèle d’une plaque réalisée, le modèle est généré.
REMARQUE
Pour détecter un amplifiat pendant la génération du modèle, il doit y avoir au moins une base autre que G dans les cinq premiers cycles.
Le modèle est utilisé comme référence pour l’étape suivante d’enregistrement et d’extraction des intensités. Les emplacements des amplifiats sur toute la Flow Cell sont
écrits dans les fichiers d’emplacement des amplifiats (*.locs), un pour chaque ligne.
Enregistrement et extraction des intensités
L’enregistrement et l’extraction des intensités débutent après la génération du modèle.
}
L’enregistrement aligne les images produites par chaque cycle d’imagerie selon le modèle.
} L’extraction d’intensité détermine une valeur d’intensité pour chaque amplifiat du modèle pour une image donnée.
S'il y a échec d’enregistrement de l'image d’un cycle, quelle qu'elle soit, aucune intensité n’est extraite et toutes les bases sont définies comme N pour cette plaque dans ce cycle.
Utilisez le logiciel Sequencing Analysis Viewer pour identifier les plaques et les cycles dont l’enregistrement a échoué. Les échecs d’enregistrement sont facilement identifiés, car la colonne P90 des plaques et des cycles indique 0 dans l’onglet Imaging (Imagerie).
Correction de la mise en phase
Lors de la réaction de séquençage, chaque brin d’ADN dans un amplifiat s’étend d’une base par cycle. La mise en phase et la mise en préphase ont lieu lorsqu’un brin se retrouve hors phase par rapport au cycle d’incorporation en cours.
} La mise en phase se produit lorsqu’un brin a un retard d’une base.
}
La mise en préphase se produit lorsqu’un brin a une avance d’une base.
70
Support nº 20002370
Document nº 1000000002695 v00 FRA
Figure 31 Mise en phase et en préphase
A Lecture avec une base présentant une mise en phase
B Lecture avec une base présentant une mise en préphase
RTA2 corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase. Ainsi, la qualité des données est optimisée à chaque cycle tout au long de l’analyse.
Définition des bases
La définition des bases détermine une base (A, C, G ou T) pour chaque amplifiat d’une plaque donnée d’un cycle spécifique. Le système MiniSeq utilise le séquençage à deux canaux, qui ne nécessite que deux images, l’une du canal rouge et l’autre du canal vert, pour coder les données de quatre bases d’ADN.
Les intensités extraites d’une image et sa comparaison avec une autre image donnent quatre populations distinctes, chacune correspondant à un nucléotide. Le processus de définition des bases détermine à quelle population appartient chaque amplifiat.
Figure 32 Visualisation de l’intensité des amplifiats
Tableau 1 Définition des bases dans le séquençage à deux canaux
Base
Canal rouge
Canal vert
Résultat
A 1
(allumé)
1
(allumé)
Amplifiats montrant une intensité tant dans le canal rouge que dans le canal vert.
C 1
(allumé)
0
(éteint)
Amplifiats montrant une intensité seulement dans le canal rouge.
G 0
(éteint)
0
(éteint)
Amplifiats ne montrant d’intensité dans aucun emplacement connu.
T 0
(éteint)
1
(allumé)
Amplifiats montrant une intensité seulement dans le canal vert.
Guide du système MiniSeq
71
Amplifiats passant le filtre
Au cours de l’analyse, RTA2 filtre les données brutes pour supprimer les amplifiats non conformes au seuil de qualité des données.
Dans le cas d’une analyse sur deux canaux, RTA2 utilise un système basé sur la population pour déterminer la pureté d’une définition de bases. Les amplifiats franchissent le filtre (PF) lorsqu’une seule définition de base au maximum présente une valeur de pureté inacceptable au cours des 25 premiers cycles. Les amplifiats qui ne franchissent pas le filtre ne servent pas à la définition des bases lors des cycles suivants.
Considérations relatives à l’indexage
Par rapport aux autres lectures, la définition des bases lors des lectures d’index s’effectue différemment.
Une lecture d’index doit contenir une base autre que G au moins dans l’un des deux premiers cycles. Si deux bases G sont définies au début d’une lecture d’index, aucune intensité de signal n’est générée. Il faut obtenir un signal dans l’un des deux premiers cycles pour assurer la performance de démultiplexage.
Pour accroître la robustesse de démultiplexage, sélectionnez à chaque cycle des séquences d’indexage qui fournissent un signal dans un canal au moins ou si possible dans les deux canaux. Suivez cette recommandation pour éviter les combinaisons d’index pouvant aboutir à l’obtention de bases G uniquement à n’importe quel cycle.
}
Canal rouge : A ou C
}
Canal vert : A ou T
Ce processus de définition des bases permet d’éviter les erreurs lors de l’analyse d’échantillons low-plex.
Notation de la qualité
Un score de qualité, ou Q-score, permet de prédire la probabilité d’une erreur dans la définition des bases. Un Q-score plus élevé signifie qu’une définition des bases est de meilleure qualité et a plus de chances d’être correcte.
Le score de qualité constitue un moyen simple de communiquer la probabilité de petites erreurs. Les scores de qualité sont représentés sous la forme Q(X), où X est le score. Le tableau suivant montre la relation entre le score de qualité et la probabilité d’erreurs.
Score de qualité Q(X)
Q40
Q30
Q20
Q10
Probabilité d’erreurs
0,0001 (1 sur 10 000)
0,001 (1 sur 1 000)
0,01 (1 sur 100)
0,1 (1 sur 10)
REMARQUE
La notation de la qualité s’appuie sur une version modifiée de l’algorithme Phred.
La notation de la qualité calcule un ensemble d’indicateurs prévisionnels pour chaque définition des bases, puis utilise ces valeurs pour rechercher un score de qualité dans un tableau de qualité. Les tableaux de qualité servent à fournir des indicateurs de qualité extrêmement précis pour des analyses générées par une configuration spécifique de plateforme de séquençage et de version de chimie.
Une fois le score de qualité établi, les résultats sont enregistrés dans des fichiers de définition des bases (*.bcl).
72
Support nº 20002370
Document nº 1000000002695 v00 FRA
Annexe C Fichiers et dossiers de sortie
Fichiers et dossiers de sortie
Fichiers de sortie de séquençage
Structure des dossiers de sortie de séquençage
Exigences relatives aux fichiers d’entrée de l’analyse
74
75
76
Guide du système MiniSeq
73
