Instrument MiSeqDx
Amplicon
Taille des inserts
Contenu génomique de l’amplicon
5
6
132
129
Délétion d’une base
Délétion d’une base
Nbre d’appels par
échantillon ayant été effectués
Nbre de bases appelées par
échantillon
131 131
128 128
Nbre d’aucunappel
Nbre d’appels corrects par
échantillon
0
0
131
128
Nbre d’appels incorrects
% d’appels corrects
0
0
100
100
Les données qui ressortent de ces études de précision confirment que la plateforme MiSeqDx peut séquencer avec précision les éléments suivants :
• Teneur en GC ≥ 19 % (toutes les bases des 135 amplicons séquencés qui avaient une teneur de 19 % en GC ont
été correctement appelées)
• Teneur en GC ≤ 72 % (toutes les bases des 135 amplicons séquencés qui avaient une teneur de 72 % en GC ont
été correctement appelées)
• Longueurs de PolyA ≤ 7 (la répétition PolyA de 7 nucléotides a été appelée correctement dans les
270 amplicons séquencés qui contenaient des PolyA = 7)
• Longueurs de PolyT ≤ 8 (la répétition PolyT de 8 nucléotides a été appelée correctement dans les 270 amplicons séquencés qui contenaient des PolyT = 8)
• Longueurs de PolyG ≤ 6 (la répétition PolyG de 6 nucléotides a été appelée correctement dans les
405 amplicons séquencés qui contenaient des PolyG = 6)
• Longueurs de PolyC ≤ 7 (la répétition PolyC de 7 nucléotides a été appelée correctement dans les 135 amplicons séquencés qui contenaient des PolyC = 7)
• Longueurs de répétition de dinucléotide ≤ 5x (toutes les bases des 135 amplicons séquencés qui avaient une répétition de dinucléotide de 5x ont été correctement appelées)
• Longueurs de répétition de trinucléotide ≤ 4x (toutes les bases des 810 amplicons séquencés qui avaient une répétition de trinucléotide de 4x ont été correctement appelées)
• Insertions de base 1 et suppression de 3 bases ou moins
— 2 des 3 insertions de base 1 testées ont été appelées correctement. Des appels corrects ont été effectués pour
2 insertions de base 1 dans des régions non homopolymères de 82 amplicons. Une insertion de base 1 n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur un chromosome 2 dans 135 amplicons.
— 3 suppressions de base 1 sur 4 ont été appelées correctement. Tous les appels corrects ont été effectués dans des régions non homopolymères de 4 amplicons. Une suppression de base 1 n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur un chromosome 9 dans 63 amplicons.
— Les suppressions de base 2 ont été appelées correctement dans un échantillon.
— Les suppressions de base 3 ont été appelées correctement dans 21 échantillons.
Reproductibilité
La reproductibilité de la plateforme MiSeqDx a été déterminée à l’aide de deux tests représentatifs.
Étude 1
Un test représentatif a été conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et contenant des exons potentiellement pertinents sur le plan clinique. L’étude a permis d’examiner 13 échantillons au cours de neuf analyses à l’aide de trois instruments MiSeqDx différents avec le concours de trois opérateurs distincts
(
ont été utilisés. Les 13 échantillons provenaient de deux parents et 11 enfants qui avaient été fréquemment séquencés par
Mars 2015 nº 15070068 Rév. A FRA
|
24
Instrument MiSeqDx plusieurs laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Deux échantillons ont été analysés en double exemplaire, donc chaque analyse a généré des résultats pour 15 échantillons.
Pour l’évaluation de la reproductibilité d’un lot à l’autre, 94 échantillons et deux contrôles sans modèle ont été testés dans l’ensemble des trois lots. Chaque lot a été scindé en deux analyses de 48 échantillons pour tester tous les réactifs et les combinaisons de primers d’index possibles. Toutes les analyses de séquençage ont été réalisées par un seul opérateur
).
Des appels corrects ont été déterminés pour les variants à simple nucléotide (SNV) en comparant les données de l’étude
à des renseignements de la référence bien caractérisée. Il n’y a eu aucun échec d’analyse ou répétition d’analyse pour l’étude de reproductibilité. Les tableaux suivants contiennent les résultats des études destinées à évaluer la reproductibilité du système.
25
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Tableau 5 Résultats de la reproductibilité d’instrument à instrument de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx (au niveau de l’amplicon)
MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé
1
Contenu génomique de l’amplicon
Nombre d’analyses d’échantillons
2
Nombre total d’aucunappels 3
Nombre total d’appels incorrects 4
% d’appels corrects 5
Nombre total d’aucunappels 3
Nombre total d’appels incorrects 4
% d’appels corrects 5
Nombre total d’aucunappels 3
Nombre total d’appels incorrects 4
% d’appels corrects 5
1
12
13
14
10
11
8
9
5
6
7
2
3
4
15
1
2
2
2
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
132
114
129
131
110
131
117
121
127
135
122
128
133
119
130
-
-
Poly T (5)
Poly A (14)
-
Poly A (5)
-
Poly A (5);
Poly T (5)
-
Poly C (5);
63 % de GC
-
Poly T (5)
Poly T (5)
Poly A (6)
Poly T (5);
Poly C (5)
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
27 8
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
99,54
100
100
100
100
100
100
100
100
100
23 6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
27 8
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
99,61 7
100
100
100
100
99,54
100
100
100
100
100
100
100
100
100
39 6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
27 8
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
99,34 7
100
100
100
100
99,54
100
100
100
100
100
100
100
100
100
26
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
18
19
16
17
20
21
22
23
24
25
26
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
130
117
136
131
123
117
119
120
129
133
135
Contenu génomique de l’amplicon
-
-
Poly T (5)
Poly T (5);
SNV
Poly A (5)
Poly A (6);
Poly T (5);
Région homologue sur un chromosome différent
-
Région homologue sur un chromosome différent
Poly T (5)
Poly C (7);
66 % de GC
Poly C (5);
69 % de GC
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
0
0
0
0
0
0
0
0
135
135
135
135
135
135
135
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
27
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
29
30
27
28
40
41
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
36
37
34
35
38
39
31
32
33
4
4
123
134
132
121
125
134
118
122
131
133
128
131
129
133
112
-
-
SNV
Poly A (5);
SNV
-
-
Poly T (5)
-
Poly A (5)
-
Poly T (6)
-
Poly A (5);
Poly T (5);
SNV
Poly T (5);
SNV
SNV
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
28
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
132
131
119
120
133
112
129
126
119
118
124
117
128
123
133
135
122
117
5
5
4
5
5
5
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
56
57
54
55
58
59
52
53
50
51
48
49
46
47
44
45
42
43
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Poly T (5)
Poly A (7)
Poly A (6)
Poly A (5)
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
29
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
71
72
69
70
73
74
5
5
5
5
5
5
5
5
5
66
67
64
65
62
63
60
61
68
7
7
7
7
7
7
112
120
120
115
112
135
131
121
132
133
120
135
126
134
122
-
-
-
Poly A (5)
CT(5)
SNV
Poly T (6)
63 % de GC
Poly A (6);
Poly T (8)
-
60 % de GC
-
-
Poly A (5);
59 % de GC
Poly C (5);
63 % de GC
135
135
135
135
135
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
135
135
135
135
135
135
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
30
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
75
87
88
85
86
89
90
82
83
84
79
80
81
76
77
78
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
9
9
127
123
125
133
116
135
118
136
131
119
122
123
127
129
130
116
67 % de GC
58 % de GC
Poly G (6);
61 % de GC
Poly T (5)
Poly A (6)
60 % de GC
57 % de GC
-
Poly T (5)
-
-
59 % de GC;
SNV
-
-
-
Poly A (5);
Poly T (5)
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
135 0 0
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
100 0
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
0 100
MiSeqDx 3
0
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
0 100
135
135
135
135
135
135
135
135
135
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100
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100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
31
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
119
121
117
114
129
114
122
127
133
138
Contenu génomique de l’amplicon
-
Région homologue sur un chromosome différent
-
Région homologue sur un chromosome différent
-
Poly A (14)
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SNV
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-
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MiSeqDx 1
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135
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99,22
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100
100
100
99,22
100
100
100
100
100
32
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
101
102
103
104
105
110
111
112
113
114
106
107
108
109
9
9
9
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9
9
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10
10
10
139
116
133
138
136
118
128
120
139
118
10 123
10 121
10 129
10 122
-
-
Poly A (5);
57 % de GC
57 % de GC
Poly C (5);
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70 % de GC
62 % de GC
60 % de GC
58 % de GC;
SNV
57 % de GC
-
Poly T (5)
-
26 % de GC
135
135
135
MiSeqDx 1
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100
100
MiSeqDx 2
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MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
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100
100
100
100
33
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
10
10
10
10
10
10
11
11
124
135
135
119
125
131
10 117
10 116
10 129
11 117
117
113
Contenu génomique de l’amplicon
-
-
Poly C (5);
SNV
-
-
58 % de GC
Poly T (10)
Poly T (5)
Poly A (5)
Poly T (5);
Région homologue sur un chromosome différent
CA (4)
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Région homologue sur un chromosome différent
MiSeqDx 1
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4
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MiSeqDx 2
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3
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4
% d’appels corrects
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Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
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135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
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100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
34
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
131
132
133
134
127
128
129
130
135
136
137
138
139
140
141
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
12
12
129
121
123
127
136
132
115
117
134
131
133
137
131
131
128 -
-
-
Poly T (5)
Poly A (6)
Poly T (6)
Poly T (5)
-
Poly T (8);
19 % de GC
Poly A (5);
Poly T (5)
Poly A (5)
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Poly T (8);
SNV
-
Poly A (5)
135
135
135
135
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
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3
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100
100
100
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
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100
100
100
100
100
100
135
135
135
135
135
135
135
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100
100
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100
100
100
100
100
100
100
35
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
152
153
154
155
156
157
158
146
147
148
149
142
143
144
145
150
151
12
12
12
12
13
13
13
13
13
13
13
133
136
124
122
122
116
133
117
124
123
115
13 125
13 121
13 123
13 114
13 119
14 122
-
-
-
-
Poly A (5)
59 % de GC
Poly C (5)
SNV
Poly T (6)
Poly T (5);
26 % de GC
Poly A (5)
-
-
-
-
-
58 % de GC
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
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MiSeqDx 2
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135
135
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135
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100
100
100
100
100
100
100
36
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
Contenu génomique de l’amplicon
166
167
168
163
164
165
159
160
161
162
169
170
171
172
173
16
16
16
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
122
121
123
119
119
135
116
123
116
118
129
131
127
17 118
17 138
-
-
-
-
Poly C (5)
61 % de GC
Poly C (6);
60 % de GC;
SNV
-
62 % de GC
Poly C (5);
65 % de GC
-
Poly G (6);
67 % de GC;
SNV
61 % de GC
Poly C (5)
61 % de GC
135
135
135
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
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0
0
0
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0
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100
100
100
100
100
100
100
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
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5
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100
135
135
135
135
135
135
135
135
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0
100
100
100
100
100
100
100
100
37
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
178
179
180
181
174
175
176
177
182
183
184
185
186
17
18
18
18
18
18
18
18
18
19
19
131
112
124
134
129
133
118
114
118
122
139
19 131
19 141
Contenu génomique de l’amplicon
-
58 % de GC
-
Poly A (6)
-
-
-
60 % de GC
-
Poly G (6);
66 % de GC
64 % de GC
67 % de GC
59 % de GC;
Région homologue sur un chromosome différent
135
135
135
135
135
135
135
135
135
135
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
MiSeqDx 3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
135
135
135
0
0
0
0
0
0
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
100
100
0
0
0
0
0
0
100
100
100
38
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon Chr.
Taille du fragment analysé 1
187
188
189
190
191
192
193
194
195
19
19
19
121
138
123
19 138
20 117
22 136
22 122
22
22
122
119
Contenu génomique de l’amplicon
Poly C (5);
72 % de GC;
Région homologue sur un chromosome différent
58 % de GC
64 % de GC
-
Poly T (5)
Poly A (7)
Poly A (5);
Poly C (5)
62 % de GC;
SNV
66 % de GC
MiSeqDx 1
Nombre d’analyses d’échantillons 2
Nombre total d’aucunappels
3
Nombre total d’appels incorrects
4
135 0 0
MiSeqDx 2
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
100 0
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
Nombre total d’aucunappels
3
0 100
MiSeqDx 3
0
Nombre total d’appels incorrects
4
% d’appels corrects
5
0 100
135
135
135
135
135
135
135
135
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
1
2
S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible.
Le nombre d’échantillons est calculé à partir de 9 analyses de 15 échantillons (11 échantillons analysés une fois et 2 échantillons analysés deux fois).
3 Le nombre total d’aucun-appels est le nombre total d’aucun-appels obtenu pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx spécifié.
4 Le nombre total d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects obtenus pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx
5 spécifié.
Le pourcentage (%) d’appels corrects correspond au taux d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur la base de données de référence bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence d’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons doivent avoir un indel et d’autres non, par exemple l’amplicon 9.
39
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
6
L’amplicon 1 possédait un certain nombre de bases dont le génotype ne pouvait pas être appelé : 12 bases, dans une analyse sur neuf dans NA12881; une base, dans deux analyses sur neuf, et trois bases, dans une analyse sur neuf dans NA12886; 20 bases, dans une analyse sur neuf, et 26 bases, dans une analyse sur neuf dans NA12888. Cela est dû à la faible
7
8 couverture dans les bases sans aucun appel dans ces analyses, où la profondeur moyenne de séquençage était de 33,2, avec un minimum de 21 et un maximum de 52.
Lorsque le nombre d’aucun-appels n’est pas inclus dans le calcul, le taux d’appels corrects est de 100 %.
L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les renseignements de référence bien caractérisée pour 7 des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 7 échantillons, cette suppression de paire de bases s'appelle un faux négatif et est appelée ainsi de façon
9 reproductible dans les neuf analyses.
L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de renseignements de référence bien caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion d'une paire de bases n'est pas appelée de façon reproductible à 100 % (c.-à-d. qu'il s’agit d’un faux négatif).
40
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Les résultats de l’étude 1 de reproductibilité pour chaque échantillon sont présentés pour l’ensemble des neuf analyses en une seule colonne. Les résultats affichés portent uniquement sur les variants à simple nucléotide et les résultats des insertions/délétions par rapport à la séquence de la base de données de référence pour les trois analyses réalisées sur trois instruments. Cette analyse a montré que les résultats des variants étaient reproductibles dans neuf analyses pour ces
échantillons.
11
12
9
10
13
7
8
5
6
3
4
1
2
Tableau 6 Résumé des résultats de reproductibilité de la plateforme MiSeqDx pour 13 échantillons bien caractérisés
Nº d’ADN
Identifiant de l’échantillon d’ADN
Nombre d’analyses par échantillon
Nombre de SNV
Variants à simple nucléotide (SNV)
Nombre de bases appelées correctement
Nombre de faux positifs 1
Nombre de faux négatifs 2
Nombre d’indels
Insertions/délétions (indels)
Nombre de bases appelées correctement
Nombre de faux positifs 1
Nombre de faux négatifs 2
NA12877 3
NA12878 3
NA12879
NA12880
NA12881
NA12882
NA12883
NA12884
NA12885
NA12886
NA12887
NA12888
NA12893
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
18
18
18
22
17
19
17
22
19
19
15
18
17
16
17
18
22
17
19
17
22
19
19
15
18
17
16
17
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
1
2
2
3
3
2
2
3
1
2
3
3
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
2
2
2
1
1
2
1
1
2
2
2
1 Faux positif = variant appelé par l’analyse de séquençage MiSeqDx, mais ne figurant pas dans la base de données de référence.
2
3
Faux négatif = variant figurant dans la base de données de référence, mais non appelé au cours de l’analyse de séquençage MiSeqDx.
Les échantillons NA12877 et NA12878 ont été analysés deux fois. Les échantillons répliqués ont généré des résultats identiques.
41
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Étude 2
Une étude de reproductibilité de site à site a été effectuée avec un test représentatif, le test de la fibrose kystique à 139 variants Illumina MiSeqDx, incluant un sous-ensemble de variations du gène CFTR pertinentes d’un point de vue clinique analysées avec le logiciel MiSeq Reporter à l’aide de la plateforme de flux de travail de séquençage d’ADN ciblé MiSeqDx. L’étude en aveugle a été réalisée sur trois sites d’essais et a nécessité deux opérateurs sur chaque site. Deux panels bien caractérisés de 46 échantillons chacun ont été analysés par chacun des opérateurs sur chaque site pour un total de 810 appels par site. Les panels contenaient un mélange d’ADN génomique issu des lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR, ainsi que du sang déleucocyté enrichi de lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR. Les échantillons de sang ont été fournis pour permettre l’incorporation des étapes d’extraction utilisées dans la préparation d’ADNg qui sert d’entrée primaire pour le flux de travail du test. Le débit de passage des échantillons, défini comme le nombre d’échantillons passant les métriques QC lors de la première tentative, était de 99,88 %. Tous les résultats des tests sont basés sur un test initial.
Tableau 7 Résumé des résultats de l’étude de reproductibilité réalisée avec un test représentatif de la fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx.
Panel
N° d’échantillon
Génotype de l’échantillon
Variants
Nombre total d’appels par site
Appels concordants positifs (variants)
Appels concordants négatifs (de type sauvage)
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
N° de ratés de typage
Nbre d’aucunappels
Concordance positive (%)
Concordance négative (%)
Concordance globale (%)
A
A
1
2
810
810
6
6
6
6
6
6
804
804
804
804
804
804
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
A
A
A
A
A
A
3
4 1
5 2
6
7
8
S549N (HET)
1812-1 G > A
(HET)
Q493X/F508del
(HET)
F508del/2184delA
(HET)
Y122X/R1158X
(HET)
F508del/2183AA >
G (HET)
R75X (HET)
I507del/F508del
(HET)
810
810
810
810
810
810
12
12
12
12
6
12
12
12
10
12
6
12
12
12
12
12
6
12
798
797
798
798
804
798
798
798
665
798
804
798
798
798
798
798
804
798
0
0
0
0
0
0
0
1 1
135 2
0
0
0
100
100
94,44
100
100
100
100
100
94,44
100
100
100
100
100
94,44
100
100
100
42
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
N° d’échantillon
Génotype de l’échantillon
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
9 3
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
3
Variants
F508del/W1282X
(HET)
F508del/3272-26A
> G (HET)
F508del/3849 +
10kbC > T (HET)
621 + 1G > T/3120 +
1G > A (HET)
810
810
810
810
E60X/F508del
(HET)
M1101K (HET)
M1101K (HOM)
F508del (HOM)
F508del/3659delC
(HET)
R117H/F508del
(HET)
621 + 1 G > T / 711
+ 1G > T (HET)
G85E/621 + 1G > T
(HET)
A455E/F508del
(HET)
810
810
810
I506V, I507V,
F508C absents
828
810
(TG)10(T)9/
(TG)12(T)5
816
810
810
810
Nombre total d’appels par site
Appels concordants positifs (variants)
Appels concordants négatifs (de type sauvage)
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
N° de ratés de typage
Nbre d’aucunappels
12 11 12 798 797 798 2 3 0
12
12
12
12
6
6
6
12
18
12
12
12
11
12
12
12
6
6
6
12
18
12
12
12
12
12
12
12
6
6
6
12
18
12
12
12
798
798
798
798
804
804
822
798
798
798
798
798
797
798
798
798
804
804
822
798
798
798
798
798
798
798
798
798
804
804
822
798
798
798
798
798
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Concordance positive (%)
Concordance négative (%)
Concordance globale (%)
97,22
97,22
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
99,96
99,96
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
99,92
99,92
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
43
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
A
A
A
29
30
31
A
A
32
33
A
A
A
34
35
36
A 22
A 23
A
A
A
A
26
27
24
25
A 28
Panel
N° d’échantillon
Génotype de l’échantillon
F508del/R560T
(HET)
F508del/Y1092X (C
> A) (HET)
N1303K (HET)
G542X (HOM)
G542X (HET)
G551D/R553X
(HET)
3849 + 10kbC > T
(HOM)
WT
F508del (HET)
1717-1G > A
(HET)
R1162X (HET)
R347P/G551D
(HET)
R334W (HET)
WT
G85E (HET)
Variants
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
Nombre total d’appels par site
Appels concordants positifs (variants)
Appels concordants négatifs (de type sauvage)
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
N° de ratés de typage
Nbre d’aucunappels
810 12 12 12 798 798 798 0 0
Concordance positive (%)
Concordance négative (%)
Concordance globale (%)
100 100 100
12 12 12 798 798 798 0
6
12
6
6
6
6
12
6
6
6
6
6
6
12
6
804
804
804
798
804
804
804
804
798
804
804
804
804
798
804
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
6
6
0
6
6
0
6
6
810
804
804
810
804
804
810
804
804
0
0
0
6
12
6
12
6
12
804
798
804
798
804
798
0
0
6
0
6
6
0
6
6
0
6
804
810
804
804
810
804
804
810
804
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 s.o.
100
100
100
100
100 s.o.
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
44
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
N° d’échantillon
Génotype de l’échantillon
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
Variants
I336K (HET)
WT
F508del/3849 +
10kbC > T (HET)
621 + 1G > T/3120 +
1G > A (HET)
F508del/3659delC
(HET)
R117H/F508del
(HET)
G85E/621 + 1G > T
(HET)
A455E/F508del
(HET)
N1303K (HET)
(TG)10(T)9/
(TG)12(T)5
G551D/R553X
(HET)
2789 + 5G > A
(HOM)
CFTR dele2,
3/F508del (HET)
F508del/1898 + 1G
> A (HET)
Nombre total d’appels par site
Appels concordants positifs (variants)
Appels concordants négatifs (de type sauvage)
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
N° de ratés de typage
Nbre d’aucunappels
810
810
810
6
0
12
6
0
12
6
0
12
804
810
798
804
810
798
804
810
798
0
0
0
0
0
0
810
810
816
810
810
810
810
810
810
810
12
12
18
12
12
6
12
6
12
12
12
12
18
12
12
6
12
6
12
12
12
12
18
12
12
6
12
6
12
12
798
798
798
798
798
804
798
804
798
798
798
798
798
798
798
804
798
804
798
798
798
798
798
798
798
804
798
804
798
798
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Concordance positive (%)
Concordance négative (%)
Concordance globale (%)
100 s.o.
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
45
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
B
B
50
51
65
66
63
64
61
62
59
60
57
58
55
56
52
53
54
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Panel
N° d’échantillon
Génotype de l’échantillon
WT
F508del/2143delT
(HET)
3876delA (HET)
3905insT (HET)
394delTT (HET)
F508del (HET)
WT
WT
F508del (HET)
WT
L206W (HET)
WT
G330X (HET)
WT
R347H (HET)
1078delT (HET)
G178R/F508del
(HET)
Variants
Nombre total d’appels par site
Appels concordants positifs (variants)
Appels concordants négatifs (de type sauvage)
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
N° de ratés de typage
Nbre d’aucunappels
810
810
0
12
0
12
0
12
810
798
810
798
810
798
0
0
0
0
Concordance positive (%)
Concordance négative (%)
Concordance globale (%)
s.o.
100
100
100
100
100
6
12
0
6
0
6
0
6
0
6
6
0
6
6
6
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
6
12
0
6
0
6
0
6
0
6
6
0
6
6
6
6
12
0
6
0
6
0
6
0
6
6
0
6
6
6
804
804
804
804
810
810
804
810
804
810
804
810
804
804
798
804
804
804
804
810
810
804
810
804
810
804
810
804
804
798
804
804
804
804
810
810
804
810
804
810
804
810
804
804
798
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 s.o.
100
100
100 s.o.
100 s.o.
100
100 s.o.
s.o.
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
46
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
B 67
B
B
B
B
70
71
68
69
B 72
4
B
B
B
B
B
73
74
75 2
76
77
B 78
B
B
79
80
Panel
N° d’échantillon
Génotype de l’échantillon
S549R (c.1647T >
G) (HET)
S549N (HET)
W846X (HET)
WT
E92X/F508del
(HET)
621 + 1G >
T/1154insTC
(HET)
G542X (HET)
F508del (HET)
F508del (HET)
F508del (HET)
621 + 1G >
T/A455E (HET)
1812-1 G > A
(HET)
WT
F508del/R553X
(HET)
Variants
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
810
Nombre total d’appels par site
Appels concordants positifs (variants)
Appels concordants négatifs (de type sauvage)
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
N° de ratés de typage
Nbre d’aucunappels
810 6 6 6 804 804 804 0 0
Concordance positive (%)
Concordance négative (%)
Concordance globale (%)
100 100 100
0
12
6
6
0
12
6
6
0
12
6
6
804
804
810
798
804
804
810
798
804
804
810
798
0
0
0
0
12 12 12 798 798 797 0
0
0
0
0
1
4
100
100 s.o.
100
100
100
100
100
100
99,96
100
100
100
100
99,96
6
6
12
6
6
5
6
12
6
6
6
6
12
6
6
6 6 6
804
804
804
804
798
804
804
670
804
798
804
804
804
804
798
0
0
0
0
0
804 804 804 0
0
12
0
12
0
12
810
798
810
798
810
798
0
0
0
0
135 2
0
0
0
0
0
100
100
94,44
100
100
100 s.o.
100
100
100
94,44
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
94,44
100
100
47
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
N° d’échantillon
Génotype de l’échantillon
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
81
82
83
84
85
86
87
88
89
B
Total
92
90
91
4
Variants
F508del/G551D
(HET)
R347P/F508del
(HET)
R117H/F508del
(HET)
I507del (HET)
2789 + 5G > A
(HOM)
CFTR dele2,
3/F508del (HET)
F508del/1898 + 1G
> A (HET)
WT
F508del/2143delT
(HET)
3905insT (HET)
394delTT (HET)
F508del (HET)
(TG)10(T)9/
(TG)12(T)5
Nombre total d’appels par site
Appels concordants positifs (variants)
Appels concordants négatifs (de type sauvage)
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
N° de ratés de typage
Nbre d’aucunappels
810 12 12 12 798 798 798 0 0
Concordance positive (%)
Concordance négative (%)
Concordance globale (%)
100 100 100
810
816
810
810
810
810
810
810
810
810
810
74 556
12
18
6
6
12
12
0
12
6
6
6
2209
12
18
6
6
12
12
0
12
6
6
6
12
18
6
6
12
12
0
12
6
6
6
798
798
804
804
798
798
810
798
804
804
804
221 182
798
798
804
804
797
798
810
798
804
804
804
798
798
804
804
798
798
810
798
804
804
804
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
4
273
100
100
100
100
100
100 s.o.
100
100
100
100
99,77
100
100
100
100
99,96
100
100
100
100
100
100
99,88
100
100
100
100
99,96
100
100
100
100
100
100
99,88
1
2
L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant N1303K pour un réplicat, n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.
Un réplicat des échantillons 5 et 75 avait un débit d’appel de 0 %. Le complément d’enquête indique que des échantillons pourraient ne pas avoir été ajoutés à la plaque d’échantillon
3
4 avant la préparation de la librairie, car les volumes d’échantillon restants dans les tubes ne correspondaient à aucun volume ayant été supprimé.
Des preuves indiquent que les échantillons 9 et 10 ont vraisemblablement été échangés par l’opérateur avant la préparation de la librairie.
L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant M1V pour un réplicat de chacun des deux échantillons n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.
48
| nº 15070068 Rév. A FRA
Mars 2015
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