Trousse universelle MiSeqDx 1.0
10 Les pratiques de laboratoire appropriées et la bonne hygiène du laboratoire sont nécessaires pour empêcher les produits PCR de contaminer les réactifs, les instruments et les échantillons d’ADN génomique. La contamination par des produits PCR peut causer des résultats erronés et non fiables.
11 Pour éviter la contamination, veillez à ce que les zones de préamplification et de post-amplification possèdent un équipement réservé (p. ex. pipettes, pointes de pipette, agitateur vortex et centrifugeuse).
12 Évitez la contamination croisée. Utilisez des nouvelles pointes de pipette entre les échantillons et entre les réactifs distribués. Mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette et centrifugez la plaque lorsque cela est indiqué. N’agitez pas les plaques. L’utilisation des pointes résistantes à l’aérosol réduit le risque de rétention d’amplicons et de contamination croisée d’un échantillon à l’autre.
13 Une paire index-échantillon doit correspondre exactement à la feuille d’échantillons. Les inadéquations entre la feuille d’échantillons et le schéma de la plaque entraîneront une perte de l’identification positive des
échantillons et un rapport de résultats incorrect.
14 Préparez toujours une nouvelle solution d’éthanol à 80 % pour les étapes de lavage. L’éthanol peut absorber l’eau présente dans l’air, ce qui affecte les résultats.
15 Veillez à ce que tout l’éthanol soit retiré du bas des puits pendant les étapes de lavage. Des résidus d’éthanol pourraient affecter les résultats.
16 Respectez le temps de séchage indiqué après l’étape du support magnétique pour assurer une évaporation totale. L’éthanol résiduel peut modifier les performances des réactions ultérieures.
17 Ne mélangez pas le pool d’oligos personnalisé et le Tampon d’hybridation lors du stockage. Lorsque combiné, le pool d’oligos personnalisé devient instable, même lorsqu’il est conservé congelé.
18 L’utilisation des thermocycleurs à refroidissement actif (p. ex, le refroidissement thermoélectrique, Peltier) n’est pas recommandée pour l’étape d’hybridation. L’étape de refroidissement passif est essentielle pour une hybridation adéquate.
19 Ajoutez toujours le Polymérase PCR au Mélange maître PCR juste avant l’utilisation. Ne conservez jamais la solution de travail combinée.
20 Durant l’étape de normalisation de la librairie, il est extrêmement important de resuspendre complètement le culot des billes de la librairie. Cette étape est essentielle pour obtenir une densité consistante des amplifiats sur la Flow Cell MiSeqDx.
21 Respectez les temps d’incubation indiqués dans l’étape de normalisation de la librairie. Une incubation inappropriée peut affecter la représentation de la librairie et la densité des amplifiats.
22 En raison du nombre de transferts de plaque et du risque subséquent de contamination, faites preuve d’extrême prudence pour vous assurer que le contenu du puits reste entièrement dans le puits. N’éclaboussez pas le contenu.
23 La recommandation en matière d’entrée d’ADN de 250 ng permet la variation de quantité d’ADN; la performance de la trousse dépend de ce niveau d’entrée.
Notes procédurales
1 Illumina exige qu’un échantillon d’ADN à contrôle positif et un à contrôle négatif (NTC ou contrôle sans modèle) soient inclus dans chaque analyse qui est définie comme une série d’échantillons traités en parallèle.
L’échantillon d’ADN de contrôle positif doit être un échantillon bien caractérisé avec une variation connue dans la région d’intérêt.
2 Avant de commencer le protocole de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, extrayez et quantifiez l’ADN.
3 Toute méthode d’extraction d’ADN validée peut être utilisée.
4 Quantifiez l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Vérifiez que le A260/A280 de l’échantillon d’ADN est > 1,5.
Normalisez l’échantillon d’ADN sur 50 ng/µl. Chaque échantillon nécessite 5 µl d’ADN génomique (250 ng au total).
Débit d’échantillons et représentation d’index
Pour la Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0, le débit d’échantillons par analyse MiSeqDx peut être de 8 à
48 échantillons. Les primers d’indexage utilisés pendant l’amplification par PCR doivent être choisis en fonction du débit d’échantillons final souhaité pour assurer la diversité dans la séquence d’indexage.
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Référence 15039608, rév. B FRA
Février 2015
Trousse universelle MiSeqDx 1.0
REMARQUE
Pour une efficacité maximale du débit, procédez à la préparation de la librairie pour 96 échantillons au plus, puis répartissez les échantillons en deux analyses de séquençage avec un maximum de 48 échantillons par analyse. Créez des feuilles d’échantillons distinctes pour chaque ensemble de 48 échantillons, car le MiSeqDx ne peut séquencer que
48 échantillons à la fois.
MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour séquencer des bases G/T et un voyant DEL rouge pour séquencer des bases
A/C. À chaque cycle, au moins un des deux nucléotides de chaque canal de couleur doit être lu pour assurer l’enregistrement approprié. Il est important de maintenir l’équilibrage des couleurs pour chaque base de la lecture d’index en cours de séquençage, sinon un échec de l’enregistrement pourrait se produire lors du séquençage de la lecture d’index.
Consultez le
Tableau 10
pour choisir des combinaisons de primers d’index pour des analyses de 48 ou 96 échantillons.
Tableau 10 Combinaisons de primers d’index pour des analyses de séquençage avec 48 ou 96 échantillons
Rangées A à H Colonnes 1 à 6 Colonnes 7 à 12
Primer d’index A (A501)
Primer d’index B (A502)
Primer d’index C (A503)
Primer d’index D (A504)
Primer d’index E (A505)
Primer d’index F (A506)
Primer d’index G (A507)
Primer d’index H (A508)
Primer d’index 1 (A701)
Primer d’index 2 (A702)
Primer d’index 3 (A703)
Primer d’index 4 (A704)
--
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Primer d’index 5 (A705)
Primer d’index 10 (A710)
Primer d’index 6 (A706)
Primer d’index 7 (A707)
Primer d’index 8 (A708)
Primer d’index 9 (A709)
--
--
Primer d’index 11 (A711)
Primer d’index 12 (A712)
Si le séquençage est inférieur à 48 échantillons dans une analyse de séquençage, sélectionnez les index appropriés sur la base de leurs séquences pour maintenir l’équilibrage des couleurs dans les canaux verts et rouges. Consultez le
Tableau 12
et le
Tableau 13
. Au minimum, les analyses avec 8 à 48 échantillons doivent comprendre des combinaisons de primers d’indexage identifiées dans
Tableau 11
.
Pour effectuer avec précision des analyses plus petites, au moins huit échantillons doivent être présents. Si six échantillons uniques (à l’exclusion des contrôles positifs et négatifs) ne sont pas disponibles, il convient d’effectuer l’analyse avec les réplicats d’échantillon ou n’importe quel échantillon d’ADN génomique humain. Consultez le
Tableau 11
pour connaître le jeu d’index d’équilibrage des couleurs minimal à utiliser pour les analyses de séquençage
à huit échantillons.
Tableau 11 Combinaisons de primers d’index pour des analyses de séquençage avec huit échantillons
Primer d’index 1 (A701) Primer d’index 2 (A702) Primer d’index 10 (A710)
Primer d’index C (A503)
Primer d’index D (A504)
Primer d’index E (A505)
Échantillon 1
Échantillon 4
Échantillon 7
Échantillon 2
Échantillon 5
Échantillon 8
Échantillon 3
Échantillon 6
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Séquences de primers d’index
Tableau 12 Séquences de Primers d’index A (A501) - H (A508)
Primer d’indexage Séquence
Primer d’index A (A501)
Primer d’index B (A502)
Primer d’index C (A503)
Primer d’index D (A504)
TGAACCTT
TGCTAAGT
TGTTCTCT
TAAGACAC
Février 2015
Référence 15039608, rév. B FRA
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