Trousse universelle MiSeqDx 1.0
Réactifs nécessaires, non fournis
Pool d’oligos personnalisé
Les oligonucléotides spécifiques au primer sont conçus pour être développés par l’utilisateur et ne sont pas inclus dans la trousse de préparation de la librairie. La
Figure 1
illustre le principe de conception de l’oligo personnalisé. La conception de l’oligo doit respecter les exigences suivantes :
• Une paire d’oligonucléotides personnalisés doit être conçue pour chaque amplicon : une sonde personnalisée 1
(oligonucléotide spécifique aux loci en amont [ULSO]) et une sonde personnalisée 2 (oligonucléotide spécifique aux loci en aval [DLSO]).
• Les oligos personnalisés doivent entourer la région d’intérêt. Celle-ci peut comporter entre 150 et 250 bp pour permettre un séquençage complet du fragment à l’aide de la trousse 2 × 150.
• Les deux oligonucléotides doivent s’hybrider avec le même brin d’ADN.
• Les oligos personnalisés doivent contenir les adaptateurs propres à Illumina pour permettre l’ajout d’index ainsi que des adaptateurs de séquençage par PCR.
— L’adaptateur 1 (5’- CAACGATCGTCGAAATTCGC-3’) doit être situé à l’extrémité 5’ de la sonde personnalisée 1 (ULSO).
— L’adaptateur 2 (5’- AGATCGGAAGAGCGTCGTGTA-3’) doit être situé à l’extrémité 3’ de la sonde personnalisée 2 (ULSO).
• La sonde personnalisée 2 (DLSO) est phosphorylée à l’extrémité 5’ pour prendre en charge l’étape de ligation après l’extension de la sonde personnalisée 1 (ULSO).
Figure 1 Conception de l’oligo pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0
• Les paramètres de conception de l’oligo suivants sont recommandés :
— Longueur de la sonde comprise entre 22 et 30 nucléotides (région spécifique aux gènes).
— Taille totale de l’amplicon comprise entre 190 et 290 paires de bases, adaptateurs compris.
— La teneur en GC recommandée du primer doit être comprise entre 25 et 70 %.
— Plage de fusion recommandée entre 55 et 70 °C.
— La concentration du primer doit être de 15 nM par oligo dans le pool personnalisé.
— Aucune purification supplémentaire de l’oligo n’est nécessaire à l’issue de la synthèse. Un dessalage est recommandé.
— Les oligos peuvent être dilués dans le tampon TE.
— Le nombre d’amplicons par échantillon doit être compris entre 16 et 384.
— Concevez les primers de manière à laisser des bases supplémentaires entre l’extrémité du primer et la région d’intérêt, pour permettre la détection des insertions et des délétions aux extrémités des régions d’intérêt (voir l’élément
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des
Limites de la procédure à la page 2 ).
— Si la totalité d’une région d’intérêt doit être recouverte de plaques, la région de chevauchement de la région cible située entre les sites de liaison pour les sondes adjacentes doit être de 1 pb plus grande que la taille de la délétion à détecter. Par exemple, pour permettre la détection de délétions de 3 pb, la région de chevauchement entre les sondes adjacentes doit être > 4 bp. Les sondes adjacentes doivent être conçues de sorte à alterner les brins afin d’éviter les interférences.
— La couverture minimale recommandée par amplicon requise pour un appel de variants est de 75×.
Le nombre d’échantillons par analyse doit être calculé en fonction de la couverture minimale recommandée. Il dépendra de l’uniformité de la couverture du pool d’oligos personnalisé.
Février 2015
Référence 15039608, rév. B FRA
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