Trousse universelle MiSeqDx 1.0
Séquençage
La chimie SBS utilise une méthode basée sur des terminateurs réversibles pour détecter les bases à simple nucléotide à mesure qu’elles sont intégrées aux brins d’ADN croissants. Pendant chaque cycle de séquençage, un seul triphosphate de déoxynucléotide (dNTP) marqué par fluorescence est ajouté à la chaîne d’acide nucléique. Le marquage du nucléotide sert de terminateur pour la polymérisation. Ainsi, après chaque incorporation de dNTP, le marqueur fluorescent est imagé pour identifier la base, puis enzymatiquement clivée pour permettre l’incorporation du nucléotide suivant. Étant donné que les quatre dNTP liés à des terminateurs réversibles (A, G, T, C) sont tous présents comme molécules seules et séparées, la compétition naturelle minimise le biais lié à l’incorporation. Les définitions des bases sont effectuées directement à partir des mesures d’intensité de signal pendant chaque cycle de séquençage. Le résultat final est le séquençage base par base.
Analyse
Le logiciel intégré Real-Time Analysis (RTA) exécute les analyses d’images et la définition des bases, et affecte également un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Une fois l’analyse primaire terminée, le logiciel
MiSeq Reporter sur l’instrument MiSeqDx lance une analyse secondaire. MiSeq Reporter traite les définitions de base générées pendant l’analyse primaire et fournit des renseignements sur chaque échantillon en fonction des renseignements indiqués dans la feuille d’échantillons. L’analyse secondaire comprend le démultiplexage, la génération de fichier
FASTQ, l’alignement, la définition de variant et la génération des fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants trouvés dans des positions spécifiques d’un génome de référence.
Limites de la procédure
1 Destiné au diagnostic in vitro.
2 Ce produit présente les limites suivantes :
— Sortie de séquençage > 1 Go
— Lectures > 3 millions
— Longueur de lecture (en analyse à lecture appariée) 2 × 150 bp
— Bases supérieures à Q30 > 75 % (plus de 75 % des bases ont un score de qualité Phred supérieur à 30, indiquant une précision de définition des bases supérieure à 99,9 %)
3 Le système a été validé pour la détection des SNV et des délétions de trois bases maximum. L’évaluation des insertions d’une base a été limitée à trois insertions différentes sur trois chromosomes distincts.
4 Le système rencontre des problèmes de détection des insertions ou délétions d’une base dans les tronçons homopolymères (p. ex. le polyA).
5 Toutes les insertions/délétions sont alignées à gauche dans les régions homopolymériques ou alignées à droite suivant la nomenclature HGVS. Par exemple, le variant c.313delA (avec le contexte de séquence GAATC) est identifié comme une délétion G-ATC, mais la délétion est signalée dans dbSNP en tant que délétion GA-TC.
6 Le test ne peut pas détecter les insertions et les délétions si celles-ci se produisent à un emplacement directement adjacent à un primer et s’il n’y a pas d’amplicon de chevauchement. Pour les régions contenant des amplicons de chevauchement, le test ne peut pas détecter des délétions lorsque la zone de chevauchement est plus petite que la délétion à détecter. Par exemple, si la zone de chevauchement entre deux amplicons adjacents est de deux bases, le test ne peut détecter aucune délétion incluant ces deux bases. Une délétion de base unique au niveau de ces bases peut être détectée.
7 Pour les variants complexes où une délétion et une insertion se produisent sur le même site, le test peut rapporter cela comme deux variants à proximité immédiate l’un de l’autre. La mise en phase des variants n’est pas évaluée et il est impératif d’envisager d’autres solutions possibles pour la séquence détectée. Consultez le
Tableau 1
pour voir un exemple de variant complexe de cette nature.
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Référence 15039608, rév. B FRA
Février 2015
