Trousse universelle 1.0 MiSeqDx
MD
DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT
Nº de référence DX-103-1001 : deux analyses, jusqu’à 96 échantillons par trousse
Utilisation prévue
La Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0 est un ensemble de réactifs et de consommables utilisé à la fois dans le traitement d’échantillons d’ADN génomique humain provenant de sang total périphérique et dans le séquençage ciblé ultérieur des librairies d’échantillons qui en découlent. Les réactifs spécifiques aux analytes fournis par l’utilisateur sont nécessaires pour la préparation des librairies ciblant des régions génomiques d’intérêt spécifiques. La Trousse universelle MiSeqDx 1.0 est destinée à être utilisée avec l’instrument MiSeqDx.
Principes procéduraux
La plateforme MiSeqDx d’Illumina, composée de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0 et de l’instrument MiSeqDx, est conçue pour le séquençage ciblé d’ADN génomique humain d’après des échantillons de sang total périphérique. À l’aide de réactifs contenus dans la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, l’ADN génomique est traité à travers les étapes de préparation de la librairie, qui amplifient spécifiquement les régions génomiques prévues de chaque échantillon en utilisant les oligonucléotides personnalisés conçus par l’utilisateur, tout en ajoutant les index et les séquences de saisie de Flow Cells pour les produits amplifiés. Les librairies d’échantillons obtenues sont prêtes pour le séquençage sur l’instrument MiSeqDx d’Illumina.
L’utilisation de la Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0 comporte trois principales procédures pour lesquelles tous les réactifs sont fournis à l’exception des oligonucléotides personnalisés. La première procédure est la préparation de la librairie, qui prépare manuellement les échantillons pour le séquençage. La préparation de la librairie comporte quatre
étapes clés : l’hybridation, l’extension-ligation, l’amplification par PCR et la normalisation de librairie. La deuxième procédure consiste à séquencer l’échantillon préparé à l’aide de la chimie SBS (séquençage par synthèse) sur le
MiSeqDx. La troisième procédure utilise le logiciel d’analyse pour analyser les résultats de séquençage et générer des fichiers au format Variant Call Format (VCF) contenant des appels de variants pour chaque échantillon. Les renseignements nécessaires pour configurer et analyser une analyse de séquençage, y compris une liste des échantillons et leurs séquences d’index, sont détaillés dans un fichier de feuille d’échantillons à valeurs séparées par des virgules
(*.csv).
Préparation de la librairie
• Hybridation : hybride un groupe d’oligonucléotides en amont et en aval spécifiques aux régions d’intérêt en
échantillon d’ADN génomique. À la fin de ce processus, une procédure de lavage en trois étapes avec un filtre capable de sélectionner la taille retire les oligonucléotides non liés de l’ADN génomique.
• Extension-ligation : relie les oligonucléotides en amont et en aval hybridés. Une ADN polymérase s’étend de l’oligonucléotide en amont jusqu’à la région ciblée, suivie d’une ligation à l’extrémité 5’ de l’oligonucléotide en aval en utilisant une ADN ligase. Le résultat est la formation de produits contenant des oligonucléotides spécifiques aux régions d’intérêt bordés par les séquences nécessaires pour l’amplification.
• Amplification par PCR : amplifie les produits de l’extension-ligation à l’aide des primers qui ajoutent des séquences d’index pour le multiplexage d’échantillons, tout comme les séquences de saisie de Flow Cells nécessaires à la génération d’amplifiats sur le MiSeqDx. À la fin de ce processus, une procédure de nettoyage de PCR purifie les produits PCR (désignés comme une librairie).
• Normalisation de librairie : normalise la quantité de chaque librairie pour assurer une représentation plus
égale des librairies dans la dernière librairie regroupée. À la fin de ce processus, la librairie regroupée est chargée dans le MiSeqDx pour le séquençage à l’aide de la chimie SBS.
Février 2015
Référence 15039608, rév. B FRA
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