CONSEILS ET TECHNIQUES D’UTILISATION
DESINTEGRATION DES CELLULES
Les organismes unicellulaires (micro-oranismes) sont constitués d’une paroi cellulaire externe semi-perméable, solide et rigide entourant la membrane protoplasmique
(cytoplasmique) et le cytoplasme. Le cytoplasme est constitué d’acides nucléiques, de protéines, de glucides, de lipides, d’enzymes, d’ions inorganiques, de vitamines, de pigments, d’inclusions et d’environ 80% d’eau. Pour isoler et extraire n’importe quelle de ces substances de l’intérieur de la cellule, il est nécessaire de briser la paroi cellulaire et la membrane protoplasmique. Dans certains cas, les cellules peuvent sécréter la substance désirée, mais dans la plupart des cas la paroi cellulaire doit être désintégrée par ultraons pour libérer ces substances.
Les micro-organismes sont très différents dans leur sensibilité à la désintégration ultrasonique. Par exemple, les plus facilement désintégrés sont ceux en forme de bâtonnet (bacilles), alors que les organismes sphériques (coques) sont beaucoup plus résistants. Le groupe des mycobactérs, auquel appartient le micro-organisme responsable de la tuberculose est particulièrement difficile à désintégrer. Généralement, les cellules animales sont plus facilement désintégrées que les cellules végétales, et les globules rouges sont plus facilement désintégrés que les cellules musculaires car ces cellules ne possédent pas de paroi cellulaire.
Avec le traitement par ultrasons, l’agitation moléculaire dans l’échantillon provoque généralement une élévation de température – surtout avec de petits volumes. Les températures élevées réduisant la cavitation, la température de l’échantillon doit être conservée aussi basse que possible – de préférence juste au-dessus de son point de congélation. Ceci peut être réalisé en immergeant le récipient contenant l’échantillon san un bain de glace et d’eau salée. L’élévation de température peut également être réduite en utilisant le pulseur ou en soumettant l’échantillion à plusieurs séries de courtes sonications.
La désintégration des cellules peut être améliorée en augmentant la pression hydrostatique habituellement 1 à 4 bar et la viscosité. Pour les micro-organismes, l’addition de billes de verre d’une taille comprise entre 0.05 et 0.5 mm favorise la désintégration des cellules en concentrant l’énergie relâchée par la cavitation, et par
écrasement physique. Les billes sont pratiquement indispensables pour la désintégration de spores ou de levures. Le bon dosage est de un volume de billes pour deux volumes de liquide.
Pour le traitement de cellules difficiles, un prétraitement par une enzyme comme le lysozyme ou la hyaluronidase peut être bénéfique. La glycosidase est efficace sur la levure, la lysostaphine sur les Staphylocoques, la collagénase sur la peau et le cartilage, et la trypsine hyaluronidase avec des tissues de foie et de reins.
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Si l’utilisation d’enzyme n’est pas possible, les procédures suivantes peuvent être essayées : congélation de l’échantillon à -70ºC pendant la nuit, puis décongélation dans un mélange eau glace immédiatement avant la sonication.
Chaque fois que cela est possible, les tissus doivent être coupés en tout petits morceaux pour permettre leur mouvement dans le liquide. Les tissus résistants comme la peau et les muscles doivent d’abord être liquéfiés dans un mixer ou un équivalent pendant environ
10 secondes, et transvasés dans un petit récipient pendant le traitement ultrasonique. La congélation suivie d’une réduction en poudre peut également être tilisée se cette procédure ne perturbe pas l’expérience. Si des particules subcellulaires inactes sont désirées, la commande d’amplitude doit être réglée assez bas et le temps de traitement augumenté.
Insérer la sonde suffisamment profondément en-dessous de la surface de l’échantillon pour éviter la formation d’aérosol ou de mousse. La mousse diminue considérablement la cavitation et peut entraîner une dénaturation des protéines. Un traitement à une puissance plus faible sans mousse est beaucoup plus efficace qu’un traitement à une puissance plus
élevée avec sans mousse. La diminution de la puissance, láugmentation de la température du liquide empêchent généralement l’apparition d’aérosol et de mousse. Ne pas utiliser d’agent anti-moussant ou de surfactant.
Des radicaux libres se forment pendant la cavitation. Si on laisse ces radicaux libres s’accumuler, ceux-ci peuvent affecter de façon importante l’intégrité biologique de l’échantillion en réagissant avec les protéines, les polysaccharides ou les acides nucléiques. La formation de radicaux libres au cours de traitements de courte durée n’est normalement pas considérée comme un probléme. Pour des traitements prolongés, il peut
être bénéfique d’ajouter des fixateurs de radicaux libres comme le N
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0, la cystéine, la glutathione réduite, le dithiothréitol ou d’autres composés SH. La saturation de l’echantillon par une atomsphere protectrice d’helium ou d’hydrogéne gazeux, ou l’ajout d’un petit bout de glace carbonique dans l’échantillon diminue souvent la formation de radicaux libres.
La plus grande concentration d’énergie étant à proximité immediate de la sonde, il est impératif de garder l’échantillion aussi prés que possible de la pointe. Les liquides sont facilement traités car les cellules libres circulent sans cesse sous la sonde. Les matériaux solides, cependant, ont tendance à être repoussés par les ultrasons, et doivent être traités dans des récipients suffisamment larges pour contenir la sonde, mais également suffisamment petits pour restreindre le mouvement de l’échantillon. Pour les petits
échantillons, nous conseillons d’utiliser des tubes à essai de forme conique. Bien que les tubes plastiques fonctionnent bien, les tubes en verre et en acier inoxydable sont un peu plus efficaces que ceux en plastique car ils n’absorbent pas les vibrations.
Le contact de la sonde avec le récipient diminue la puissance délivrée, et entraîne la migration de toutes petites particules de verre dans le liquide. Même si ces particules de verre n’affectent pas la composition chimique de l’échantillon, elles formeront une fine couche grise lors de la centrifugation. Si la sonde doit entrer en contact avec un
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