Guide du système NextSeqMD 500 Destiné à la recherche uniquement. Ne pas utiliser dans le cadre d’examens diagnostiques. EXCLUSIF À ILLUMINA Réf. SY-415-9001DOC Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Octobre 2015 Avec Custom Protocol Selector, élaborez un document de référence personnalisé, court et inclusif à partir de votre flux de travail support.illumina.com/custom-protocol-selector.html Ce document et son contenu sont exclusifs à Illumina, Inc. et ses sociétés affiliées (« Illumina »), et sont exclusivement destinés à l’usage contractuel de son client dans le cadre de l’utilisation du ou des produits décrits dans les présentes et à aucune autre fin. Ce document et son contenu ne seront utilisés ou distribués à aucune autre fin et/ou communiqués, divulgués ou reproduits d’aucune façon sans le consentement écrit préalable d’Illumina. Illumina ne cède aucune licence en vertu de son brevet, de sa marque de commerce, de son copyright, ou de ses droits traditionnels ni des droits similaires d’un tiers quelconque par ce document. Les instructions contenues dans ce document doivent être suivies strictement et explicitement par un personnel qualifié et adéquatement formé de façon à assurer l’utilisation correcte et sûre du ou des produits décrits dans les présentes. Le contenu intégral de ce document doit être lu et compris avant d’utiliser ces produits. LE MANQUEMENT À LIRE COMPLÈTEMENT ET À SUIVRE EXPLICITEMENT TOUTES LES INSTRUCTIONS CONTENUES DANS LES PRÉSENTES POURRA CAUSER DES DOMMAGES AUX PRODUITS, DES BLESSURES AUX PERSONNES, UTILISATEURS OU AUTRES, ET DES DOMMAGES AUX AUTRES BIENS. ILLUMINA DÉCLINE TOUTE RESPONSABILITÉ DÉCOULANT D’UNE UTILISATION INAPPROPRIÉE DU OU DES PRODUIT(S) DÉCRIT(S) DANS LA PRÉSENTE (Y COMPRIS LEURS COMPOSANTES ET LE LOGICIEL). © 2015 Illumina, Inc. Tous droits réservés. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cBot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, ForenSeq, Genetic Energy, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iScan, iSelect, MiSeq, MiSeqDx, MiSeq FGx, NeoPrep, NextBio, Nextera, NextSeq, Powered by Illumina, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, la couleur orange citrouille et la conception de bases en flux continu sont des marques de commerce d’Illumina, Inc. ou de ses sociétés affiliées aux États-Unis ou dans d’autres pays. Tous les autres noms, logos et marques de commerce sont la propriété de leurs détenteurs respectifs. ii Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Historique des révisions Document Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 Date Octobre 2015 Description des modifications Spécification : un équivalent du fournisseur de NaOCl recommandé est un équivalent de laboratoire. Ajout d’une recommandation pour le service de maintenance préventive annuel. Réorganisation des renseignements dans les chapitres Présentation et Premiers pas. Ajout d’instructions de personnalisation des paramètres du système. Retrait des instructions d’aide en direct du chapitre Dépannage. Cette option a été supprimée du logiciel de commande. 15046563 I Mai 2015 Correction de la description des réservoirs réservés de la cartouche de réactifs. 15046563 H Mai 2015 Correction du volume de Tween 20 présent dans la solution de lavage utilisée pour les lavages manuels. Restructuration des renseignements concernant les options de configuration du système. Déplacement des renseignements concernant le logiciel RealTime Analysis vers l’annexe A. Guide du système NextSeq 500 iii Document Date 15046563 G Février 2015 Mise à jour des descriptions de logiciel pour la version 1.4. du NextSeq Control Software. • Ajout d’options de lavage manuel : Quick Wash (Lavage rapide) et Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). • Ajout de la description des fonctionnalités de personnalisation de l’analyse afin d’éliminer les consommables à la fin de l’analyse et d’ignorer la confirmation de la vérification avant analyse. • Ajout d’option permettant d’annuler et de redémarrer une vérification avant analyse. • Ajout d’option permettant d’activer le suivi de l’analyse en mode autonome. • Suppression des descriptions des fichiers de décalage et de mise en phase, qui ne sont plus écrits dans le dossier d’analyse. • Mise à jour de l’image du scatter plot afin d’afficher des définitions de base réparties de façon plus uniforme lors de l’utilisation de la version 1.4 du logiciel du système. • Ajout de la description du service de copie d’analyse. • Ajout d’option d’utilisation d’un primer personnalisé pour l’index 2, qui est possible avec la Trousse NextSeq 500 v2. Pour plus de renseignements, consultez le Guide des primers personnalisés NextSeq (document nº 15057456). Mise à jour des instructions de préparation des réactifs en vue de l’utilisation de la Trousse NextSeq 500 v2 : suppression d’étapes de chargement manuelles d’hypochlorite de sodium et de primers à indexage double dans la cartouche de réactifs. Ces réactifs sont pré-chargés dans la cartouche de réactifs v2. Pour plus de renseignements, consultez le Guide de référence des trousses du système NextSeq 500/550 v2 (document nº 15058065). Ajout de la section Consommables pour le séquençage qui répertorie les versions des trousses, les versions NCS compatibles, ainsi que le nom et la référence du guide de référence de la trousse associée. Mise à jour des consommables fournis par l’utilisateur : spécification de l’utilisation du NaOCl pour les options de lavage manuel introduites dans le système NCS v1.4. Correction des exigences relatives aux amplifiats passant par le filtre afin de ne pas dépasser une définition des bases en dessous de la valeur de pureté dans les 25 premiers cycles. Ajout de 120 ml d’eau de laboratoire aux instructions de vérification du système. 15046563 F Septembre 2014 Correction des descriptions des fonctionnalités de la version 1.3 du NextSeq Control Software. Mise à jour de l’URL pour les fiches signalétiques (SDS) : support.illumina.com/sds.html. Mise à jour des marquages des produits NextSeq de MC à MD . iv Description des modifications Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Date 15046563 E Août 2014 Mise à jour des descriptions de logiciel pour la version 1.3 du NextSeq Control Software : • Mises à jour des descriptions des commandes de personnalisation du système et des mises à jour du logiciel sur l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument). • Mise à jour de la description de l’écran Pre-Run Check (Vérification avant analyse), qui groupe les éléments vérifiés en quatre catégories extensibles. • Mise à jour des instructions de l’aide en direct pour un accès à l’aide en direct à partir de l’URL. L’icône s’affichant sur l’écran d’accueil n’est pas disponible dans le NCS v1.3. • Ajout de la procédure de réhybridation sur instrument pour la réhybridation du primer de lecture 1. L’option de réhybridation d’une Flow Cell est compatible avec le NCS version 1.3 ou ultérieure et nécessite une nouvelle cartouche de réactifs et une nouvelle cartouche de tampon. Ajout du Guide des primers personnalisés NextSeq (document nº 15057456) à la liste des ressources supplémentaires. 15046563 D Juin 2014 Ajout des instructions de chargement du BP13 en position nº 18 de la cartouche de réactifs lors de la réalisation d’analyses à index double. Correction du cycle auquel apparaissent les données métriques de densité des amplifiats, qui est le cycle 25. Correction des positions de la cartouche de réactifs pour les primers personnalisés en positions nº 7 (lecture 1), nº 8 (lecture 2) et nº 9 (index 1). Ajout d’une remarque concernant les dommages potentiels lors du changement de l’emplacement de l’instrument après installation. Communiquez toujours avec votre représentant Illumina avant de changer l’emplacement de votre instrument. Mise à jour de l’URL pour les fiches signalétiques (SDS) : support.illumina.com/sds.ilmn. Guide du système NextSeq 500 Description des modifications v Historique des révisions Document Document Date 15046563 C Avril 2014 vi Description des modifications Mise à jour des descriptions de logiciel, qui sont passées au NextSeq Control Software v1.2 et au RTA v2.1 : • Ajout du nom de la formule NextSeq Mid à utiliser avec la trousse de rendement moyen NextSeq 500. • Suppression des instructions invitant à ajouter du NaOCl à la cartouche de lavage du tampon pour un lavage manuel. • Correction du volume de NaOCl qui passe à 3 ml pour la position 28 de la cartouche de réactifs pour le lavage automatique après analyse. • Mention de l’affichage des noms d’analyses longs dans un champ de défilement sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse). • Indication selon laquelle RTA v2 n’applique pas de corrections de la mise en phase et de la préphase aux lectures d’index. • Ajout de la description des fichiers de journaux aux listes de fichiers utilisés pour le dépannage. • Ajout d’instructions pour vider un réservoir à réactifs usagés plein au cours d’une analyse. • Ajout de la description de dossiers de formules, notamment l’emplacement de formules personnalisées. • Ajout de la description des vérifications thermiques des ventilateurs et des sondes thermiques. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Date 15046563 B Février 2014 Mise à jour des descriptions du NextSeq Control Software, passé à la v1.1 : • Ajout de la fonction de recherche sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse) pour le filtrage des analyses disponibles. • Ajout des formules disponibles, incluant NextSeq High ou NextSeq Mid, en fonction du type de Flow Cell. • Note indiquant que les mises à jour du logiciel comprennent l’accord de licence, les notes de mise à jour et la liste des logiciels à mettre à jour. • Ajout de la description du message d’erreur RAID. • Note indiquant qu’un bouton Exit (Quitter) ferme le NSS et redémarre le NCS automatiquement à la fin d’un contrôle du système. Ajout d’une durée de stockage des réactifs allant jusqu’à une semaine à 4 °C. Nouvelle inscription sur la cartouche de réactifs pour le réservoir nº 10 : Load Library Here (Charger la librairie ici). Mise à jour de la liste des consommables fournis par l’utilisateur : précision de l’hypochlorite de sodium à 3 à 6 % et ajout du numéro de référence du fournisseur. Mise à jour des instructions de préparation de la solution de NaOCl diluée à 0,06 % pour les lavages de l’instrument : réduction de volume à 2 ml et concentration de démarrage de 3 à 6 %. Ajout d’illustrations pour montrer la bonne et la mauvaise position de l’attache sur la Flow Cell. Mise à jour du chapitre sur l’analyse temps réel afin d’inclure une présentation de RTA v2, la structure du dossier de sortie et la procédure de définition des bases. Mise à jour du chapitre sur le dépannage afin d’inclure les erreurs RTA v2 et d’ajouter les fichiers RunParameters.xml dans la liste des fichiers de dépannage. 15046563 A Janvier 2014 Publication originale. Guide du système NextSeq 500 Description des modifications vii Historique des révisions Document viii Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Table des matières Historique des révisions Table des matières Chapitre 1 Présentation Introduction Ressources supplémentaires Composants de l’instrument Présentation des consommables de séquençage Chapitre 2 Premiers pas Démarrage de l’instrument Personnaliser les paramètres du système Personnaliser les paramètres de l’analyse Consommables et équipement fournis par l’utilisateur Chapitre 3 Séquençage Introduction Flux de travail de séquençage Préparer la cartouche de réactifs Préparer la Flow Cell Préparer des librairies pour le séquençage Configurer une analyse de séquençage Surveiller la progression de l’analyse Lavage automatique après analyse Chapitre 4 Maintenance Introduction Effectuer un lavage manuel Mises à jour logicielles Arrêter l’instrument Annexe A Dépannage Introduction Fichiers de dépannage Résoudre les erreurs de vérification automatique Réservoir à réactifs usagés plein Flux de travail de réhybridation Formules personnalisées et dossiers de formules Vérification du système Message d’erreur RAID Configurer les paramètres du système Annexe B Real-Time Analysis Présentation de Real-Time Analysis Flux de travail de Real-Time Analysis Fichiers de sortie de séquençage Plaques de la Flow Cell Structure du dossier de sortie Guide du système NextSeq 500 iii ix 1 2 3 4 7 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 23 24 30 32 33 34 35 38 40 41 42 43 44 46 47 50 51 54 55 57 58 60 63 65 68 ix Index 69 Assistance technique 73 x Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Chapitre 1 Présentation Introduction Ressources supplémentaires Composants de l’instrument Présentation des consommables de séquençage Guide du système NextSeq 500 2 3 4 7 1 Chapitre 1 Présentation Présentation Introduction Le système NextSeqMD 500 d’IlluminaMD allie la puissance du séquençage à haut débit à la simplicité d’un instrument de séquençage de bureau. Fonctionnalités } } } } 2 Séquençage à débit élevé : le système NextSeq 500 permet de réaliser un séquençage des exomes, du génome entier et du transcriptome, et prend en charge les librairies TruSeqMD et NexteraMD. Types de Flow Cell : les Flow Cells sont disponibles dans des configurations pour moyen débit et haut débit. Chaque type de Flow Cell est doté d’une cartouche de réactif compatible pré-remplie. Real-Time Analysis (RTA) : ce logiciel d’analyse intégré exécute l’analyse des données sur instrument, ce qui comprend l’analyse d’images et la définition des bases. Le système NextSeq utilise une version de RTA appelée RTA v2, qui comporte d’importants changements en matière d’architecture et de fonctionnalités. Pour plus de renseignements, consultez la section Real-Time Analysis à la page 57. Intégration de BaseSpaceMD : le flux de travail de séquençage est intégré à BaseSpace, l’environnement informatique consacré à la génomique d’Illumina pour l’analyse des données, leur stockage et leur partage. Pour les instruments configurés pour BaseSpace, les renseignements sur les librairies et les paramètres d’analyse sont précisés dans l’onglet Prep (Préparation) de BaseSpace. Les analyses configurées dans BaseSpace s’affichent dans l’interface de l’instrument pendant la configuration de l’analyse. Au cours de l’analyse, les fichiers de sortie sont transférés en temps réel vers BaseSpace ou BaseSpace Onsite. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Les documents suivants sont disponibles en téléchargement dans le site Web d’Illumina. Ressource Description Guide de préparation du site du système NextSeq (document nº 15045113) Fournit les spécifications relatives à l’espace de laboratoire, les exigences électriques et les considérations environnementales. Guide de sécurité et de conformité du système NextSeq (document nº 15046564) Fournit des renseignements concernant les questions de sécurité, les déclarations de conformité et l’étiquetage de l’instrument. Guide de l’utilisateur du lecteur RFID – modèle TR-001-44 (document nº 15041950) Fournit des renseignements sur le lecteur RFID de l’instrument, les certificats de conformité et les questions de sécurité. Dénaturation et dilution de librairies pour le système NextSeq (document nº 15048776) Fournit des instructions concernant la dénaturation et la dilution des librairies préparées pour une analyse de séquençage et des instructions au sujet de la préparation d’une librairie de contrôle PhiX facultative. Cette étape s’applique à la plupart des types de librairies. Guide des primers personnalisés NextSeq (document nº 15057456) Fournit des renseignements concernant l’utilisation de primers de séquençage personnalisés à la place de primers de séquençage d’Illumina. Aide BaseSpace (help.basespace.illumina.com) Fournit des renseignements concernant l’utilisation de BaseSpaceMD et des options d’analyse disponibles. Consultez la page d’aide du système NextSeq 500 sur le site Web d’Illumina pour accéder à la documentation, aux téléchargements de logiciels, à la formation en ligne et aux foires aux questions. Guide du système NextSeq 500 3 Ressources supplémentaires Ressources supplémentaires Présentation Composants de l’instrument Le système NextSeq 500 comprend un moniteur tactile, une barre d’état et trois compartiments. Figure 1 Composants de l’instrument A B C D E Compartiment d’imagerie : contient la Flow Cell pendant une analyse de séquençage. Moniteur tactile : active la configuration sur instrument et la configuration à l’aide de l’interface du logiciel de commande. Barre d’état : indique si l’instrument est en cours de traitement (bleu), nécessite une attention particulière (orange) ou est prêt pour le séquençage (vert) ou lorsqu’un lavage doit être effectué dans les prochaines 24 heures (jaune). Compartiment du tampon : contient la cartouche de tampon et le réservoir de réactifs usagés. Compartiment de réactifs : contient la cartouche de réactifs. Compartiment d’imagerie Le compartiment d’imagerie contient la platine, qui comprend trois broches d’alignement pour le placement de la Flow Cell. Après le chargement de la Flow Cell, la porte du compartiment d’imagerie se ferme automatiquement et place les composants correctement. Compartiments des réactifs et du tampon Pour paramétrer une analyse de séquençage sur le NextSeq 500, vous devez accéder au compartiment des réactifs et au compartiment du tampon pour charger les consommables de l’analyse et vider le réservoir à réactifs usagés. 4 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA A B C D E Porte du compartiment des réactifs : elle ferme le compartiment des réactifs à l’aide d’un verrou qui se trouve sous le coin inférieur droit de la porte. Le compartiment des réactifs contient la cartouche de réactifs. Les réactifs sont pompés par les dispositifs d’aspiration, le système fluidique et la Flow Cell. Cartouche de réactifs : la cartouche de réactifs est un consommable à usage unique prérempli. Cartouche du tampon : la cartouche du tampon est un consommable à usage unique prérempli. Réservoir à réactifs usagés : les réactifs usagés sont recueillis pour leur mise au rebut après chaque analyse. Porte du compartiment du tampon : elle ferme le compartiment du tampon à l’aide d’un verrou qui se trouve sous le coin inférieur gauche de la porte. Logiciel NextSeq Le logiciel de l’instrument comprend des applications intégrées qui réalisent des analyses de séquençage. } NextSeq Control Software (NCS) : l’interface du logiciel de commande vous guide tout au long des étapes de configuration d’une analyse de séquençage. } Logiciel Real-Time Analysis (RTA) : RTA effectue l’analyse d’image et la définition des bases lors de l’analyse. Le NextSeq 500 utilise RTA v2, qui comprend d’importants changements d’architecture et de fonctionnalités par rapport aux versions plus anciennes. Pour plus de renseignements, consultez la section Real-Time Analysis à la page 57. Icônes d’état Une icône d’état située dans le coin supérieur droit de l’interface du logiciel de commande signale toute modification des conditions pendant la configuration de l’analyse ou pendant l’analyse. Icône d’état Guide du système NextSeq 500 Nom de l’état État correct Description Le système est normal. Traitement Le système est en cours de traitement. 5 Composants de l’instrument Figure 2 Compartiments des réactifs et du tampon Présentation Icône d’état Nom de l’état Avertissement Erreur Description Un avertissement a eu lieu. Les avertissements n’interrompent pas une analyse et ne nécessitent pas d’intervention pour la poursuite de l’analyse. Une erreur a eu lieu. Les erreurs nécessitent une intervention avant la poursuite de l’analyse. Lorsqu’un changement de situation se produit, l’icône clignote afin de vous alerter. Sélectionnez l’icône pour afficher une description du problème. Sélectionnez Acknowledge (Accusé de réception) pour accepter le message et Close (Fermer) pour fermer la boîte de dialogue. Bouton d’alimentation Le bouton d’alimentation situé sur la partie avant du NextSeq met sous tension l’instrument et l’ordinateur de l’instrument. Il réalise les actions suivantes en fonction de l’état de l’alimentation de l’instrument. État de l’alimentation Action Instrument hors tension Appuyez brièvement sur le bouton pour le mettre sous tension. Instrument sous tension Appuyez brièvement sur le bouton pour le mettre hors tension. Une boîte de dialogue s’affiche à l’écran pour confirmer que l’instrument s’est arrêté normalement. Instrument sous tension Appuyez et maintenez le bouton d’alimentation pendant 10 secondes pour provoquer un arrêt forcé de l’instrument et de l’ordinateur de l’instrument. Utilisez cette méthode pour mettre l’instrument hors tension uniquement si l’instrument ne répond pas. REMARQUE Mettre l’instrument hors tension au cours d’une analyse de séquençage arrête immédiatement celle-ci. L’arrêt d’une analyse est définitif. Les consommables de l’analyse ne peuvent pas être réutilisés et les données de séquençage de l’analyse ne sont pas enregistrées. 6 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Pour effectuer une analyse de séquençage sur le NextSeq 500, une trousse Trousse NextSeq 500 à usage unique est nécessaire. Chaque trousse comprend une Flow Cell et les réactifs nécessaires à la réalisation d’une analyse de séquençage. La Flow Cell, la cartouche de réactifs et la cartouche de tampon utilisent une identification par radiofréquence (RFID) pour un suivi précis des consommables et pour des questions de compatibilité. Étiquetage de compatibilité de la trousse Des codes de couleurs figurent sur les composants de la trousse, afin d’indiquer la compatibilité des Flow Cell avec les cartouches de réactifs. Utilisez toujours une cartouche de réactifs et une Flow Cell compatibles. La cartouche de tampon est universelle. Toutes les Flow Cell et toutes les cartouches de réactifs sont étiquetées High (Élevé) ou Mid (Moyen). Vérifiez toujours l’étiquette lorsque vous préparez les consommables pour une analyse. Type de trousse Marquage sur l’étiquette Composants de la trousse de débit élevé Composants de la trousse de débit moyen Présentation de la Flow Cell Figure 3 Cartouche de Flow Cell A B C Paire de lignes A : lignes 1 et 3 Paire de lignes B : lignes 2 et 4 Châssis de la cartouche de Flow Cell La Flow Cell est un substrat de verre qui sert de support à la génération des amplifiats et à la réaction de séquençage. La Flow Cell est enchâssée dans une cartouche de Flow Cell. Guide du système NextSeq 500 7 Présentation des consommables de séquençage Présentation des consommables de séquençage Présentation La Flow Cell contient quatre lignes qui sont imagées par paires. } Les lignes 1 et 3 (paire de lignes A) sont imagées simultanément. } Les lignes 2 et 4 (paire de lignes B) sont imagées lorsque l’imagerie de la paire de lignes A est terminée. Bien que la Flow Cell contienne quatre lignes, une seule librairie ou un seul ensemble de librairies uniquement est séquencé sur la Flow Cell. Les librairies sont chargées sur la cartouche de réactifs dans un réservoir unique et transférées automatiquement sur les quatre lignes de la Flow Cell. Chaque ligne est imagée par petites zones d’imagerie appelées plaques. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Plaques de la Flow Cell à la page 65. Présentation de la cartouche de réactifs La cartouche de réactifs est un consommable à usage unique doté d’un système de suivi RFID et de réservoirs scellés par un opercule en aluminium, pré-remplis de réactifs d’amplification et de séquençage. Figure 4 Cartouche de réactifs La cartouche de réactifs contient un réservoir désigné pour le chargement de librairies préparées. Après le lancement de l’analyse, les librairies sont transférées automatiquement du réservoir à la Flow Cell. Plusieurs réservoirs sont réservés pour le lavage après analyse automatique. La solution de lavage est pompée de la cartouche de tampon jusqu’aux réservoirs réservés, à travers le système, puis jusqu’au réservoir de réactifs usagés. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminezles conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html. 8 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Figure 5 Réservoirs numérotés Position 7, 8 et 9 10 Description Réservés pour des primers personnalisés facultatifs Charger les librairies Pour plus de renseignements concernant les primers personnalisés, consultez le Guide des primers personnalisés NextSeq (document nº 15057456). Réservoir amovible en position nº 6 La cartouche de réactifs préremplie comprend un réactif de dénaturation en position nº 6 qui contient du formamide. Pour faciliter l’élimination sûre de tout réactif non utilisé après l’analyse de séquençage, le réservoir en position nº 6 est amovible. Pour obtenir plus de renseignements, consultez Retirer le réservoir usagé de la position nº 6 à la page 27. Présentation de la cartouche de tampon La cartouche de tampon est un consommable à usage unique contenant trois réservoirs préremplis de solutions tampon et d’une solution de lavage. Le contenu de la cartouche de tampon est suffisant pour séquencer une Flow Cell. Figure 6 Cartouche de tampon Guide du système NextSeq 500 9 Présentation des consommables de séquençage Réservoirs réservés 10 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Chapitre 2 Premiers pas Démarrage de l’instrument Personnaliser les paramètres du système Personnaliser les paramètres de l’analyse Consommables et équipement fournis par l’utilisateur Guide du système NextSeq 500 12 13 14 15 11 Chapitre 2 Premiers pas Premiers pas Démarrage de l’instrument Basculez l’interrupteur en position I (Marche). Figure 7 Interrupteur d’alimentation situé à l’arrière de l’instrument 1 Appuyez sur le bouton d’alimentation situé au-dessus du compartiment des réactifs. Le bouton d’alimentation active l’alimentation de l’instrument et démarre l’ordinateur et les logiciels intégrés à l’instrument. Figure 8 Bouton d’alimentation situé à l’avant de l’instrument 12 2 Attendez le chargement complet du système d’exploitation. Le NextSeq Control Software (NCS) démarre et lance automatiquement le système. À la fin de l’étape d’initialisation, l’écran d’accueil s’ouvre. 3 Si votre système a été configuré de manière à nécessiter des identifiants d’ouverture de session, ouvrez une session à l’aide du nom d’utilisateur et du mot de passe par défaut : } Nom d’utilisateur : sbsuser } Mot de passe : sbs123 Sinon, ouvrez une session à l’aide des identifiants définis pour votre site. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Le logiciel de commande comporte des paramètres du système personnalisables pour les options de démarrage, les préférences d’entrée, les paramètres audio et le nom de l’instrument. Sélectionner l’option de démarrage 1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Customisation (Personnalisation du système). 2 Sélectionnez l’une des options de démarrage suivantes : } Sélectionnez Kiosk Mode (Mode kiosque) pour afficher l’interface du logiciel de commande en plein écran. } Sélectionnez Windows Mode (Mode Windows) pour accéder à Windows sur l’ordinateur de l’instrument. Toute interaction avec l’interface du logiciel, comme par exemple l’emplacement des boutons, risque d’être modifiée dans ce mode. 3 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et faire défiler l’écran. Configurer l’option d’entrée et l’indicateur sonore 1 Depuis l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Customisation (Personnalisation du système). 2 Cochez la case Use on-screen keyboard (Utiliser le clavier sur l’écran) pour activer le clavier sur l’écran pour l’entrée sur l’instrument. 3 Cochez la case Play audio (Lire les sons) afin d’activer les indicateurs sonores pour les événements suivants. } Lors de l’initialisation de l’instrument } Lors du démarrage d’une analyse } Lors de la survenue de certaines erreurs } Lorsqu’une action de l’utilisateur est requise } Lorsqu’une analyse est terminée 4 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et faire défiler l’écran. Personnaliser l’identification de l’instrument 1 Depuis l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Customisation (Personnalisation du système). 2 Pour attribuer une image de votre choix à l’instrument, sélectionnez Browse (Parcourir) et localisez l’image. 3 Saisissez un nom préféré pour l’instrument dans le champ Nick Name (Surnom). 4 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et faire défiler l’écran. L’image et le nom apparaissent dans le coin supérieur gauche de chaque écran. Guide du système NextSeq 500 13 Personnaliser les paramètres du système Personnaliser les paramètres du système Premiers pas Personnaliser les paramètres de l’analyse Le logiciel de commande contient des paramètres personnalisables pour les préférences de configuration de l’analyse et l’élimination des réactifs inutilisés. Configurer les options de configuration de l’analyse 1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Customization (Personnalisation du système). 2 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à Run Customization (Personnalisation de l’analyse). 3 Cochez la case Use Advanced Load Consumables (Utiliser les consommables de chargement avancé) pour activer l’option permettant le chargement de tous les consommables de l’analyse à partir d’un écran unique. 4 Cochez la case Skip Pre-Run Check Confirmation (Ignorer la confirmation de la vérification avant analyse) pour démarrer automatiquement le séquençage une fois la vérification avant analyse correctement effectuée. 5 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et quitter l’écran. Configurer l’option d’élimination automatique 1 Depuis l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Customisation (Personnalisation du système). 2 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à Run Customization (Personnalisation de l’analyse). 3 Cochez la case Purge Consumables at End of Run (Éliminer les consommables à la fin de l’analyse) pour éliminer automatiquement les réactifs inutilisés de la cartouche de réactifs vers le réservoir des réactifs usagés après chaque analyse. REMARQUE L’élimination automatique des consommables ajoute une durée supplémentaire au flux de travail. 4 14 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer les paramètres et quitter l’écran. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA L’équipement et les consommables suivants sont utilisés sur le NextSeq 500. Consommables fournis par l’utilisateur pour les analyses de séquençage Consommable 1 N NaOH (hydroxyde de sodium) Tris-HCl 200 mM, pH7 Lingettes alcoolisées, isopropyle à 70 % ou Éthanol à 70 % Gants jetables, sans talc Chiffon de laboratoire peu pelucheux Fournisseur Fournisseur de laboratoire général Fournisseur de laboratoire général VWR, nº de référence 95041-714 (ou équivalent) Fournisseur de laboratoire général Fournisseur de laboratoire général VWR, nº de référence 21905-026 (ou équivalent) Utilisation Dénaturation de librairie, diluée à 0,2 N Dénaturation de librairie Nettoyage de la Flow Cell et usage général Usage général Nettoyage de la Flow Cell Consommables fournis par l’utilisateur pour la maintenance de l’instrument Consommable NaOCl, 5 % (hypochlorite de sodium) Tween 20 Eau de laboratoire Fournisseur Sigma-Aldrich, nº de référence 239305 (ou équivalent pour laboratoire) Sigma-Aldrich, nº de référence P7949 Fournisseur de laboratoire général Utilisation Lavage de l’instrument à l’aide de la fonction de lavage manuel après analyse; dilution à 0,12 % Lavage de l’instrument à l’aide des options de lavage manuel, dilution à 0,05 % Lavage de l’instrument (lavage manuel) Recommandations à propos de l’eau de laboratoire Utilisez toujours de lʼeau de laboratoire pour réaliser des procédures sur l’instrument. N’utilisez jamais d’eau courante ou d’eau désionisée. Voici des exemples d’eaux de laboratoire acceptables : } PW1 d’Illumina } Eau 18 mégohms (MΩ) } Eau Milli-Q } Eau Super-Q } Eau de qualité biologie moléculaire Équipement fourni par l’utilisateur Élément Congélateur, de -15 à -25 °C, sans givre Bac à glaçons Réfrigérateur, de 2 à 8 °C Guide du système NextSeq 500 Source Fournisseur de laboratoire général Fournisseur de laboratoire général Fournisseur de laboratoire général 15 Consommables et équipement fournis par l’utilisateur Consommables et équipement fournis par l’utilisateur 16 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Chapitre 3 Séquençage Introduction Flux de travail de séquençage Préparer la cartouche de réactifs Préparer la Flow Cell Préparer des librairies pour le séquençage Configurer une analyse de séquençage Surveiller la progression de l’analyse Lavage automatique après analyse Guide du système NextSeq 500 18 19 20 21 23 24 30 32 17 Chapitre 3 Séquençage Séquençage Introduction Pour effectuer une analyse de séquençage sur le NextSeq 500, préparez une cartouche de réactifs et une Flow Cell, puis suivez les indications du logiciel pour configurer et démarrer l’analyse. La génération d’amplifiats et le séquençage sont effectués sur instrument. Après l’analyse, un lavage de l’instrument commence automatiquement à l’aide des composants déjà chargés sur l’instrument. Génération d’amplifiats Lors de la génération d’amplifiats, les molécules d’ADN uniques sont liées à la surface de la Flow Cell, puis subissent une amplification de façon à former des amplifiats. Séquençage Les amplifiats sont imagés à l’aide d’une chimie de séquençage à deux canaux et de combinaisons de filtres propres à chacun des terminateurs de chaîne marqués par fluorescence. Lorsque l’imagerie d’une plaque sur la Flow Cell est terminée, la plaque suivante est imagée. Ce processus se répète pour chaque cycle de séquençage. Après l’analyse de l’image, le logiciel définit les bases, les filtre et leur attribue un score de qualité. Surveillez la progression et les statistiques de l’analyse à partir de l’interface du logiciel de commande, de l’onglet Run (Analyse) dans BaseSpace ou d’un ordinateur en réseau utilisant le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Consultez la section Visualiseur d’analyse de séquençage à la page 31. Analyse Pendant la progression de l’analyse, le logiciel de commande transfère automatiquement les fichiers de définition des bases (BCL) vers BaseSpace ou l’emplacement de sortie indiqué pour l’analyse secondaire. Plusieurs méthodes d’analyse sont disponibles en fonction de votre application. Pour plus de renseignements, consultez l’Aide BaseSpace (help.basespace.illumina.com). Durée de l’analyse de séquençage La durée de l’analyse de séquençage dépend du nombre de cycles réalisés. La longueur de lecture maximale est une analyse à lecture appariée comprenant 150 cycles par lecture (2 x 150) plus jusqu’à huit cycles de chaque pour deux lectures d’index. Pour les durées attendues et autres spécifications du système, consultez la page des spécifications du système NextSeq 500 sur le site Web d’Illumina. Nombre de cycles dʼune lecture Lors d’une analyse de séquençage, une lecture comprend un cycle de plus que le nombre de cycles analysés. Par exemple, une analyse de 150 cycles à lecture appariée effectue des lectures de 151 cycles (2 × 151), pour un total de 302 cycles. À la fin de lʼanalyse, 2 x 150 cycles sont analysés. Le cycle supplémentaire est requis pour les calculs de la mise en phase et de la préphase. 18 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Pour les configurations utilisant BaseSpace ou BaseSpace Onsite d’Illumina : configurez l’analyse dans l’onglet Prep (Préparation) de BaseSpace. Consultez l’Aide BaseSpace (help.basespace.illumina.com). Préparez une nouvelle cartouche de réactifs : décongelez et inspectez. Préparez une nouvelle Flow Cell : amenez à température ambiante, déballez et inspectez. Dénaturez et diluez les librairies (ne s’applique pas à tous les types de librairies). Consultez Dénaturation et dilution de librairies pour le système NextSeq (document nº 15048776). Chargez la dilution de la librairie sur la cartouche de réactifs dans le réservoir nº 10. À partir de l’interface logicielle, sélectionnez Sequence (Séquence) pour lancer les étapes de configuration de l’analyse. Chargez la Flow Cell. Videz et rechargez le réservoir de réactifs usagés. Chargez la cartouche de tampon et la nouvelle cartouche de réactifs. Examinez les paramètres de l’analyse et les résultats de la vérification automatique. Sélectionnez Start (Démarrer). Surveillez votre analyse à partir de l’interface du logiciel de commande, de l’onglet Run (Analyse) sur BaseSpace ou depuis un ordinateur en réseau utilisant le visualiseur d’analyse de séquençage. Un lavage de l’instrument démarre automatiquement lorsque le séquençage est terminé. Guide du système NextSeq 500 19 Flux de travail de séquençage Flux de travail de séquençage Séquençage Préparer la cartouche de réactifs 1 Retirez la cartouche de réactifs de son lieu de stockage à -25 à -15 °C. 2 Faites décongeler dans un bain d’eau à température ambiante jusqu’à décongélation (environ 60 minutes). N’immergez pas la cartouche. 3 Tapotez doucement sur la paillasse pour éliminer l’eau de la base, puis séchez la base. REMARQUE [Autre méthode] Décongelez les réactifs en les laissant une nuit entre 2 et 8 °C. Il faut au moins 18 heures aux réactifs pour décongeler complètement. À cette température, les réactifs sont stables pendant une durée allant jusqu’à une semaine. 4 Retournez la cartouche cinq fois pour mélanger les réactifs. 5 Inspectez les positions 29, 30, 31 et 32 pour vérifier que les réactifs sont décongelés. 6 Tapotez doucement sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminezles conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html. 20 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA 1 Sortez un nouvel emballage de Flow Cell de son lieu de stockage à 2 à 8 °C. 2 Laissez l’emballage ouvert de la Flow Cell à température ambiante pendant 30 minutes. REMARQUE Si l’emballage en papier aluminium est intact, la Flow Cell peut rester à température ambiante durant 12 heures. Évitez les modifications de température répétées de la Flow Cell. 3 Sortez la Flow Cell de son emballage en aluminium. Figure 9 Retrait de l’emballage en aluminium 4 Ouvrez l’emballage double coque en plastique transparent et sortez la Flow Cell. Figure 10 Retirer de l’emballage double coque 5 Nettoyez la surface en verre de la Flow Cell à l’aide d’une lingette alcoolisée non pelucheuse. Séchez le verre à l’aide d’un chiffon de laboratoire peu pelucheux. Inspecter la Flow Cell 1 Assurez-vous que les ports de Flow Cell ne sont pas obstrués. 2 Vérifiez que les joints de port sont fixés et que les tenons en plastique blanc sont visibles. Guide du système NextSeq 500 21 Préparer la Flow Cell Préparer la Flow Cell Séquençage Figure 11 Composants de la Flow Cell A B C D E 3 Joints de port (4) Pinces de maintien (4) Pinces à ressort (4) Châssis de la cartouche de Flow Cell Plaque de support Assurez-vous que les quatre pinces de maintien blanches sont bien encliquetées sur le bord de la plaque de support noire. Si la plaque n’est pas bien fixée sous les pinces, appuyez doucement sur la plaque de support noire et sur le châssis de la cartouche blanche, jusqu’à ce que la plaque s’enclenche sous les pinces. Figure 12 Inspection des pinces de maintien A B 4 Mauvais positionnement : la pince de maintien n’est pas encliquetée sur le bord de la plaque de support. Bon positionnement : la pince de maintien est encliquetée sur le bord de la plaque de support. Vérifiez que les quatre pinces métalliques à ressort sont positionnées à plat contre la plaque de support noire. Figure 13 Inspection des pinces à ressort A B 22 Mauvais positionnement : la pince à ressort n’est pas à plat contre la plaque de support. Bon positionnement : la pince à ressort est à plat contre la plaque de support. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Le volume et la concentration de chargement de la librairie varient selon la version du NCS que vous utilisez. Version du logiciel de commande Volume de la librairie Concentration de la librairie NCS v1.3 ou ultérieure 1,3 ml 1,8 pM NCS v1.2 ou antérieure 3 ml 3 pM Dénaturer et diluer les librairies Si cela est nécessaire pour votre type de librairie, dénaturez et diluez les librairies et ajoutez une librairie de contrôle PhiX. Le volume et la concentration de chargement de la librairie varient selon la version du NCS que vous utilisez. Pour plus de renseignements, consultez Dénaturation et dilution de librairies pour le système NextSeq (document nº 15048776). Charger des librairies sur la cartouche de réactifs 1 Nettoyez l’opercule en aluminium recouvrant le réservoir nº 10 étiqueté Load Library Here (Charger la librairie ici) à l’aide d’un tissu non pelucheux. 2 Percez l’opercule à l’aide d’un embout de pipette de 1 ml propre. 3 Chargez les librairies dans le réservoir nº 10 étiqueté Load Library Here (Charger la librairie ici). Évitez de toucher l’opercule en aluminium pendant le transfert du produit. Figure 14 Charger les librairies Guide du système NextSeq 500 23 Préparer des librairies pour le séquençage Préparer des librairies pour le séquençage Séquençage Configurer une analyse de séquençage 1 Sur l’écran d’accueil, sélectionnez Sequence (Séquence). La commande Sequence (Séquence) ouvre la porte du compartiment d’imagerie, libère les consommables utilisés lors d’une analyse précédente et ouvre une série d’écrans de configuration de l’analyse. Un court délai est normal. Si l’instrument est configuré pour BaseSpace, vous êtes invité à vous connecter à BaseSpace. Si l’instrument est configuré en mode autonome, l’étape suivante est le chargement de la Flow Cell. Se connecter à BaseSpace 1 Saisissez votre nom d’utilisateur et votre mot de passe BaseSpace 2 Sélectionnez Next (Suivant). Charger la Flow Cell 1 Retirez la Flow Cell usagée ayant servi à la précédente analyse. 2 Alignez la Flow Cell sur les broches d’alignement et placez-la sur la platine. Figure 15 Charger la Flow Cell 24 3 Sélectionnez Load (Charger). La porte se ferme automatiquement, l’identifiant de la Flow Cell s’affiche à l’écran et les capteurs sont activés. 4 Sélectionnez Next (Suivant). Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA 1 Retirez le réservoir à réactifs usagés et éliminez son contenu selon les normes en vigueur. Figure 16 Retirer le réservoir à réactifs usagés REMARQUE Placez votre autre main sous le contenant lorsque vous le retirez afin de le soutenir. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminezles conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html. 2 Faites glisser le réservoir à réactifs usagés vide dans le compartiment de tampon jusqu’à la butée. Un déclic indique que le contenant est en place. Figure 17 Charger le réservoir à réactifs usagés vide Guide du système NextSeq 500 25 Configurer une analyse de séquençage Vider le réservoir à réactifs usagés Séquençage Charger la cartouche de tampon 1 Retirez la cartouche de tampon usagée du compartiment supérieur. 2 Glissez une nouvelle cartouche de tampon dans le compartiment de tampon jusqu’à la butée. Un déclic indique que la cartouche est en position, l’identifiant de la cartouche de tampon s’affiche à l’écran et le capteur est activé. Figure 18 Charger la cartouche de tampon 3 Fermez la porte du compartiment de tampon et sélectionnez Next (Suivant). Charger la cartouche de réactifs 1 Retirez la cartouche de réactifs usagée du compartiment de réactifs. Mettez au rebut les contenus inutilisés conformément aux normes en vigueur. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html. REMARQUE Le réservoir à la position 6 est amovible pour faciliter la mise au rebut en toute sécurité des réactifs inutilisés. Pour obtenir plus de renseignements, consultez Retirer le réservoir usagé de la position nº 6 à la page 27. 2 26 Faites glisser la cartouche de réactifs dans le compartiment de réactifs jusqu’à ce qu’elle s’arrête, puis refermez la porte du compartiment de réactifs. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA 3 Sélectionnez Load (Charger). Le logiciel positionne automatiquement la cartouche (environ 30 secondes), l’identifiant de la cartouche de réactifs s’affiche à l’écran et les capteurs sont activés. 4 Sélectionnez Next (Suivant). Retirer le réservoir usagé de la position nº 6 1 Après avoir retiré la cartouche de réactifs usagés de l’instrument, retirez le couvercle de protection en caoutchouc recouvrant la fente à côté de la position nº 6. Figure 20 Position nº 6 amovible A B Couvercle de protection en caoutchouc Position nº 6 2 Appuyez sur l’onglet en plastique transparent, puis poussez vers la gauche pour éjecter le réservoir. 3 Mettez le réservoir au rebut conformément aux normes de sécurité. Indiquer les paramètres de l’analyse Les étapes figurant sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse) diffèrent selon la configuration du système : } BaseSpace ou BaseSpace Onsite : l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse) indique les analyses configurées avec l’onglet Prep de BaseSpace. Si l’analyse prévue n’apparaît pas sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse), vérifiez qu’elle est marquée pour séquençage dans BaseSpace. } Autonome : l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse) comporte des champs permettant de définir les paramètres de l’analyse. Guide du système NextSeq 500 27 Configurer une analyse de séquençage Figure 19 Charger la cartouche de réactifs Séquençage Sélectionner une analyse disponible (configuration de BaseSpace) 1 Sélectionnez un nom d’analyse dans la liste des analyses disponibles. Utilisez les flèches haut et bas pour faire défiler la liste ou saisissez le nom d’une analyse dans le champ de recherche. 2 Sélectionnez Next (Suivant). 3 Confirmez les paramètres de l’analyse. } Run Name(Nom de l’analyse) : le nom de l’analyse tel qu’attribué dans BaseSpace. } Library ID (ID de librairie) : le nom des librairies groupées tel qu’attribué dans BaseSpace. } Recipe (Formule) : le nom de la formule, NextSeq High ou NextSeq Mid, en fonction de la cartouche de réactifs utilisée pour l’analyse. } Read Type (Type de lecture) : lecture unique ou appariée. } Read Length (Longueur de la lecture) : le nombre de cycles par lecture. } [Facultatif] Primers personnalisés, le cas échéant. 4 [Facultatif] Sélectionnez l’icône Edit (Modifier) pour modifier les paramètres de l’analyse. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Save (Enregistrer). } Run parameters (Paramètres d’analyse) : modifier le nombre de lectures ou le nombre de cycles par lecture. } Custom primers (Primers personnalisés) : modifier les réglages des primers personnalisés utilisés. Pour plus de renseignements, consultez le Guide des primers personnalisés NextSeq (document nº 15057456). } Purge consumables for this run (Éliminer les consommables pour cette analyse) : modifier ce réglage pour éliminer automatiquement les consommables après l’analyse en cours. 5 Sélectionnez Next (Suivant). Saisir des paramètres d’analyse (configuration autonome) 28 1 Saisissez le nom d’analyse de votre choix. 2 [Facultatif] Saisissez un identifiant de librairie de votre choix. 3 Sélectionnez une formule dans la liste déroulante Recipe (Formule). Seules les formules compatibles sont répertoriées. 4 Sélectionnez un type de lecture, soit Single Read (Lecture unique), soit Paired End (Lecture appariée). 5 Indiquez le nombre de cycles pour chaque lecture de l’analyse de séquençage. } Read 1 (Lecture 1) : saisissez une valeur dans la limite de 151 cycles. } Read 2 (Lecture 2) : saisissez une valeur dans la limite de 151 cycles. Cette valeur est généralement identique au nombre de cycles de la lecture 1. } Index 1 : saisissez le nombre de cycles nécessaire pour le primer d’index 1 (i7). } Index 2 : saisissez le nombre de cycles nécessaire pour le primer d’index 2 (i5). Le logiciel de commande confirme vos saisies à l’aide des critères suivants : } Le nombre total de cycles ne dépasse pas le nombre total de cycles permis. } Les cycles de la lecture 1 sont supérieurs aux cinq cycles utilisés pour la génération du modèle. } Les cycles de lecture d’index ne dépassent pas les cycles de lecture 1 et de lecture 2. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA [Facultatif] Si vous utilisez des primers personnalisés, cochez la case correspondant aux primers utilisés. Pour plus de renseignements, consultez le Guide des primers personnalisés NextSeq (document nº 15057456). } Read 1 (Lecture 1) : primer personnalisé pour la lecture 1. } Read 2 (Lecture 2) : primer personnalisé pour la lecture 2. } Index 1 : primer personnalisé pour l’index 1. } Index 2 : primer personnalisé pour l’index 2. 7 [Facultatif] Sélectionnez l’icône Edit (Modifier) pour modifier les paramètres de l’analyse. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Save (Enregistrer). } Output folder location (Emplacement du dossier de sortie) : changer l’emplacement du dossier de sortie pour l’analyse en cours. Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l’emplacement réseau. } Purge consumables for this run (Éliminer les consommables pour cette analyse) : modifier ce réglage pour éliminer automatiquement les consommables après l’analyse en cours. } Use run monitoring for this run (Utiliser le suivi d’analyse pour cette analyse) : modifier le réglage pour activer le suivi d’analyse dans BaseSpace. 8 Sélectionnez Next (Suivant). Réviser la vérification automatisée Le logiciel effectue une vérification automatisée du système. Lors de la vérification, les indicateurs suivants s’affichent sur l’écran : } Crochet gris : la vérification n’a pas été encore effectuée. } } } Icône de progression : la vérification est en cours. Crochet vert : la vérification a réussi. Croix rouge : la vérification a échoué. Pour tous les éléments non validés, une action est nécessaire avant que vous puissiez continuer. Consultez la section Résoudre les erreurs de vérification automatique à la page 44. Pour arrêter une vérification automatisée en cours, sélectionnez l’icône située dans le coin inférieur droit. Pour redémarrer la vérification, sélectionnez l’icône reprend à la première vérification incomplète ou échouée. . La vérification Pour afficher les résultats de chaque vérification dans une catégorie, cliquez sur l’icône d’agrandissement de la catégorie. Démarrer l’analyse Une fois la vérification automatique terminée, sélectionnez Start (Démarrer). L’analyse de séquençage commence. Pour configurer le système afin de démarrer automatiquement l’analyse après une vérification réussie, consultez la section Personnaliser les paramètres de l’analyse à la page 14. Guide du système NextSeq 500 29 Configurer une analyse de séquençage 6 Séquençage Surveiller la progression de l’analyse 1 Surveillez la progression, les intensités et les scores de qualité de l’analyse à mesure que les indicateurs s’affichent à l’écran. Figure 21 Progression et indicateurs de l’analyse de séquençage Run Progress (Progression de l’analyse) : indique l’étape en cours et le nombre de cycles réalisés pour chaque lecture. La longueur de la barre de progression n’est pas proportionnelle au débit d’analyse de chaque étape. Utilisez le temps restant dans le coin supérieur droit pour déterminer la durée exacte. B Q-Score : indique la répartition des scores de qualité (Q-scores). Consultez Notation de la qualité à la page 62. C Intensity (Intensité) : indique la valeur de l’intensité des amplifiats du 90e percentile de chaque plaque. Les couleurs du tracé indiquent chaque base : A est rouge, C, vert, G, bleu et T, noir. Les couleurs correspondent aux indicateurs de bases utilisés dans le logiciel d’analyse de séquençage (SAV). D Cluster Density (K/mm²) (Densité des amplifiats [K/mm²]) : indique le nombre dʼamplifiats détectés pour lʼanalyse. E Clusters Passing Filter (%) (Amplifiats passant par le filtre [%]) : indique le pourcentage d’amplifiats passant par le filtre. Consultez la section Amplifiats passant par le filtre à la page 59. F Estimated Yield (Gb) (Estimation de rendement [Gb]) : indique le nombre de bases prévues pour l’analyse. G Image de la Flow Cell : indique le processus en cours sur chaque paire de lignes. Une paire de lignes est imagée tandis qu’une autre paire est à une étape de chimie. A REMARQUE Après avoir sélectionné Home (Accueil), il est impossible de revenir en arrière pour afficher les indicateurs de l’analyse. Toutefois, les indicateurs de l’analyse sont accessibles sur BaseSpace ou consultables depuis un ordinateur autonome à l’aide du visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Cycles des indicateurs de l’analyse Les } } } 30 indicateurs de l’analyse apparaissent à différents moments au cours d’une analyse. Aucun indicateur ne s’affiche au cours des étapes de génération d’amplifiats. Les cinq premiers cycles sont réservés à la génération du modèle. Les indicateurs de l’analyse apparaissent après le cycle 25, notamment la densité des amplifiats, les amplifiats passant par le filtre (PF), le rendement et les scores de qualité. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA En fonction de la configuration d’analyse sélectionnée, une icône s’affiche à l’écran au cours de l’analyse pour indiquer l’état du transfert de données. État Illumina BaseSpace BaseSpace Onsite Instrument autonome Connecté Connecté, transfert de données en cours Déconnecté Si le transfert de données est interrompu en cours d’analyse, les données sont stockées temporairement sur l’ordinateur de l’instrument. Une fois la connexion rétablie, le transfert de données reprend automatiquement. Si la connexion n’est pas rétablie avant la fin de l’analyse, supprimez manuellement les données de l’ordinateur de l’instrument manuellement avant le lancement d’une nouvelle analyse. Service de copie de l’analyse La suite logicielle du système NextSeq contient un service de copie de l’analyse. RTA v2 demande au service de copier des fichiers situés à un emplacement source vers un emplacement de destination; et le service traite les demandes de copie dans l’ordre d’arrivée. Si une exception survient, le fichier retourne en file d’attente de copie en fonction du nombre de fichiers contenus dans la file d’attente de copie. Visualiseur d’analyse de séquençage Le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV) affiche des indicateurs de séquençage générés au cours de l’analyse. Les indicateurs s’affichent sous forme de diagrammes, de graphiques et de tableaux qui s’appuient sur des données générées par le RTA et écrits sur des fichiers InterOp. Les indicateurs sont mis à jour pendant la progression de l’analyse. Sélectionnez Refresh (Actualiser) à tout moment pendant l’analyse pour afficher les indicateurs métriques à jour. Pour plus de renseignements, consultez le Guide de l’utilisateur du visualiseur d’analyse de séquençage (référence 15020619). Le SAV est inclus dans le logiciel installé sur l’ordinateur de l’instrument. Vous pouvez aussi installer le SAV sur un autre ordinateur associé au même réseau que l’instrument pour surveiller les indicateurs d’analyse à distance. Guide du système NextSeq 500 31 Surveiller la progression de l’analyse Transfert de données Séquençage Lavage automatique après analyse Une fois l’analyse de séquençage terminée, le logiciel lance un lavage automatique après analyse à l’aide d’une solution de lavage contenue dans la cartouche de tampon et de NaOCI contenu dans la cartouche de réactifs. Le lavage automatique après analyse dure 90 minutes environ. Une fois le lavage terminé, le bouton Home (Accueil) redevient actif. Les résultats du séquençage restent visibles à l’écran pendant le lavage. Après le lavage Après le lavage, les dispositifs dʼaspiration restent abaissés afin d’empêcher l’air de pénétrer dans le système. Laissez les cartouches en place jusqu’à l’analyse suivante. 32 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Chapitre 4 Maintenance Introduction Effectuer un lavage manuel Mises à jour logicielles Arrêter l’instrument Guide du système NextSeq 500 34 35 38 40 33 Chapitre 4 Maintenance Maintenance Introduction Les procédures de maintenance comprennent des lavages manuels de l’instrument et des mises à jour du logiciel du système lorsque celles-ci sont disponibles. } Lavages de l’instrument : un lavage automatique après analyse est lancé après chaque analyse de séquençage afin de maintenir les performances de l’instrument. Toutefois, il est nécessaire d’effectuer régulièrement un lavage manuel dans certaines conditions. Consultez la section Effectuer un lavage manuel à la page 35. } Mises à jour logicielles : quand une version mise à jour du logiciel du système est disponible, vous pouvez l’installer automatiquement en vous connectant à BaseSpace ou manuellement en téléchargeant le programme d’installation sur le site Web d’Illumina. Consultez la section Mises à jour logicielles à la page 38. Maintenance préventive Illumina vous recommande de planifier un service de maintenance préventive tous les ans. Si vous n’êtes pas lié par un contrat de services, veuillez communiquer avec le gestionnaire de compte de votre région ou l’assistance technique d’Illumina pour organiser un service de maintenance préventive facturable. 34 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Les lavages manuels sont initiés depuis l’écran d’accueil. Parmi les options de lavage figurent Quick Wash (Lavage rapide) et Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). Types de lavage Description Quick Wash (Lavage rapide) Rince le système avec une solution de lavage fournie par l’utilisateur composée d’eau de laboratoire et de Tween 20 (cartouche de lavage du tampon). Nécessaire tous les 14 jours lorsque l’instrument n’est pas utilisé ou après une mise hors tension. Durée : 20 minutes Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse) Durée : 90 minutes Rince le système avec une solution de lavage fournie par l’utilisateur composée d’eau de laboratoire et de Tween 20 (cartouche de lavage du tampon) ainsi que d’hypochlorite de sodium à 0,12 % (cartouche de lavage des réactifs). Nécessaire lorsque le lavage automatique après analyse n’a pas été effectué. Un lavage manuel nécessite l’utilisation de la cartouche de lavage des réactifs et de la cartouche de lavage du tampon qui sont fournies avec l’instrument, ainsi que d’une Flow Cell usagée. Une Flow Cell usagée peut être utilisée jusqu’à 20 fois pour des lavages de l’instrument. Figure 22 Cartouche de lavage des réactifs et cartouche de lavage du tampon Préparer un lavage manuel après analyse Consommables fournis par l’utilisateur Volume et description • NaOCl 1 ml, dilution à 0,12 % Chargé dans la cartouche de lavage de réactifs (position nº 28) • Tween 20 à 100 % • Eau de laboratoire Utilisée pour préparer une solution de lavage Tween 20 à 0,05 % de 125 ml Chargée dans la cartouche de lavage du tampon (réservoir central) Guide du système NextSeq 500 35 Effectuer un lavage manuel Effectuer un lavage manuel Maintenance REMARQUE Utilisez toujours une nouvelle dilution de NaOCI préparée au cours des dernières 24 heures. Si vous préparez un volume supérieur à 1 ml, stockez la dilution restante entre 2 et 8 °C pour une utilisation dans les 24 heures suivantes. Sinon, jetez la dilution de NaOCl restante. 1 Combinez les volumes suivants dans un microtube à centrifuger pour obtenir 1 ml de NaoCl à 0,12 % : } NaOCl à 5 % (24 µl) } Eau de laboratoire (976 µl) 2 Retournez le tube pour mélanger. 3 Ajoutez 1 ml de NaOCI à 0,12 % à la cartouche de lavage des réactifs. Le réservoir approprié est équivalent à la position nº 28 de la cartouche préremplie. Figure 23 Charger le NaOCl 4 Combinez les volumes suivants afin d’obtenir une solution de lavage de Tween 20 à 0,05 % : } Tween 20 à 100 % (62 µl) } Eau de laboratoire (125 ml) 5 Ajoutez 125 ml de solution de lavage dans le réservoir central de la cartouche de lavage du tampon. 6 Sélectionnez Perform Wash (Procéder au lavage), puis sélectionnez Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). Préparer un lavage rapide Consommables fournis par l’utilisateur • Tween 20 à 100 % • Eau de laboratoire 36 Volume et description Utilisée pour préparer une solution de lavage Tween 20 à 0,05 % de 40 ml Chargée dans la cartouche de lavage du tampon (réservoir central) 1 Combinez les volumes suivants afin d’obtenir une solution de lavage de Tween 20 à 0,05 % : } Tween 20 à 100 % (20 µl) } Eau de laboratoire (40 ml) 2 Ajoutez 40 ml de solution de lavage dans le réservoir central de la cartouche de lavage du tampon. 3 Sélectionnez Perform Wash (Procéder au lavage), puis sélectionnez Quick Wash (Lavage rapide). Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA 1 En l’absence de Flow Cell usagée, chargez une Flow Cell usagée. Sélectionnez Load (Charger), puis sélectionnez Next (Suivant). 2 Retirez le réservoir à réactifs usagés et jetez son contenu conformément aux normes en vigueur. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Manipulez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements sur l’environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse, mise à votre disposition à l’adresse support.illumina.com/sds.html. 3 Faites glisser le réservoir à réactifs usagés vide dans le compartiment de tampon jusqu’à la butée. 4 Retirez la cartouche de tampon usagée de la précédente analyse, le cas échéant. 5 Chargez la cartouche de lavage du tampon contenant la solution de lavage. 6 Retirez la cartouche de réactifs usagée de la précédente analyse, le cas échéant. 7 Chargez la cartouche de lavage des réactifs. 8 Sélectionnez Next (Suivant). La vérification avant lavage démarre automatiquement. Démarrer le lavage 1 Sélectionnez Start (Démarrer). 2 À la fin du lavage, sélectionnez Home (Accueil). Après le lavage Après le lavage, les dispositifs dʼaspiration restent abaissés afin d’empêcher l’air de pénétrer dans le système. Laissez les cartouches en place jusqu’à l’analyse suivante. Guide du système NextSeq 500 37 Effectuer un lavage manuel Charger une Flow Cell usagée et les cartouches de lavage Maintenance Mises à jour logicielles Les mises à jour logicielles font partie d’une suite logicielle appelée System Suite qui comprend les logiciels suivants : } NextSeq Control Software (NCS) } NextSeq recipes } RTA v2 } NextSeq Service Software (NSS) } Visualiseur d’analyse de séquençage (SAV) } BaseSpace Broker Vous pouvez installer les mises à jour logicielles automatiquement à l’aide d’une connexion Internet ou manuellement à partir d’un emplacement réseau ou USB. } Mises à jour automatiques : pour les instruments connectés à un réseau doté d’un } accès à Internet, une icône d’alerte s’affiche sur le bouton Manage Instrument (Gérer l’instrument) situé sur l’écran d’accueil lorsqu’une mise à jour est disponible. Mises à jour manuelles : téléchargez le programme d’installation System Suite sur la page d’aide du système NextSeq 500 sur le site Web Illumina. Mise à jour automatique des logiciels 1 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument). 2 Sélectionnez Software Update (Mise à jour logicielle). 3 Sélectionnez Install the update already downloaded from BaseSpace (Installer la mise à jour téléchargée auparavant à partir de BaseSpace). 4 Sélectionnez Update (Mettre à jour) pour commencer la mise à jour. Une boîte de dialogue apparaît pour la confirmation de la commande. 5 Suivez les invites de l’assistant d’installation : a b c Acceptez l’accord de licence. Lisez les notes de mise à jour. Consultez la liste des logiciels inclus dans la mise à jour. Le logiciel de commande redémarre automatiquement une fois la mise à jour logicielle effectuée. REMARQUE Si une mise à jour du micrologiciel est incluse, un redémarrage automatique du système est nécessaire une fois le micrologiciel mis à jour. Mise à jour manuelle des logiciels 38 1 Téléchargez le fichier d’installation de System Suite sur le site Web d’Illumina et enregistrez-le dans un emplacement réseau. Vous pouvez également copier le fichier d’installation du logiciel sur une clé USB. 2 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument). 3 Sélectionnez Software Update (Mise à jour logicielle). 4 Sélectionnez Manually install the update from the following location (Installer manuellement la mise à jour à partir de l’emplacement suivant). Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Sélectionnez Browse (Parcourir) pour accéder à l’emplacement du fichier d’installation du logiciel, puis sélectionnez Update (Mise à jour). 6 Suivez les invites de l’assistant d’installation : a b c Acceptez l’accord de licence. Lisez les notes de mise à jour. Consultez la liste des logiciels inclus dans la mise à jour. Le logiciel de commande redémarre automatiquement une fois la mise à jour logicielle effectuée. REMARQUE Si une mise à jour du micrologiciel est incluse, un redémarrage automatique du système est nécessaire une fois le micrologiciel mis à jour. Guide du système NextSeq 500 39 Mises à jour logicielles 5 Maintenance Arrêter l’instrument 1 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l’instrument). 2 Sélectionnez System Power Options (Options d’alimentation du système). 3 Sélectionnez Shut Down (Arrêter). La commande d’arrêt ferme le logiciel de manière sûre et coupe l’alimentation de l’instrument. Attendez au moins 60 secondes avant de rallumer l’instrument. ATTENTION Ne déplacez pas l’instrument. Un déplacement inapproprié de l’instrument peut avoir un impact sur l’alignement optique et compromettre l’intégrité des données. Si vous devez déplacer l’instrument, communiquez avec votre représentant Illumina. 40 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Annexe A Dépannage Introduction Fichiers de dépannage Résoudre les erreurs de vérification automatique Réservoir à réactifs usagés plein Flux de travail de réhybridation Formules personnalisées et dossiers de formules Vérification du système Message d’erreur RAID Configurer les paramètres du système Guide du système NextSeq 500 42 43 44 46 47 50 51 54 55 41 Annexe A Dépannage Dépannage Introduction En cas de questions techniques, consultez les pages dʼassistance du NextSeq 500 sur le site Web d’Illumina. Les pages d’assistance fournissent un accès à la documentation, aux téléchargements et aux foires aux questions. Connectez-vous à votre compte MyIllumina pour accéder aux bulletins d’assistance. En cas de problème avec la qualité ou la performance de l’analyse, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Consultez la section Assistance technique à la page 73. Il est possible de partager un lien vers le résumé d’analyse dans BaseSpace avec l’assistance technique d’Illumina pour faciliter le dépannage. 42 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Le représentant de lʼassistance technique d’Illumina peut vous demander de fournir des copies des fichiers propres à lʼanalyse ou propres au balayage afin de résoudre les problèmes. Généralement, les fichiers suivants sont utilisés pour le dépannage. Fichier clé Dossier Description Fichier de renseignements sur l’analyse (RunInfo.xml) Dossier racine Comprend les renseignements suivants : • Nom de l’analyse • Nombre de cycles de l’analyse • Nombre de cycles pour chaque lecture • Si la lecture est une lecture indexée • Nombre de témoins et de plaques sur la Flow Cell Fichier des paramètres de l’analyse (RunParameters.xml) Dossier racine Contient des renseignements concernant les paramètres et les composants des analyses. Parmi les renseignements figurent le RFID, le numéro de série, la référence et la date de péremption. Fichiers de configuration RTA (RTAConfiguration.xml) Data\Intensities Comprend les paramètres de configuration RTA pour l’analyse. Le fichier RTAConfiguration.xml est créé au début de l’analyse. Fichiers InterOp (*.bin) InterOp Ces fichiers de rapport binaires sont utilisés par le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Les fichiers InterOp sont mis à jour tout au long de l’analyse. Fichiers journaux Logs Les fichiers journaux décrivent chaque étape effectuée par l’instrument au cours de chaque cycle et répertorient les versions de logiciels et de micrologiciels utilisées lors de l’analyse. Le fichier nommé [NomInstrument]_CurrentHardware.csv répertorie les numéros de série des composants de l’instrument. Fichiers journaux des erreurs (*ErrorLog*.txt) Journaux RTA Journal des erreurs RTA. Les fichiers journaux des erreurs sont mis à jour à chaque fois qu’une erreur se produit. Fichiers journaux globaux (*GlobalLog*.tsv) Journaux RTA Journal de tous les événements RTA. Les fichiers journaux globaux sont mis à jour tout au long de l’analyse. Fichiers journaux des lignes (*LaneLog*.txt) Journaux RTA Journal des événements RTA en cours. Les fichiers journaux des lignes sont mis à jour tout au long de l’analyse. Erreurs RTA Pour résoudre les erreurs RTA, vérifiez d’abord le journal des erreurs RTA, qui est stocké dans le dossier RTALogs. Ce fichier n’est pas présent pour les analyses réussies. Joignez le journal des erreurs lors du signalement des problèmes à l’assistance technique d’Illumina. Guide du système NextSeq 500 43 Fichiers de dépannage Fichiers de dépannage Dépannage Résoudre les erreurs de vérification automatique Si des erreurs se produisent au cours de la vérification automatique, utilisez les recommandations d’action suivantes pour résoudre l’erreur. Si une vérification avant analyse échoue, le RFID de la cartouche de réactifs n’est pas verrouillé et peut être utilisé pour une nouvelle analyse. Cependant, le RFID est verrouillé une fois que les opercules en aluminium sont percés. 44 Vérifications du système Action recommandée Doors Closed (Portes fermées) Assurez-vous que les portes du compartiment sont fermées. Consumables Loaded (Consommables chargés) Les capteurs des consommables n’enregistrent rien. Assurezvous que chaque consommable est correctement chargé. Sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse), sélectionnez Back (Retour) pour retourner à l’étape de chargement, puis répétez la configuration de l’analyse. Required Software (Logiciel requis) Des composants critiques du logiciel sont manquants. Effectuez une mise à jour manuelle pour restaurer tous les composants du logiciel. Instrument Disk Space (Espace disque de l’instrument) Le disque dur de l’instrument n’a pas assez d’espace disponible pour réaliser l’analyse. Il est possible que les données provenant d’une analyse précédente n’aient pas été transférées. Effacez les données d’analyse du disque dur de l’instrument. Network Connection (Connexion réseau) La connexion réseau a été interrompue. Vérifiez l’état du réseau et la connexion au réseau physique. Network Disk Space (Espace disque réseau) Soit le compte BaseSpace est plein, soit le serveur réseau est plein. Température Action recommandée Temperature (Température) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Temperature Sensors (Capteurs de température) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Fans (Ventilateurs) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Système d’imagerie Action recommandée Imaging Limits (Limites de l’imagerie) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Z Steps-and-Settle (Étapes et installation Z) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Bit Error Rate (Taux d’erreur binaire) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Action recommandée Flow Cell Registration (Enregistrement de la Flow Cell) Il est possible que la Flow Cell ne soit pas correctement positionnée. • Sur les écrans Run Setup (Configuration de l’analyse), sélectionnez Back (Retour) pour retourner à l’étape de la Flow Cell. La porte du compartiment d’imagerie s’ouvre. • Déchargez et rechargez la Flow Cell pour vous assurer qu’elle est correctement positionnée. Distribution des réactifs Action recommandée Valve Response (Réponse de la vanne) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Pump (Pompe) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Buffer Mechanism (Mécanisme du tampon) Communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Spent Reagents Empty (Réactifs usagés vides) Videz le réservoir à réactifs usagés et rechargez le réservoir vide. Guide du système NextSeq 500 Résoudre les erreurs de vérification automatique Système d’imagerie 45 Dépannage Réservoir à réactifs usagés plein Commencez toujours une analyse avec un réservoir à réactifs usagés vide. Si vous commencez une analyse sans avoir vidé le réservoir des réactifs usagés, les capteurs du système poussent le logiciel à interrompre l’analyse lorsque le réservoir est plein. Les capteurs du système ne peuvent pas interrompre une analyse durant la génération d’amplifiats, la resynthèse des paires de bases ou le lavage automatique après analyse. Lorsque l’analyse est interrompue, une boîte de dialogue s’affiche et fournit des options permettant de relever les dispositifs d’aspiration et de vider le réservoir plein. Vider le réservoir des réactifs usagés 46 1 Sélectionnez Raise Sippers (Soulever les dispositifs d’aspiration). 2 Retirez le réservoir à réactifs usagés et jetez le contenu de manière appropriée. 3 Remettez le réservoir vide dans le compartiment de tampon. 4 Sélectionnez Continue (Continuer). L’analyse reprend automatiquement. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Une analyse de réhybridation peut être nécessaire si les indicateurs générés au cours des quelques premiers cycles montrent des intensités inférieures à 2 500. Certaines librairies à faible diversité peuvent montrer des intensités inférieures à 1 000, ce qui est attendu et ne peut pas être résolu par une réhybridation. REMARQUE L’utilisation de la commande End Run (Terminer l’analyse) est définitive. L’analyse ne peut pas reprendre, les consommables de l’analyse ne peuvent pas être réutilisés et les données de séquençage ne sont pas enregistrées. Lorsque vous arrêtez une analyse, le logiciel effectue les étapes suivantes avant de terminer l’analyse : } Place la Flow Cell en état de sécurité. } Débloque l’identification par radiofréquence (RFID) de la Flow Cell pour une analyse ultérieure. } Attribue une date de péremption de réhybridation à la Flow Cell. } Écrit les journaux d’analyse pour les cycles terminés. Un délai est normal. } Saute le lavage après analyse automatique. Lorsque vous lancez une analyse de réhybridation, le logiciel effectue les étapes suivantes pour effectuer l’analyse : } Crée un dossier d’analyse basé sur le nom unique de l’analyse. } Vérifie que la date de réhybridation de la Flow Cell n’est pas dépassée. } Amorce les réactifs. Un délai est normal. } Passe l’étape de génération d’amplifiats. } Retire le primer de lecture 1 précédent. } Hybride un nouveau primer de lecture 1. } Continue la lecture 1 et le reste de l’analyse selon les paramètres de l’analyse spécifiés. À quel moment arrêter une analyse pour réhybridation Une réhybridation ultérieure est possible uniquement si vous arrêtez l’analyse aux points suivants : } Après le cycle 5 : les intensités apparaissent après l’enregistrement du modèle, qui nécessite les 5 premiers cycles du séquençage. Bien qu’il soit considéré sûr d’arrêter une analyse après le cycle 1, il est recommandé d’arrêter après le cycle 5. N’arrêtez pas une analyse au cours de la génération d’amplifiats. } Lecture 1 ou lecture d’index 1 : arrêtez l’analyse avant que ne commence la resynthèse des paires de bases appariées. La Flow Cell ne peut pas être enregistrée pour une réhybridation ultérieure après le début de la resynthèse des paires de bases appariées. Consommables requis Une analyse de réhybridation nécessite une nouvelle cartouche de réactifs et une nouvelle cartouche de tampon NextSeq, quel que soit le moment où l’analyse a été arrêtée. Guide du système NextSeq 500 47 Flux de travail de réhybridation Flux de travail de réhybridation Dépannage Arrêter l’analyse en cours 1 Sélectionnez End Run (Arrêter l’analyse). Lorsque vous êtes invité à confirmer la commande, sélectionnez Yes (Oui). 2 Lorsque vous êtes invité à enregistrer la Flow Cell, sélectionnez Yes (Oui). Notez la date de péremption de réhybridation. 3 Retirez la Flow Cell enregistrée et placez-la à une température comprise entre 2 °C et 8 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer l’analyse de réhybridation. REMARQUE Vous pouvez stocker la Flow Cell jusqu’à sept jours à une température comprise entre 2 °C et 8 °C dans un étui de protection à rabat en plastique sans l’emballage dessiccant. Pour de meilleurs résultats, réhybridez la Flow Cell enregistrée sous 3 jours. Effectuer un lavage manuel 1 Sur l’écran d’accueil, sélectionnez Perform Wash (Procéder au lavage). 2 Dans l’écran Wash Selection (Sélection de lavage), sélectionnez Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). Consultez la section Effectuer un lavage manuel à la page 35. REMARQUE Si vous n’avez pas retiré la cartouche de réactifs et la cartouche de tampon de l’analyse arrêtée, vous pouvez les utiliser pour le lavage manuel. Sinon, effectuez le lavage manuel à l’aide de la cartouche de lavage des réactifs et de la cartouche de lavage du tampon. Configurer une nouvelle analyse dans l’onglet Prep (Préparation) de BaseSpace 1 Si l’instrument est configuré pour BaseSpace ou BaseSpace Onsite, configurez une nouvelle analyse sous l’onglet Prep (Préparation) en utilisant les mêmes paramètres que ceux de l’analyse d’origine. ASTUCE Cliquez sur l’onglet Pools (Groupements), sélectionnez l’identifiant de groupement pertinent pour conserver les paramètres de l’analyse précédente, puis assignez un nom unique pour la nouvelle analyse. 48 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA 1 Préparez une nouvelle cartouche de réactifs. 2 Si la Flow Cell enregistrée a été stockée, laissez-la atteindre la température ambiante (15 à 30 minutes). 3 Nettoyez et chargez la Flow Cell enregistrée. 4 Retirez le réservoir à réactifs usagés et jetez le contenu de façon appropriée, puis rechargez le flacon vide. 5 Chargez la nouvelle cartouche de tampon et la nouvelle cartouche de réactifs. 6 Sur l’écran Run Setup (Configuration de l’analyse), sélectionnez l’une des options suivantes : } BaseSpace ou BaseSpace Onsite : sélectionnez l’analyse et confirmez les paramètres de l’analyse. } Standalone (Autonome) : saisissez le nom de l’analyse et spécifiez des paramètres identiques à ceux de l’analyse d’origine. 7 Sélectionnez Next (Suivant) pour effectuer une vérification avant analyse, puis démarrez l’analyse. Guide du système NextSeq 500 49 Flux de travail de réhybridation Configurer une analyse sur l’instrument Dépannage Formules personnalisées et dossiers de formules Ne modifiez pas les formules d’origine. Enregistrez toujours la formule d’origine sous un nouveau nom. Si une formule originale est modifiée, l’utilitaire de mise à jour du logiciel ne peut plus reconnaître la formule pour les mises à jour ultérieures et les versions plus récentes ne sont pas installées. Enregistrez les formules personnalisées dans le dossier de formules approprié. Les dossiers de formules sont organisés comme suit. Custom High : formules personnalisées utilisées avec une trousse de débit élevé. Mid : formules personnalisées utilisées avec une trousse de débit moyen. High : formules d’origine utilisées avec une trousse de débit élevé. Mid : formules d’origine utilisées avec une trousse de débit moyen. Wash : contient la formule de lavage manuel. 50 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Une vérification du système n’est pas nécessaire pour un fonctionnement normal ou pour la maintenance de l’instrument. Toutefois, un représentant de l’assistance technique d’Illumina peut vous demander de réaliser une vérification du système à des fins de dépannage. REMARQUE Si un lavage de l’instrument est prévu, effectuez le lavage avant de lancer une vérification du système. Lancer une vérification du système ferme automatiquement le logiciel de contrôle et lance le NextSeq Service Software (NSS). Le logiciel de service se lance et ouvre l’écran Load (Charger), qui est configuré pour une utilisation de l’option de chargement avancé. Figure 24 Vérifications du système disponibles Les cases non cochées sur l’écran Select (Sélectionner) indiquent les tests nécessitant l’assistance d’un représentant de terrain d’Illumina. Réaliser une vérification du système 1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Check (Vérification du système). Lorsque vous êtes invité à fermer le logiciel de commande avant de poursuivre, sélectionnez Yes (Oui). 2 Chargez les consommables comme suit : a b c d Si une Flow Cell usagée ne se trouve pas déjà sur l’instrument, chargez une Flow Cell usagée. Videz le réservoir de réactifs usagés et repositionnez-le sur l’instrument. Chargez la cartouche de lavage du tampon contenant 120 ml d’eau de laboratoire dans le réservoir central. Chargez la cartouche de lavage des réactifs. Vérifiez que la cartouche de lavage des réactifs est vide et propre. 3 Sélectionnez Load (Charger). Le logiciel positionne la Flow Cell et la cartouche de lavage des réactifs. Sélectionnez Next (Suivant). 4 Sélectionnez Next (Suivant). La vérification du système commence. Guide du système NextSeq 500 51 Vérification du système Vérification du système Dépannage 5 [Facultatif] Lorsque la vérification du système est terminée, sélectionnez View (Afficher) en regard du nom de la vérification pour afficher les valeurs associées à chaque vérification. 6 Sélectionnez Next (Suivant). Le rapport de vérification du système s’ouvre. 7 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer le rapport dans un fichier zippé. Naviguez vers un emplacement sur le réseau pour enregistrer le fichier. 8 Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Exit (Quitter). 9 Lorsque vous êtes invité à fermer le logiciel de service et à redémarrer le logiciel de commande, sélectionnez Yes (Oui). Le logiciel de commande redémarre automatiquement. Vérifications du mouvement Vérification du système Description BSM Vérifie le gain et la distance du mécanisme de conduite des compartiments (BSM) afin de confirmer que le module fonctionne correctement. FCLM et FAM Vérifie le gain et la distance du mécanisme de chargement de la Flow Cell (FCLM) et du module d’automatisation des liquides (FAM) pour confirmer que les modules fonctionnent correctement. Stage Tests (Tests de la platine) Vérifie les limites de parcours et les performances de la platine XY et des six platines Z, une pour chaque caméra. Vérification des composants optiques Vérification du système Flow Cell Registration (Enregistrement de la Flow Cell) Description Mesure l’inclinaison de la lame sur un plan optique, teste les fonctionnalités de la caméra, teste le module d’imagerie et vérifie l’enregistrement de la Flow Cell dans la position correcte d’imagerie. Vérifications de la fluidique 52 Vérification du système Description Valve Response (Réponse de la vanne) Vérifie la précision des mouvements de la vanne et de la pompe ainsi que l’amplitude de mouvement de la seringue de la pompe. Pressure Decay (Perte de pression) Vérifie le taux de fuite d’un système fluidique étanche, afin de confirmer que la Flow Cell est insérée correctement en position de séquençage. Flow Rate (Débit) Vérifie la fonctionnalité des capteurs de bulles, qui servent à détecter la présence d’air dans les lignes de réactifs. Mesure les débits pour vérifier la présence d’occlusions ou de fuites. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Vérification du système Description Fans (Ventilateurs) Vérifie la vitesse des ventilateurs du système en impulsions par minute (imp/min) pour confirmer que les ventilateurs fonctionnent. Les ventilateurs qui ne fonctionnent pas renvoient une valeur négative. Thermal Probes (Sondes thermiques) Vérifie la température moyenne de chaque capteur thermique. Les capteurs thermiques qui ne fonctionnent pas renvoient une valeur négative. Guide du système NextSeq 500 53 Vérification du système Vérifications thermiques Dépannage Message d’erreur RAID L’ordinateur du système NextSeq est équipé de deux disques durs. Si un disque dur cesse de fonctionner, le système génère un message d’erreur RAID et vous suggère de prendre contact avec l’assistance technique d’Illumina. Dans la plupart des cas, le remplacement du disque dur est nécessaire. Vous pouvez continuer la procédure de configuration de l’analyse et les opérations normales. Le but de ce message est de pouvoir planifier à l’avance une visite de service pour éviter des interruptions durant le fonctionnement normal de l’instrument. Pour continuer, sélectionnez Acknowledge (Accuser réception), puis Close (Fermer). 54 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Le système est configuré lors de l’installation. Toutefois, si une modification est nécessaire ou si le système doit être reconfiguré, utilisez les options de configuration du système. } Configuration réseau : fournit des options de paramètres de l’adresse IP, d’adresse de serveur de noms de domaine (DNS), de nom d’ordinateur et de nom de domaine. } Configuration BaseSpace : fournit des options de méthodes d’analyse, y compris BaseSpace, BaseSpace Onsite, le mode autonome et la surveillance de l’analyse dans BaseSpace, ainsi que des paramètres d’identifiants BaseSpace par défaut et de création de rapports sur la santé de l’instrument. Définir la configuration réseau 1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Configuration (Configuration du système). 2 Sélectionnez Network Configuration (Configuration du réseau). 3 Sélectionnez Obtain an IP address automatically (Obtenir automatiquement une adresse IP) pour récupérer l’adresse IP sur un serveur DHCP. REMARQUE Le protocole DHCP (Dynamic Host Configuration Protocol) est un protocole réseau standard utilisé sur les réseaux IP afin de distribuer les paramètres de configuration du réseau de manière dynamique. Sinon, sélectionnez Use the following IP address (Utiliser l’adresse IP suivante) pour connecter manuellement l’instrument à un autre serveur de la manière suivante. Communiquez avec votre administrateur réseau pour obtenir les adresses spécifiques à votre installation. } Saisissez l’adresse IP. L’adresse IP est une série de quatre nombres séparés par des points, par exemple 168.62.20.37. } Saisissez le masque de sous-réseau, qui est une subdivision du réseau IP. } Saisissez l’adresse de la passerelle par défaut, c’est-à-dire le routeur du réseau qui se connecte à Internet. 4 Sélectionnez Obtain a DNS address automatically (Obtenir automatiquement une adresse DNS) pour connecter l’instrument au serveur de nom de domaine associé à l’adresse IP. Sinon, sélectionnez Obtain a DNS address automatically (Obtenir automatiquement une adresse DNS) pour connecter manuellement l’instrument au serveur de nom de domaine de la manière suivante. } Saisissez les adresses DNS préférées. L’adresse DNS est le nom du serveur utilisé pour traduire les noms de domaine en adresses IP. } Saisissez l’adresse DNS secondaire. L’adresse secondaire est utilisée si le DNS préféré ne peut pas traduire un nom de domaine particulier en adresse IP. 5 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à l’écran Computer (Ordinateur). REMARQUE Le nom de l’ordinateur de l’instrument est attribué à l’ordinateur de l’instrument au moment de sa fabrication. Toute modification du nom de l’ordinateur peut avoir un impact sur la connectivité et nécessite un administrateur réseau. 6 Connectez l’ordinateur de l’instrument à un domaine ou à un groupe de travail de la manière suivante. Guide du système NextSeq 500 55 Configurer les paramètres du système Configurer les paramètres du système Dépannage } Pour les instruments connectés à Internet : sélectionnez Member of domain (Membre du domaine), puis saisissez le nom du domaine associé à la connexion Internet au niveau de votre installation. Les modifications de domaine nécessitent le nom d’utilisateur et le mot de passe d’un administrateur. } Pour les instruments non connectés à Internet : sélectionnez Member of work group (Membre du groupe de travail), puis saisissez le nom du groupe de travail. Le nom du groupe de travail est propre à votre établissement. 7 Sélectionnez Save (Enregistrer). Définir la configuration BaseSpace 56 1 Dans l’écran Manage Instrument (Gérer l’instrument), sélectionnez System Configuration (Configuration du système). 2 Sélectionnez BaseSpace Configuration (Configuration de BaseSpace). 3 Sélectionnez l’une des options suivantes pour définir un emplacement où les données seront envoyées pour une analyse ultérieure. } Sélectionnez BaseSpace pour envoyer les données de séquençage à l’environnement BaseSpace d’Illumina. [Facultatif] Cochez la case Output Folder (Dossier de sortie), sélectionnez Browse (Parcourir), puis accédez à un emplacement réseau secondaire où les fichiers BCL seront enregistrés en plus de BaseSpace. } Sélectionnez l’option BaseSpace Onsite. Dans le champ Server Name (Nom du serveur), saisissez le chemin complet de votre serveur BaseSpace Onsite. [Facultatif] Cochez la case Output Folder (Dossier de sortie), sélectionnez Browse (Parcourir), puis accédez à un emplacement réseau secondaire où les fichiers BCL seront enregistrés en plus du serveur BaseSpace Onsite. } Sélectionnez Standalone instrument (Instrument autonome) pour enregistrer les données uniquement vers un emplacement réseau. Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l’emplacement réseau de votre choix. Le logiciel de commande génère automatiquement le nom du dossier de sortie. } [Facultatif] Sélectionnez Use Run Monitoring (Utiliser la surveillance d’analyse) pour surveiller l’analyse à l’aide des outils de visualisation de BaseSpace. Des identifiants de connexion BaseSpace ainsi qu’une connexion Internet sont nécessaires. 4 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour passer à l’écran BaseSpace. 5 Si vous avez sélectionné BaseSpace ou BaseSpace Onsite, réglez les paramètres BaseSpace de la manière suivante. } Saisissez les paramètres User Name (Nom d’utilisateur) et Password (Mot de passe) de BaseSpace afin d’enregistrer l’instrument auprès de BaseSpace. } Sélectionnez Use default login and bypass the BaseSpace login screen (Utiliser la connexion par défaut et passer l’écran de connexion BaseSpace) pour définir le nom d’utilisateur et le mot de passe enregistrés en tant qu’identifiants de connexion par défaut. Ce réglage permet de passer outre l’écran BaseSpace lors de la configuration de l’analyse. 6 Si vous avez sélectionné BaseSpace, sélectionnez Send instrument health information to Illumina (Envoyer des renseignements sur l’état de l’instrument à Illumina) pour envoyer des fichiers journaux à Illumina. Cette option n’est pas disponible avec BaseSpace Onsite. 7 Sélectionnez Save (Enregistrer). Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Annexe B Real-Time Analysis Présentation de Real-Time Analysis Flux de travail de Real-Time Analysis Fichiers de sortie de séquençage Plaques de la Flow Cell Structure du dossier de sortie Guide du système NextSeq 500 58 60 63 65 68 57 Annexe B Real-Time Analysis Real-Time Analysis Présentation de Real-Time Analysis Le NextSeq 500 utilise une version du logiciel Real-Time Analysis (RTA) appelée RTA v2. RTA v2 fonctionne sur l’ordinateur de l’instrument. Il extrait les intensités à partir des images, réalise la définition des bases et lui attribue des scores de qualité. RTA v2 communique avec le logiciel de commande par le biais d’une interface Web HTTP et de fichiers mémoire partagés. Si RTA v2 est arrêté, il ne reprend pas le traitement et les données de l’analyse ne sont pas enregistrées. REMARQUE Les performances de démultiplexage ne sont pas calculées. L’onglet Index du visualiseur d’analyse de séquençage (SAV) n’est donc pas rempli. Entrées de RTA v2 RTA v2 nécessite les entrées suivantes pour le traitement : } Les images des plaques contenues dans la mémoire locale du système. } RunInfo.xml, qui est généré automatiquement au début de l’analyse et fournit le nom de l’analyse, le nombre de cycles, l’état d’indexation d’une lecture ainsi que le nombre de plaques sur la Flow Cell. } RTA.exe.config, qui est un fichier de configuration logicielle au format XML. RTA v2 reçoit des commandes du logiciel de commande indiquant l’emplacement du fichier RunInfo.xml et si un dossier de sortie facultatif est spécifié. Fichiers de sortie RTA v2 Les images de chaque canal passent dans la mémoire sous forme de plaques. La plaque est une petite zone d’imagerie sur la Flow Cell qui constitue pour la caméra l’unité de vision. À partir de ces images, le logiciel produit des fichiers de sortie qui prennent la forme d’un ensemble de fichiers de définition des bases dont la qualité est notée et de fichiers de filtrage. Tous les autres fichiers supportent les fichiers de sortie. 58 Type de fichiers Description Fichiers de définition des bases Chaque plaque qui est analysée est incluse dans un fichier cumulé de définition des bases (*.bcl) pour chaque ligne et chaque cycle. Le fichier cumulé de définition des bases contient la définition des bases ainsi que le score de qualité associé à chaque amplifiat dans cette ligne. Fichiers de filtrage Chaque plaque produit des renseignements sur le filtre qui sont rassemblés dans un fichier de filtrage (*.filter) pour chaque ligne. Le fichier de filtrage spécifie si un amplifiat a franchi les filtres. Fichier d’emplacement des amplifiats Les fichiers d’emplacement des amplifiats (*.locs) contiennent les coordonnées X et Y de chaque amplifiat dans une plaque. Lors de la génération du modèle, un fichier d’emplacement des amplifiats est créé pour chaque ligne. Fichiers index de définition des bases Un fichier d’index de définition des bases (*.bci) est produit pour chaque ligne afin de préserver les renseignements originaux sur la plaque. Le fichier d’index contient une paire de valeurs pour chaque plaque, qui sont respectivement le numéro de cette plaque et le nombre d’amplifiats qu’elle contient. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA RTA v2 fournit des indicateurs en temps réel sur la qualité de l’analyse, stockés dans des fichiers InterOp. Les fichiers InterOp sont des fichiers de sortie binaires contenant des indicateurs relatifs aux plaques, aux cycles et au niveau de lecture nécessaires pour afficher des indicateurs en temps réel en utilisant le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Pour la dernière version du SAV, consultez la page de téléchargement du SAV sur le site Web d’Illumina. Amplifiats passant par le filtre Au cours de l’analyse, RTA v2 filtre les données brutes pour supprimer les lectures non conformes au seuil de qualité des données. Les amplifiats qui se chevauchent et ceux de mauvaise qualité sont supprimés. Dans le cas d’une analyse sur deux canaux, RTA v2 utilise un système basé sur une population pour déterminer la pureté d’une définition des bases. Les amplifiats franchissent le filtre (PF) lorsqu’une définition des bases au cours des 25 premiers cycles a une pureté de < 0,63. Les bases des amplifiats qui ne franchissent pas le filtre ne sont pas définies. Gestion des erreurs RTA v2 crée des fichiers journaux et les écrit dans le dossier RTALogs. Les erreurs sont enregistrées dans des fichiers d’erreur au format de fichier *.tsv. Les fichiers journaux et d’erreur suivants sont transférés vers leur emplacement final de sortie à la fin du traitement : } *GlobalLog*.tsv récapitule les événements importants survenus pendant l’analyse. } *LaneNLog*.tsv répertorie les événements relatifs au traitement de chaque ligne. } *Error*.tsv répertorie les erreurs survenues au cours d’une analyse. } *WarningLog*.tsv répertorie les avertissements reçus au cours d’une analyse. Guide du système NextSeq 500 59 Présentation de Real-Time Analysis Les fichiers de sortie sont utilisés pour une analyse en aval dans BaseSpace. Vous pouvez aussi utiliser le logiciel de conversion bcl2fastq pour la conversion FASTQ, ainsi que des solutions d’analyse tierces. NextSeq Les fichiers nécessitent bcl2fastq v2.0 ou ultérieure. Pour la dernière version de bcl2fastq, consultez la page de téléchargement de NextSeq sur le site Web d’Illumina. Real-Time Analysis Flux de travail de Real-Time Analysis Génération du modèle Établit les emplacements des amplifiats. Enregistrement et extraction des intensités Enregistre l’emplacement de chaque amplifiat sur la Flow Cell et détermine une valeur d’intensité pour chaque amplifiat. Correction de la mise en phase Corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase. Définition des bases Détermine une définition des bases pour chaque amplifiat. Notation de la qualité Attribue un score de qualité à chaque définition des bases. Génération du modèle La première étape du flux de travail RTA est la génération du modèle, qui définit la position de chaque amplifiat dans une plaque à l’aide des coordonnées X et Y. La génération du modèle nécessite les données d’image des cinq premiers cycles de l’analyse. Une fois l’imagerie du dernier cycle de modèle pour une plaque réalisée, le modèle est généré. REMARQUE Pour détecter un amplifiat pendant la génération du modèle, il doit y avoir au moins une base autre que G dans les cinq premiers cycles. Pour toutes les séquences d’indexage, RTA v2 nécessite au moins une base autre que G dans les deux premiers cycles. Le modèle est utilisé comme référence pour l’étape suivante d’enregistrement et l’extraction des intensités. Les emplacements des amplifiats sur toute la Flow Cell sont écrits dans les fichiers d’emplacement des amplifiats (*.locs), un pour chaque ligne. Enregistrement et extraction des intensités L’enregistrement et l’extraction des intensités commencent après la génération du modèle. } L’enregistrement aligne les images produites par chaque cycle d’imagerie selon le modèle. } L’extraction d’intensité détermine une valeur d’intensité pour chaque amplifiat du modèle pour une image donnée. S’il y a échec d’enregistrement de l’image d’un cycle, quelle qu’elle soit, aucune définition des bases ne sera générée pour cette plaque dans ce cycle. Utilisez le logiciel SAV (visualiseur d’analyse de séquençage) pour examiner les vignettes et trouver les images dont l’enregistrement a échoué. Correction de la mise en phase Lors de la réaction de séquençage, chaque brin d’ADN dans un amplifiat s’étend d’une base par cycle. La mise en phase et la mise en préphase ont lieu lorsqu’un brin se retrouve hors phase par rapport au cycle d’incorporation en cours. } La mise en phase se produit lorsqu’un brin est en retard d’une base. } La mise en préphase se produit lorsqu’un brin est en avance d’une base. 60 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA A B Lecture avec une base présentant une mise en phase Lecture avec une base présentant une mise en préphase RTA v2 corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase, qui exploite au maximum la qualité des données à chaque cycle tout au long de l’analyse. Définition des bases La définition des bases détermine une base (A, C, G ou T) pour chaque amplifiat d’une plaque donnée d’un cycle spécifique. Le NextSeq 500 utilise le séquençage à deux canaux, qui ne nécessite que deux images pour encoder les données de quatre bases ADN : une à partir du canal rouge et une à partir du canal vert. Les intensités extraites d’une image et leur comparaison avec une autre image donnent quatre populations distinctes, chacune correspondant à un nucléotide. Le processus de définition des bases détermine à quelle population appartient chaque amplifiat. Figure 26 Visualisation de l’intensité des amplifiats Tableau 1 Définition des bases dans le séquençage à deux canaux Canal rouge Canal vert A 1 (allumé) 1 (allumé) Amplifiats montrant une intensité tant dans le canal rouge que dans le vert. C 1 (allumé) 0 (éteint) Amplifiats montrant une intensité seulement dans le canal rouge. G 0 (éteint) 0 (éteint) Amplifiats ne montrant d’intensité dans aucun emplacement d’amplifiat connu. T 0 (éteint) 1 (allumé) Amplifiats montrant une intensité seulement dans le canal vert. Base Guide du système NextSeq 500 Résultat 61 Flux de travail de Real-Time Analysis Figure 25 Mise en phase et en préphase Real-Time Analysis Notation de la qualité Un score de qualité, ou « Q-score », permet de prédire la probabilité d’une erreur dans la définition des bases. Un Q-score plus élevé implique qu’une définition des bases est de plus haute qualité et a de plus fortes probabilités d’être correcte. Le score de qualité constitue un moyen simple de communiquer les probabilités de petites erreurs. On représente un score de qualité sous la forme « Q(X) », où X est le score. Le tableau suivant montre la relation entre le score de qualité et la probabilité d’une erreur. Score de qualité Q(X) Q40 Q30 Q20 Q10 Probabilité d’une erreur 0,0001 (1 sur 10 000) 0,001 (1 sur 1 000) 0,01 (1 sur 100) 0,1 (1 sur 10) REMARQUE La notation de la qualité s’appuie sur une version modifiée de l’algorithme Phred. La notation de la qualité calcule un ensemble d’indicateurs prévisionnels pour chaque définition des bases, puis utilise ces valeurs pour rechercher un score de qualité dans un tableau de qualité. Les tableaux de qualité servent à fournir des indicateurs de qualité extrêmement précis pour des analyses générées par une configuration spécifique de plateforme de séquençage et de version de chimie. Une fois le score de qualité établi, les résultats sont enregistrés dans des fichiers de définition des bases (*.bcl). 62 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Type de fichiers Description, emplacement et nom des fichiers Fichiers de définition des bases Chaque plaque analysée est incluse dans un fichier de définition des bases; ces fichiers sont rassemblés dans un fichier pour chaque ligne de chaque cycle. Le fichier cumulé contient la définition des bases ainsi que le score de qualité codé associé à chaque amplifiat de cette ligne. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne. [Cycle].bcl.bgzf, dans lequel [Cycle] représente le numéro à quatre chiffres du cycle. Les fichiers de définition des bases sont compressés à l’aide du logiciel de compression gzip. Fichier index de définition des bases Pour chaque ligne, un fichier index binaire indique les renseignements sur la plaque d’origine dans une paire de valeurs pour chaque plaque, qui sont le numéro et le nombre d’amplifiats de la plaque. Les fichiers d’index de définition des bases sont créés la première fois qu’un fichier de définition des bases est créé pour une ligne. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne. s_[Ligne].bci Fichier d’emplacement des amplifiats Pour chaque plaque, les coordonnées XY de chaque amplifiat sont rassemblées dans un fichier d’emplacement des amplifiats pour chaque ligne. Les fichiers d’emplacement des amplifiats sont le résultat de la génération du modèle. Data\Intensities\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne. s_[ligne].locs Fichiers de filtrage Les fichiers de filtrage spécifient si les amplifiats ont franchi les filtres. Les renseignements de filtrage sont rassemblés dans un seul fichier de filtrage pour chaque ligne et chaque lecture. Les fichiers de filtrage sont générés au cycle 26 et portent sur 25 cycles de données. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne. s_[ligne].filter Fichiers InterOp Fichier de compte rendu binaire nécessaire pour le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Les fichiers InterOp sont mis à jour tout au long de l’analyse. Dossier InterOp Fichier de configuration RTA Créé au début de l’analyse, le fichier de configuration RTA indique les paramètres de l’analyse. [Dossier racine], RTAConfiguration.xml Fichier de renseignements sur l’analyse Indique le nom de l’analyse, le nombre de cycles à chaque lecture, si la lecture est une lecture indexée et le nombre de témoins et de plaques sur la Flow Cell. Le fichier de renseignements sur l’analyse est créé au début de l’analyse. [Dossier racine], RunInfo.xml Guide du système NextSeq 500 63 Fichiers de sortie de séquençage Fichiers de sortie de séquençage Real-Time Analysis 64 Type de fichiers Description, emplacement et nom des fichiers Fichier vignette Une vignette pour chaque canal de couleur (rouge et vert) pour les plaques 1, 6 et 12 depuis toutes les caméras, les surfaces hautes et basses à chaque cycle au cours de l’imagerie. Thumbnail_Images\L00[X]\C[X.1] : les fichiers sont stockés dans un dossier pour chaque ligne et dans un sous-dossier pour chaque cycle. s_[ligne]_[plaque]_[canal].jpg : dans le nom du fichier, la plaque est représentée par un numéro à cinq chiffres qui indique la surface, le témoin, la caméra et la plaque. Pour plus de renseignements, consultez la section Numérotation des plaques à la page 66 et la section Nommage des vignettes à la page 67. Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA La plaque est une petite zone d’imagerie sur la Flow Cell qui constitue pour la caméra l’unité de vision. Le nombre total de plaques dépend du nombre de lignes, de témoins et de surfaces imagés sur la Flow Cell, ainsi que de la façon dont les caméras fonctionnent conjointement pour recueillir les images. } Les Flow Cell à haut débit comportent 864 plaques au total. } Les Flow Cell à débit moyen comportent 288 plaques au total. Tableau 2 Plaques de la Flow Cell Composant de la Flow Cell Débit élevé Débit moyen Lignes 4 4 Une ligne est un canal physique possédant des ports d’entrée et de sortie dédiés. Surfaces 2 2 La Flow Cell est imagée sur deux surfaces : le dessus et le dessous. Le système image le dessus d’une plaque, puis le dessous de la même plaque avant de passer à la plaque suivante. Témoins par ligne 3 1 Un témoin est une colonne de plaques sur une ligne. Segments de caméra 3 3 L’instrument utilise six caméras pour imager la Flow Cell en trois segments pour chaque ligne. Plaques par témoin par segment de caméra 12 12 La plaque est la zone de la Flow Cell qui constitue pour la caméra une unité d’image. Nombre total de plaques imagées 864 288 Le nombre total de plaques est égal aux lignes × surfaces × témoins × segments de caméra × plaques par témoin par segment. Description Numérotation des lignes Les lignes 1 et 3, appelées paire de lignes A, sont imagées simultanément. Les lignes 2 et 4, appelées paire de lignes B, sont imagées lorsque l’imagerie de la paire de lignes A est terminée. Figure 27 Numérotation des lignes Guide du système NextSeq 500 65 Plaques de la Flow Cell Plaques de la Flow Cell Real-Time Analysis A B Paire de lignes A : lignes 1 et 3 Paire de lignes B : lignes 2 et 4 Numérotation des témoins Chaque ligne est imagée en trois témoins. Les témoins sont numérotés de 1 à 3 pour les Flow Cell à débit élevé. Figure 28 Numérotation des témoins Numérotation des caméras Le système NextSeq 500 utilise six caméras pour l’imagerie de la Flow Cell. Les caméras sont numérotées de 1 à 6. Les caméras 1 à 3 effectuent l’imagerie de la ligne 1. Les caméras 4 à 6 effectuent l’imagerie de la ligne 3. Une fois l’imagerie des lignes 1 et 3 effectuée, le module d’imagerie se déplace sur l’axe X pour effectuer l’imagerie des lignes 2 et 4. Figure 29 Numérotation des caméras et des segments (Flow Cell à débit élevé illustrée) Numérotation des plaques Chaque témoin du segment de chacune des caméras comporte 12 plaques. Les plaques sont numérotées de 01 à 12 dans un format de deux chiffres, peu importe le numéro du témoin ou le segment de caméra. 66 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Le numéro complet de la plaque comporte cinq chiffres pour indiquer son emplacement comme suit : } Surface : 1 représente la surface supérieure, et 2, la surface inférieure } Témoin : 1, 2 ou 3 } Caméra : 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 } Plaque : 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 11 ou 12 Exemple : la plaque portant le numéro 12508 indique qu’il s’agit d’une surface supérieure, du témoin 2, de la caméra 5 et de la plaque 8. Le numéro complet à cinq chiffres de la plaque est utilisé dans le nom des vignettes et des fichiers de mise en phase empirique. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Fichiers de sortie de séquençage à la page 63. Nommage des vignettes Une vignette pour chaque canal de couleur (rouge et vert) pour les plaques 1, 6 et 12 est générée depuis toutes les caméras, les surfaces hautes et basses à chaque cycle au cours de l’imagerie. Les fichiers de vignettes sont générés au format JPG. Chaque nom d’image commence par s_ et reçoit ensuite les éléments que prévoit la convention de dénomination suivante : } Ligne : 1, 2, 3 ou 4 } Plaque : numéro de la plaque à cinq chiffres, correspondant à la surface, au témoin, à la caméra et à la plaque } Canal : rouge ou vert Exemple : s_3_12512_green.jpg, qui correspond à la ligne 3, la surface supérieure, le témoin 2, la caméra 5, la plaque 12 et le canal vert. Guide du système NextSeq 500 67 Plaques de la Flow Cell Figure 30 Numérotation des plaques Real-Time Analysis Structure du dossier de sortie Le logiciel de commande génère automatiquement le nom du dossier de sortie. Data Intensities BaseCalls L001 : fichiers de définition des bases de la ligne 1, rassemblés dans un fichier par cycle. L002 : fichiers de définition des bases de la ligne 2, rassemblés dans un fichier par cycle. L003 : fichiers de définition des bases de la ligne 3, rassemblés dans un fichier par cycle. L004 : fichiers de définition des bases de la ligne 4, rassemblés dans un fichier par cycle. L001 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 1. L002 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 2. L003 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 3. L004 : fichier *.locs rassemblant les emplacements des amplifiats de la ligne 4. Images Focus L001 : images de mise au point de la ligne 1. L002 : images de mise au point de la ligne 2. L003 : images de mise au point de la ligne 3. L004 : images de mise au point de la ligne 4. InterOp : fichiers binaires utilisés par le visualiseur d’analyse de séquençage (SAV). Logs : fichiers journaux décrivant les étapes de fonctionnement. Recipe : fichier de formule propre à l’analyse portant l’identifiant de la cartouche de réactifs. RTALogs : fichiers journaux décrivant les étapes de l’analyse. Thumbnail_Images : vignettes pour les plaques 1, 6 et 12 dans chaque témoin de chaque cycle. RTAComplete.xml RTAConfiguration.xml RunInfo.xml RunNotes.xml RunParameters.xml 68 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA A aide documentation 3 aide, technique 73 alertes d’état 5 amplifiats passant par le filtre 59 analyse fichiers de sortie 63 analyse temps réel mise en phase 60 analyse, primaire pureté du signal 59 arrêter l’instrument 40 assistance clientèle 73 assistance technique 73 B barre d’état 4 BaseSpace 2 connexion 24 icônes de transfert 31 bouton d’alimentation 6, 12 C cartouche de réactifs préparation 20 présentation 8 réservoir nº 28 36 cartouche de tampon 9, 26 compartiment d’imagerie 4 compartiment de réactifs 4 compartiment du tampon 4 compatibilité Flow Cell, cartouche de réactifs 7 suivi RFID 7-8 composants barre d’état 4 compartiment d’imagerie 4 compartiment de réactifs 4 compartiment du tampon 4 configuration autonome 28 configuration de BaseSpace 28 configuration de l’analyse, option avancée 14 consommables 7 analyses de séquençage 15 cartouche de réactifs 8 cartouche de tampon 9 consommables de lavage 35-36 eau de laboratoire 15 Flow Cell 7 maintenance de l’instrument 15 consommables fournis par l’utilisateur 15 cycles d’une lecture 18 Guide du système NextSeq 500 Index Index D définition des bases 61 dépannage fichiers spécifiques à lʼanalyse 43 indicateurs de basse qualité 47 options pour communiquer avec nous 42 réservoir des réactifs usagés 46 vérification avant analyse 44 dépannage du système vérification du système 51 documentation 3, 73 durée de l’analyse 18 É éliminer les consommables 14 E emplacement des amplifiats fichiers 63 génération du modèle 60 emplacement du dossier 28 erreurs de vérification avant analyse 44 erreurs et avertissements 5 F fichiers de définition des bases 63 fichiers de filtrage 63 fichiers de sortie 63 fichiers de sortie, séquençage 63 fichiers InterOp 43, 63 fichiers locs 63 filtre de pureté 59 Flow Cell broches d’alignement 24 dénomination du fichier image 67 emballage 21 imagerie 66 inspection 21 joints de port 21 nettoyage 21 nombre de témoins 66 numérotation des lignes 65 numérotation des plaques 66 paires de lignes 7 plaques 65 présentation 7 réhybridation 47 types 2 flux de travail cartouche de réactifs 20, 26 cartouche de tampon 26 connexion à BaseSpace 24 durée de l’analyse 18 Flow Cell 24 69 Index hypochlorite de sodium 36 indicateurs de l’analyse 30 mode autonome 28 mode BaseSpace 28 option de chargement avancé 14 porte du compartiment de Flow Cell 24 préparation de la Flow Cell 21 présentation 19 réactifs usagés 25 séquençage 60 vérification avant analyse 29 flux de travail de séquençage 60 formamide, position 6 27 formation en ligne 3 G génération du modèle 60 gérer l’instrument arrêt 40 personnalisation 13 H hypochlorite de sodium, lavage 36 I icônes erreurs et avertissements 5 état 5 imagerie, séquençage à deux canaux 61 indicateurs cycles d’intensité 30 cycles de densité des amplifiats 30 définition des bases 61 indicateurs de l’analyse 30 instrument bouton d’alimentation 6 démarrage 12 paramètres de configuration 55 intensités 61 interrupteur d’alimentation 12 70 M maintenance de l‘instrument consommables 15 maintenance préventive 34 message d’erreur RAID 54 mise à jour logicielle 38 mise en phase empirique 60 mise en phase, mise en préphase 60 N nom d’utilisateur et mot de passe 12 nom d’utilisateur et mot de passe du système 12 nom de l’avatar 13 nom de l’instrument, personnalisation 13 numérotation des caméras 66 numérotation des lignes 65 numérotation des plaques 66 numérotation des témoins 66 O option de chargement avancé 13-14 P paires de lignes 65 paramètres de configuration 55 paramètres de l’analyse mode autonome 28 mode BaseSpace 28 modifier les paramètres 28 passant par le filtre (PF) 59 personnalisation 13 porte du compartiment de Flow Cell 24 préventive, maintenance 34 probabilité d'erreur 62 Q Q-scores 62 L R lavage automatique 32 composants de lavage 35 consommables fournis par l’utilisateur 35 lavage manuel 35 lavage après analyse 32 lavage de l’instrument 35 logiciel analyse d’image, définition des bases 5 configuration de l’instrument 13 durée de l’analyse 18 initialisation 12 mise à jour automatique 38 mise à jour manuelle 38 paramètres de configuration 55 sur instrument 5 logiciel de commande 5 logiciel Real-Time Analysis 2, 5 résultats 63 longueur de lecture 18 réactifs mise au rebut adéquate 26 sous forme de trousse 7 réactifs usagés élimination 25 mise au rebut 37 réservoir plein 46 recommandations relatives à l’eau de laboratoire 15 réhybridation de primer 47 réhybridation, lecture 1 47 RTA v2 arrêt 58 présentation 58 RunInfo.xml 43, 63 S scores de qualité 62 algorithme Phred 62 séquençage consommables fournis par l'utilisateur 15 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Index service de copie de l’analyse 31 suivi RFID 7 T transfert de données icônes d’activité 31 service de copie de l’analyse 31 V vérification avant analyse 29 vérification du système 51 vignettes 64 visualiseur d’analyse de séquençage 18 Guide du système NextSeq 500 71 Index 72 Support nº 20001879 Document nº 15046563 v01 FRA Pour obtenir une assistance technique, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Tableau 3 Coordonnées générales d’Illumina Site Web www.illumina.com Courriel [email protected] Tableau 4 Numéros de téléphone de l’assistance clientèle d’Illumina Région Numéro de la Région personne-ressource Amérique du Nord +(1) 800 809 4566 Irlande Allemagne 0800 180 8994 Italie Australie 1 800 775 688 Norvège Autriche 0800 296575 Nouvelle Zélande Belgique 0800 81102 Pays-Bas Danemark 80882346 Royaume-Uni Espagne 900 812168 Suède Finlande 0800 918363 Suisse France 0800 911850 Autres pays Numéro de la personne-ressource +(1) 800 812 949 800 874909 800 16836 0800 451 650 0800 0223859 0800 917 0041 020790181 0800 563118 +(44) 179 534 000 Fiches signalétiques : disponibles sur le site Web d’Illumina à l’adresse support.illumina.com/sds.html. Documentation du produit : disponible en téléchargement au format PDF sur le site Web d’Illumina. Accédez au site support.illumina.com, sélectionnez un produit, puis sélectionnez Documentation & Literature (Documentation et littérature). Guide du système NextSeq 500 73 Assistance technique Assistance technique *20001879* *20001879* Support nº 20001879 Illumina 5200 Illumina Way San Diego, Californie 92122 États-Unis +1.800.809.ILMN (4566) +(1) 858 202 4566 (en dehors de l’Amérique du Nord) [email protected] www.illumina.com ">
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