illumina MiSeqDx MD Manuel utilisateur

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Instrument MiSeqDx

pour instruments avec configuration à amorçage double

DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT

N° de référence DX-410-1001

Utilisation prévue

Illumina MiSeqDx est un instrument de séquençage qui mesure les signaux de fluorescence des nucléotides marqués grâce à l’utilisation de Flow Cell et de réactifs spécifiques à l’instrument (Trousse universelle MiSeqDx 1.0), de matériel d’imagerie et d’un logiciel d’analyse de données. La plateforme MiSeqDx est destinée au séquençage ciblé d’ADN génomique humain provenant d’échantillons de sang total périphérique. La plateforme MiSeqDx n’est pas destinée au séquençage de génome entier ou de novo. MiSeqDx est destiné à être utilisé avec des tests de diagnostic in vitro et des trousses de réactifs fournis par Illumina.

Principes de la procédure

La plateforme Illumina MiSeqDx est destinée au reséquençage ciblé d’ADN génomique humain provenant d’échantillons de sang total périphérique à l’aide des consommables fournis par Illumina. L’ADN génomique est traité à travers les étapes de préparation de la librairie, qui amplifient spécifiquement les régions génomiques prévues de chaque échantillon en utilisant les oligonucléotides personnalisés conçus par l’utilisateur, tout en ajoutant les index et les séquences de capture des Flow Cell aux produits amplifiés. La préparation de la librairie comporte quatre étapes clés : l’hybridation, l’extension-ligation, l’amplification par PCR et la normalisation de librairie. Les librairies d’échantillons normalisées qui en résultent sont prêtes pour le séquençage sur l’instrument Illumina MiSeqDx à l’aide de la chimie SBS (séquençage par synthèse). La chimie SBS utilise la méthode basée sur des terminateurs réversibles pour détecter les bases de nucléotides uniques à mesure qu’elles sont intégrées aux brins d’ADN croissants. Le logiciel d’analyse en temps réel (RTA) exécute les analyses d’images et la définition des bases tout en affectant un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Lorsque l’analyse primaire prend fin, le logiciel MiSeq

Reporter sur l’instrument MiSeqDx traite les définitions de bases par le biais d’une analyse secondaire qui inclut le démultiplexage, la génération de fichiers FASTQ, l’alignement, l’appel des variants et la génération de fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants trouvés à des positions spécifiques dans un génome de référence.

Limites de la procédure

1 Destiné au diagnostic in vitro uniquement.

2 Ce produit présente les limites suivantes :

— Sortie de séquençage >1 Gp

— Lectures > 3 millions

— Longueurs de lecture (dans une analyse à lecture appariée) 2 x 150 bp

— Bases supérieures à Q30 > 75 % (plus de 75 % des bases ont un score de qualité sur l’échelle Phred supérieur à 30, ce qui indique que la précision de la définition des bases est supérieure à 99,9 %)

3 Les variants dans les analyses homopolymères comptant plus de huit bases seront filtrés dans les fichiers VCF

(filtre R8).

4 Le système a été validé pour la détection des SNV et des délétions de trois bases maximum. L’évaluation des insertions d’une base a été limitée à trois insertions différentes sur trois chromosomes distincts.

5 Le système rencontre des problèmes de détection des insertions ou délétions d’une base dans les tronçons homopolymères (p. ex. le polyA).

6 Le système MiSeqDx est conçu pour offrir des résultats qualitatifs (c.-à-d. de génotype).

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Instrument MiSeqDx

7 Comme avec n’importe quel flux de travail à base d’hybridation, les polymorphismes, les mutations, les insertions ou les délétions sous-jacents dans les régions de liaison d’un oligonucléotide peuvent influer sur les allèles sondés et, par conséquent, les appels réalisés.

8 La couverture minimale recommandée par amplicon nécessaire pour un appel de variants précis (Q(max_gt | poly_site) >= 100) est de 75 ×.

Composants du produit

Le Illumina MiSeqDx comprend les composants suivants :

• Instrument MiSeqDx (N° de référence DX-410-1001)

Les composants logiciels suivants sont nécessaires au fonctionnement et à l’analyse des données sur MiSeqDx :°

Application logicielle

MOS : logiciel d’exploitation

MiSeqDx

RTA : logiciel d’analyse en temps réel

MiSeq

Reporter

Fonction

Commande le fonctionnement de l’instrument.

Effectue l’analyse primaire.

Effectue l’analyse secondaire.

Description

L’application logicielle MOS gère le fonctionnement de l’instrument au cours du séquençage et génère des images utilisées par le logiciel d’analyse en temps réel (RTA).

L’application logicielle RTA convertit les images générées par MOS pour chaque plaque par cycle de l’analyse de séquençage dans les fichiers de définition des bases qui constituent des entrées pour le logiciel MiSeq

Reporter. L’application logicielle RTA ne contient pas d’interface utilisateur.

Le logiciel MiSeq Reporter traite les définitions de bases par le biais d’une analyse secondaire qui inclut le démultiplexage, la génération de fichiers FASTQ, l’alignement, l’appel des variants et la génération de fichiers

VCF contenant des renseignements sur les variants trouvés à des positions spécifiques dans un génome de référence.

Stockage et manipulation

Élément

Température

Humidité

Caractéristique

Transport et stockage : de -10 °C à 40 °C (de 14 °F à 104 °F)

Conditions d’utilisation : de 19 °C à 25 °C (de 66 °F à 77 °F)

Transport et stockage : humidité sans condensation

Conditions d’utilisation : de 30 % à 75 % d’humidité relative (sans condensation)

Équipement et matériel nécessaires, non fournis

Consommables pour le séquençage

Trousse universelle MiSeqDx 1.0 (Nº de référence DX-103-1001)

Consommables fournis par l’utilisateur

Vérifiez la disponibilité des consommables suivants, fournis par l’utilisateur, avant de commencer une analyse.

Consommable

Lingettes alcoolisées, isopropyle à 70 % ou d’éthanol à 70 %

Tissu de laboratoire peu pelucheux

Papier optique, 4 x 6 po

Utilisation

Nettoyage du portoir de Flow Cell

Nettoyage de la platine de Flow Cell

Nettoyage de la Flow Cell

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Consommable

Tween 20

Brucelles en plastique à bout carré (facultatif)

Eau sans DNase ni RNase

Utilisation

Nettoyage de l’instrument

Retrait de la Flow Cell du conteneur de livraison

Nettoyage de l’instrument

Recommandations à propos de l’eau sans DNase ni RNase

Utilisez toujours de lʼeau sans DNase ni RNase pour réaliser des procédures sur l’instrument. Nʼutilisez jamais dʼeau courante ou dʼeau déionisée. Tous les exemples suivants sont acceptables :

• Eau 18 mégaohms (MΩ)

• Eau Milli-Q

• Eau Super-Q

• Eau de qualité biologie moléculaire

Avertissements et précautions

ATTENTION

La loi fédérale américaine n’autorise la vente de ce dispositif que sur ordonnance ou par un médecin ou tout autre professionnel de la santé autorisé par la législation de l’État dans lequel ils exercent à utiliser ou ordonner l’utilisation de cet appareil.

1 Certains composants des réactifs fournis par Illumina à utiliser avec l’instrument MiSeqDx contiennent du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. (Consultez les notices propres aux produits pour plus de renseignements.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

2 Certains composants des trousses de réactifs fournies par Illumina contiennent du 2-mercaptoéthanol, un agent réducteur. (Consultez les notices propres aux produits pour plus de renseignements.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Utilisez ces composants dans une zone bien aérée et mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

3 Manipulez tous les échantillons comme s’il s’agissait d’agents potentiellement infectieux.

4 Le non-respect des procédures décrites peut entraîner des résultats erronés ou une baisse considérable de la qualité des échantillons.

5 Utilisez les précautions de laboratoire habituelles. Ne pipettez pas avec la bouche. Il est interdit de manger, de boire et de fumer dans les zones de travail indiquées. Portez des gants jetables et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des échantillons et des réactifs de la trousse. Lavez-vous les mains soigneusement après avoir manipulé les échantillons et les réactifs de la trousse.

6 Des pratiques de laboratoire appropriées et une bonne hygiène de laboratoire sont nécessaires pour empêcher les produits PCR de contaminer les réactifs, les instruments et les échantillons d’ADN génomique. La contamination des PCR peut causer des résultats incorrects et non fiables.

7 Pour éviter la contamination, veillez à ce que les zones de pré-amplification et de post-amplification aient des

équipements dédiés (p. ex. pipettes, pointes de pipette, agitateur vortex et centrifugeuse).

8 Une paire index-échantillon doit correspondre exactement à la feuille d’échantillons. Les inadéquations entre la feuille d’échantillons et le schéma de la plaque entraîneront une perte de l’identification positive des

échantillons et un rapport de résultats incorrect.

9 Durant l’étape de normalisation de la librairie de la notice du réactif en question, il est extrêmement important de resuspendre complètement le culot des billes de la librairie. Cette étape est essentielle pour obtenir une densité consistante des amplifiats sur la Flow Cell MiSeqDx.

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10 Suivez les temps d’incubation indiqués dans les étapes de normalisation de la librairie comme indiqué dans la notice d’accompagnement du réactif concerné. Une incubation inappropriée peut affecter la représentation de la librairie et la densité des amplifiats.

11 Il est vivement recommandé d’installer le logiciel antivirus fourni par l’utilisateur afin de protéger l’ordinateur des virus. Consultez le manuel de l’utilisateur pour obtenir des instructions relatives à l’installation.

12 N’utilisez pas l’instrument MiSeqDx si l’un des panneaux a été retiré. L’utilisation de l’instrument, lorsque l’un des panneaux a été retiré, crée un risque d’exposition à la tension secteur et à plusieurs tensions continues.

13 Ne touchez pas la platine de Flow Cell dans le compartiment de Flow Cell. Le réchauffeur dans ce compartiment fonctionne entre 22 et 95 °C et peut causer des brûlures.

14 L’instrument pèse environ 57 kg (126 lb) et peut causer des blessures graves s’il tombe ou s’il est manipulé sans précaution.

Notes concernant la procédure

Le débit d’échantillons par analyse MiSeqDx peut être compris entre 8 et 48 échantillons. Les primers d’indexage utilisés pendant l’amplification par PCR doivent être choisis en fonction du débit d’échantillons final souhaité pour assurer la diversité dans la séquence d’indexage.

REMARQUE

Pour une efficacité maximale du débit, procédez à la préparation de la librairie pour 96 échantillons au plus, puis répartissez les échantillons en deux analyses de séquençage avec un maximum de 48 échantillons par analyse.

MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour séquencer des bases G/T et un voyant DEL rouge pour séquencer des bases

A/C. À chaque cycle, au moins un des deux nucléotides de chaque canal de couleur doit être lu pour assurer un enregistrement approprié. Il est important de maintenir l’équilibrage des couleurs pour chaque base de la lecture d’index en cours de séquençage, sinon un échec de l’enregistrement pourrait se produire lors du séquençage de la lecture d’index.

Si le séquençage est inférieur à 48 échantillons dans une analyse de séquençage, sélectionnez les index appropriés selon leurs séquences, afin de maintenir l’équilibre des couleurs dans les canaux verts et rouges. Au minimum, les analyses comportant 8 à 48 échantillons doivent inclure les combinaisons de primers d’indexage figurant dans la notice d’accompagnement de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0.

Pour effectuer avec précision des analyses plus petites, au moins huit échantillons doivent être présents. Si six

échantillons uniques (à l’exclusion des contrôles positifs et négatifs) ne sont pas disponibles, il convient d’effectuer l’analyse avec des réplicats d’échantillons de n’importe quel échantillon d’ADN génomique humain. Consultez la notice d’accompagnement de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0 pour connaître l’ensemble minimal d’indices à équilibre chromatique à utiliser pour les analyses de séquençage de huit échantillons.

Mode d’emploi

Le mode d’emploi suivant de l’instrument MiSeqDx requiert l’utilisation des réactifs fournis dans la trousse Trousse universelle MiSeqDx 1.0.

MiSeqDx Préparation de la feuille d’échantillons

1 Dans l’écran d’accueil de Illumina Worklist Manager, sélectionnez Create Worklist (Créer la liste de travail).

2 Dans le champ Test Type (Type de test), sélectionnez MiSeqDx universel.

3 Dans le champ Worklist Name (Nom de la liste de travail), saisissez un nom pour la feuille d’échantillons.

Il s’agit d’un champ obligatoire.

— Si l’identifiant du code à barres de la cartouche de réactifs alphanumérique est utilisé pour le nom de la feuille d’échantillons, le Logiciel d’exploitation de MiSeq (MOS) trouve automatiquement la feuille d’échantillons (cet identifiant se trouve sur l’étiquette de la cartouche de réactifs, juste sous le code à barres).

— Si vous utilisez un autre nom pour la feuille d’échantillons, le bouton Browse (Parcourir) situé dans le

Logiciel d’exploitation de MiSeq (MOS) peut être utilisé afin de trouver la feuille d’échantillons appropriée.

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4 [Facultatif] Entrez une description pour identifier l’analyse.

5 Assurez-vous que la date correspond à la date de début de l’analyse. La date actuelle apparaît par défaut.

6 Sélectionnez Next (Suivant). L’écran Enter Sample Information (Entrer les renseignements sur l’échantillon) s’ouvre.

Saisir des renseignements sur les échantillons

1 Dans l’onglet Table (Tableau) ou l’onglet Plate (Plaque), saisissez les renseignements suivants pour chaque puits contenant un échantillon : a Identifiant de l’échantillon : saisissez un seul identifiant d’échantillon.

b Index 1 et Index 2 : spécifiez l’adaptateur qui sera utilisé pour chaque lecture d’index.

c Manifeste : précisez le nom du fichier de manifeste qui contient les renseignements sur les échantillons dans ce puits en particulier.

2 [Facultatif] Pour enregistrer des renseignements plus détaillés sur les échantillons, saisissez un nom d'échantillon et une description.

3 [Facultatif] Pour identifier les témoins sur la plaque, sélectionnez Negative (Négatif) ou Positive (Positif) dans le menu déroulant Control (Témoin).

4 Accédez à l’onglet Plate Graphic (Plaque graphique) et utilisez les options Copy to Clipboard (Copier dans le bloc-notes) ou Print (Imprimer) pour capturer une image de la plaque d’échantillon.

5 Sélectionnez Finish (Terminer).

Préparation des échantillons

Suivez les étapes suivantes conformément au mode d’emploi figurant dans la notice d’accompagnement de la trousse universelle MiSeqDx 1.0 :

• Hybridation des pools d’oligonucléotides

• Retrait des oligonucléotides non liés

• Extension-ligation des oligonucléotides liés

• Amplification par PCR

• Nettoyage PCR

• Normalisation de la librairie

• Groupement des librairies

Préparation de la cartouche de réactifs

1 Décongelez la Cartouche de réactifs MiSeqDx dans un bain d’eau contenant assez d’eau déionisée à température ambiante pour submerger la base de la cartouche de réactifs jusqu’à la ligne de délimitation de l’eau imprimée sur la cartouche de réactifs. Le niveau de l’eau ne doit pas dépasser la ligne de délimitation de l’eau maximale.

2 Laissez la cartouche de réactifs décongeler dans le bain dʼeau à température ambiante pendant environ une heure ou jusquʼà décongélation.

3 Retirez la cartouche du bain d’eau et tapotez-la doucement contre la paillasse pour retirer l’eau de la base de la cartouche. Séchez la base de la cartouche. Assurez-vous que lʼeau n’a pas éclaboussé la partie supérieure de la cartouche de réactifs.

Inspecter la cartouche de réactifs

1 Retournez la cartouche de réactifs 10 fois pour mélanger les réactifs décongelés, puis vérifiez visuellement que toutes les positions sont décongelées.

REMARQUE

Il est essentiel que les réactifs contenus dans la cartouche soient parfaitement décongelés et mélangés afin de garantir un séquençage correct.

2 Inspectez visuellement les réactifs des positions 1, 2 et 4 pour vous assurer quʼils sont complètement mélangés et ne contiennent pas de précipités.

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3 Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair dans les réactifs.

REMARQUE

Les tubes des dispositifs dʼaspiration MiSeqDx descendant au fond de chaque réservoir pour aspirer les réactifs, il est important quʼaucune bulle dʼair ne reste dans les réservoirs.

4 Placez la cartouche de réactifs sur la glace ou réservez-la à une température comprise entre 2 et 8 °C (jusqu’à

6 heures) jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer lʼanalyse. Pour obtenir de meilleurs résultats, chargez directement l’échantillon et configurez lʼanalyse.

Préparer des échantillons pour le séquençage

1 Ramenez le Tampon de dilution de librairie à température ambiante. Agitez le Tampon de dilution de librairie et assurez-vous que tous les précipités sont complètement dissous.

2 Si la plaque SGP a été conservée congelée, décongelez la plaque SGP à température ambiante.

3 Centrifugez la plaque SGP à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute.

4 Mettez en route un tube Eppendorf frais (ci-après désigné comme le tube PAL).

5 Déterminez les échantillons à regrouper pour le séquençage. Un maximum de 48 échantillons peut être regroupé pour le séquençage.

6 Si la plaque SGP a été conservée congelée, mélangez chaque librairie à séquencer en pipettant de haut en bas de 3 à 5 fois.

7 Transférez 5 µL de chaque librairie à séquencer de la plaque SGP , colonne par colonne, à une barrette de huit tubes PCR. Scellez la SGP avec un timbre adhésif pour plaque et réservez.

REMARQUE

Après utilisation, conservez la plaque SGP scellée à une température de -25 °C à -15 °C. La plaque SGP scellée est stable pendant un maximum de trois jours.

8 Combinez et transférez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL. Mélangez le tube PAL complètement.

9 Mettez en route un tube Eppendorf frais (ci-après désigné comme le tube DAL).

10 Ajoutez 585 µL de Tampon de dilution de librairie au tube DAL.

11 Ajoutez 6 µL de Contrôle interne PhiX de 20 pM au tube DAL. Pipettez de haut en bas de 3 à 5 fois pour rincer l'embout et assurer un transfert total.

12 Transférez 9 µL du PAL dans le tube DAL contenant Tampon de dilution de librairie. Pipettez de haut en bas de 3 à 5 fois pour rincer l'embout et assurer un transfert total.

13 Mélangez le tube DAL sous agitateur vortex à une vitesse maximale.

14 Centrifugez le tube DAL à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.

15 Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant à 96 °C pendant 2 minutes.

16 Après l’incubation, inversez le tube DAL 1 ou 2 fois pour mélanger, puis placez immédiatement dans un bain d’eau glacée.

17 Gardez le tube DAL dans un bain d’eau glacée pendant 5 minutes.

Chargement des librairies d’échantillons sur la cartouche

1 Utilisez un embout de pipette de 1 mL séparé, propre et vide pour percer l’opercule qui scelle le réservoir, sur la cartouche de réactifs étiquetée Load Samples (Charger les échantillons).

2 À l’aide de la pipette, transférez 600 µL de librairies d’échantillons DAL dans le réservoir Load Samples

(Charger les échantillons). Prenez soin de ne pas toucher à l’opercule lors de la dispersion de l’échantillon.

Vérifiez s’il y a des bulles d’air dans le réservoir après le chargement de l’échantillon. Si des bulles d’air sont présentes, tapotez légèrement la cartouche sur la paillasse pour les libérer.

3 Passez directement à la configuration de l’analyse depuis l’interface du Logiciel d’exploitation de MiSeq (MOS).

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Configuration de l’analyse

1 Connectez-vous au Logiciel d’exploitation de MiSeq (MOS).

2 Sélectionnez Sequence (Séquence).

Une série d’écrans de configuration de l’analyse s’affiche dans l’ordre suivant : Load Flow Cell (Charger la

Flow Cell), Load Reagents (Charger les réactifs), Review (Révision) et Pre-Run Check (Vérification avant analyse).

3 Lorsque l’écran Load Flow Cell (Charger la Flow Cell) s’affiche, nettoyez et chargez la Flow Cell.

4 Fermez le verrou de la Flow Cell et la porte du compartiment de la Flow Cell.

Le verrou et la porte du compartiment doivent être fermés avant le lancement de l’analyse. Une fois la Flow

Cell chargée, le logiciel lit et enregistre lʼidentification par radiofréquence (RFID). Une confirmation de lecture

RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran.

5 Lorsque l’écran Load Reagents (Charger les réactifs) s’affiche, videz le flacon à déchets, chargez le flacon de

Solution SBS (PR2) MiSeqDx, puis chargez la cartouche de réactifs.

Lorsque le flacon de MiSeqDx SBS Solution (PR2) et la cartouche de réactifs sont chargés, le logiciel lit et enregistre le RFID. Une confirmation de lecture RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran.

6 Sélectionnez la feuille d’échantillons appropriée.

Par défaut, le logiciel recherchera un fichier de feuille dʼéchantillons avec un nom correspondant au code à barres de la cartouche de réactifs chargée sur lʼinstrument.

7 Confirmez les paramètres d’analyse et les résultats de la vérification avant analyse.

8 Démarrez l’analyse.

Lʼécran Sequencing (Séquençage) sʼouvre lorsque lʼanalyse démarre. Cet écran fournit une représentation visuelle de lʼanalyse en cours, y compris les intensités et les scores de qualité.

Résultats

Le logiciel d’analyse primaire intégré (analyse temps réel ou RTA) exécute les analyses d’images et les définitions de bases tout en affectant un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Une fois l’analyse primaire terminée, le logiciel MiSeq Reporter sur l’instrument MiSeqDx lance une analyse secondaire, comme décrit cidessous.

Démultiplexage

Le démultiplexage est la première étape dans l’analyse si la feuille d’échantillons répertorie plusieurs échantillons et que l’analyse comporte des lectures d’index. Le démultiplexage sépare les données des échantillons groupés en fonction de séquences d’indexage courtes qui marquent les échantillons provenant de librairies différentes. Chaque séquence de lecture d’index est comparée aux séquences d’indexage définies dans la feuille d’échantillons. Aucune valeur de qualité n’est prise en compte lors de cette étape.

Génération de fichier FASTQ

Après le démultiplexage, MiSeq Reporter génère des fichiers intermédiaires au format FASTQ, un format texte utilisé pour représenter des séquences. Les fichiers FASTQ contiennent les lectures de chaque échantillon et les scores de qualité, à l’exclusion des lectures provenant de tout amplifiat qui n’est pas passé par le filtre. Le score de qualité est calculé de la façon suivante : -10 log

P, où P est la probabilité que la définition des bases soit incorrecte.

Alignement

L’alignement compare les séquences par rapport à la référence pour identifier une relation entre les séquences et attribue un score en fonction des régions de similarité. Les lectures alignées sont écrites dans des fichiers au format

BAM. Pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, MiSeq Reporter utilise un algorithme de Smith-Waterman par bande, qui effectue des alignements de séquence locaux pour identifier des régions similaires entre deux séquences.

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Instrument MiSeqDx

Appel des variants

Pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, MiSeq Reporter utilise le paramètre d’appel des variants Starling qui appelle les SNP et les petits indels et résume la profondeur et les probabilités pour chaque site du génome. Starling génère des rapports au format html sur les SNP et les indels ainsi que des fichiers de texte séparé par des tabulations contenant des variants au format Variant Call Format (VCF). Pour obtenir des renseignements sur le calcul des résultats à partir des fichiers VCF, consultez le Guide de l’utilisateur de MiSeq Reporter (n° 15039188).

Caractéristiques de performance

Précision

Trois études distinctes ont été menées pour évaluer la précision de la plateforme MiSeqDx.

Étude 1

Cette étude a utilisé un test représentatif conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et contenant des exons potentiellement pertinents d’un point de vue clinique. Les 13 échantillons uniques utilisés dans cette étude proviennent de 2 parents et 11 enfants qui ont été fréquemment séquencés par plusieurs laboratoires et selon différentes méthodes de séquençage. Il y a six échantillons de sujets féminins et sept échantillons de sujets masculins. La précision a été déterminée pour les variants à simple nucléotide (SNV) en comparant les données de l’étude à une base de données de référence bien caractérisée. La séquence de la base de données de référence a été obtenue à partir de la combinaison de plusieurs méthodes de séquençage, de données accessibles au public et de renseignements héréditaires. Le tableau suivant permettant d’évaluer la précision du système a été établi à partir des données de la première analyse au cours de l’étude. Le test n’a pas été répété pour cette étude.

Les résultats de cette étude sont présentés ci-dessous.

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Instrument MiSeqDx

9 8

Tableau 1 Données de précision de niveau amplicon de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon

1 1 132 13 15 132

114

129

131

110

131

117

121

128

133

119

127

135

122

130

117

Poly T (5)

Poly A (14)

Poly A (5)

Poly A (5),

Poly T (5)

Poly C (5),

63 % de GC

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (5),

Poly C (5)

114

129

131

110

130-131

117

121

128

133

119

127

135

122

130

117

Nombre d’aucunappel

130

117

128

133

119

127

135

122

Nombre d’appels corrects par

échantillon

132

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

114

129

131

110

130-131

117

121

100

99,54

100

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Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

136

131

123

117

119

120

129

133

135

123

134

132

121

125

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

Poly T (5)

Poly T (5),

SNV

Poly A (5)

15 Poly A (6),

Poly T (5),

Région homologue sur un chromosome différent

13 15

Région homologue sur un chromosome différent

Poly T (5)

Poly C (7),

66 % de GC

Poly C (5),

69 % de GC

SNV

Poly A (5),

SNV

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

136

131

123

117

119

120

129

133

135

123

134

132

121

125

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

136

131

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

123

117

119

120

129

133

135

123

134

132

121

125

100

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Mars 2015

Instrument MiSeqDx

46 9

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

134

118

122

131

133

128

131

129

133

112

133

135

122

117

124

117

128

123

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (6)

Poly T (6)

Poly A (5),

Poly T (5),

SNV

Poly T (5),

SNV

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

Poly T (5)

Poly A (5)

13 15

131

133

128

131

129

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

134

118

122

133

112

133

135

122

117

125

117

128

123

Nombre d’aucunappel 4

131

133

128

131

129

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

134

118

122

Nombre d’appels incorrects 6

100

% d’appels corrects 7

100

133

112

133

135

122

117

125

117

128

123

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

133

112

129

120

119

118

112

126

132

131

119

135

131

121

132

120

115

112

Poly A (5)

CT(5)

SNV

Poly T (6)

63 % de GC

Poly A (6),

Poly T (8)

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

Poly A (5)

135

131

121

132

120

115

112

120

119

118

112

126

132

131

119

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

133

112

129

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels incorrects 6

135

131

121

132

120

115

112

120

119

118

112

126

132

131

119

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

133

112

129

100

% d’appels corrects 7

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

133

120

135

126

134

122

127

123

125

133

116

135

118

136

131

119

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

60 % de GC

13 15

Poly A (5),

59 % de GC

Poly C (5),

63 % de GC

59 % de GC;

SNV

Poly A (5),

Poly T (5)

67 % de GC

58 % de GC

Poly G (6),

61 % de GC

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

133

120

135

126

134

122

127

123

125

133

116

135

118

136

131

119

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

133

120

135

126

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

134

122

127

123

125

133

116

135

118

136

131

119

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

95 10

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

122

123

127

129

130

116

119

121

117

114

129

114

122

127

133

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

Poly T (5)

Poly A (6)

60 % de GC

57 % de GC

Poly T (5)

Région homologue sur un chromosome différent

Poly A (14)

Région homologue sur un chromosome différent

SNV

Poly A (5),

Poly C (5)

129

130

116

119

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

122

123

127

121

117

114

130

114

122

127

133

Nombre d’aucunappel 4

129

130

116

119

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

122

123

127

Nombre d’appels incorrects 6

100

% d’appels corrects 7

100

121

117

114

129 (sur 130)

114

122

127

133

100

99,23

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

100

101

102

103

138

139

116

133

104

105

110

111

112

113

114

115

106

107

108

109

138

136

118

128

120

139

118

123

121

129

122

124

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

64 % de GC 13

13 15 Poly A (5),

57 % de GC

Poly C (5),

67 % de GC

70 % de GC

62 % de GC

60 % de GC

58 % de GC;

SNV

57 % de GC

Poly T (5)

26 % de GC

Poly T (5);

Région homologue sur un chromosome différent

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

138

139

116

133

138

136

118

128

120

139

118

123

121

129

122

124

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

138

139

116

133

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

138

136

118

128

120

139

118

123

121

129

122

124

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

118

128

129

130

131

124

125

126

127

132

119

120

121

122

123

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

116

117

135

119

125

131

117

116

129

117

113

129

121

123

127

136

132

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

CA (4)

Poly A (6);

Région homologue sur un chromosome différent

Poly C (5);

SNV

58 % de GC

Poly T (10)

Poly T (5)

Poly A (5)

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (6)

Poly T (5)

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

135

119

125

131

117

116

129

117

113

129

121

123

127

136

132

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

135

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

119

125

131

117

116

129

117

113

129

121

123

127

136

132

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

135

136

137

138

142

143

144

145

139

140

141

146

147

148

149

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

133

134

115

117

134

131

133

137

131

128

133

136

124

122

116

133

117

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

Poly T (8);

19 % de GC

Poly A (5);

Poly T (5)

Poly A (5)

26 % de GC;

SNV

Poly T (8);

SNV

Poly A (5)

59 % de GC

Poly C (5)

SNV

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

115

117

134

131

133

137

131

128

133

136

124

122

116

133

117

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

115

117

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

134

131

133

137

131

128

133

136

124

122

116

133

117

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

161

162

163

164

157

158

159

160

165

152

153

154

155

156

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

150

151

124

123

166

167

115

125

121

123

114

119

122

121

123

119

135

116

123

116

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

Poly T (6)

Poly T (5);

26 % de GC

Poly A (5)

58 % de GC

Poly C (5)

61 % de GC

Poly C (6);

60 % de GC;

SNV

62 % de GC

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

124

123

115

125

121

123

114

119

122

121

123

119

135

116

123

116

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

124

123

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

115

125

121

123

114

119

122

121

123

119

135

116

123

116

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

169

170

178

179

180

181

182

183

174

175

176

177

171

172

173

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

168 17 118

184

129

131

127

118

138

131

112

124

134

129

133

118

114

118

122

139

58 % de GC

Poly A (6)

60 % de GC

Poly G (6);

66 % de GC

64 % de GC

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

13 15

Poly C (5);

65 % de GC

Poly G (6);

67 % de GC;

SNV

61 % de GC

Poly C (5)

61 % de GC

13 15

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

118

129

131

127

118

138

131

112

124

134

129

133

118

114

118

122

139

Nombre d’aucunappel 4

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

118

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

129

131

127

118

138

131

112

124

134

129

133

118

114

118

122

139

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé 1

185

186

131

141

187

191

192

193

188

189

190

194

195

121

138

123

138

117

136

122

119

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés 2

67 % de GC

59 % de GC;

Région homologue sur un chromosome différent

Poly C (5);

72 % de GC;

Région homologue sur un chromosome différent

58 % de GC

64 % de GC

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (5);

Poly C (5)

62 % de GC;

SNV

66 % de GC

Nombre d’appels pouvant être effectués par échantillon 3

131

141

121

138

123

138

117

136

122

119

Nombre d’aucunappel 4

117

136

122

138

123

138

Nombre d’appels corrects par

échantillon 5

131

141

Nombre d’appels incorrects 6

% d’appels corrects 7

100

121

122

100

119 0 100

S'entend, par fragment analysé, la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible.

Le nombre total d’échantillons répertoriés est de 15, car 2 des 13 échantillons ont été analysés en 2 réplicats indépendants.

Le nombre d’appels par échantillon ayant été effectués est le nombre de bases ayant une qualité suffisante pour être définis par le système.

Le nombre d’aucun-appels est le nombre de bases dans un amplicon n'entraînant aucun appel dans l’analyse.

5 Le nombre d’appels corrects par échantillon est le nombre de bases dans l’amplicon qui ont été définies et ont obtenu des résultats correspondant à la séquence de référence du génome

6 humain version 19 et à la référence composite bien caractérisée.

Le nombre d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects pour le SNV ou l’indel dans cet amplicon; des détails supplémentaires sur les appels incorrects sont présentés dans les notes de bas de page ci-dessous.

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Le pourcentage (%) d’appels corrects correspond au taux d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur les renseignements de référence composite bien caractérisée, et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence de l’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain version 19. Cette colonne peut afficher plus d'un résultat prévu pour un amplicon donné, si certains échantillons contiennent un indel et d'autres, non

(p. ex. amplicon 9). Le pourcentage (%) d'appels corrects pour les échantillons dont le résultat est incorrect est présenté dans le tableau.

L'amplicon 9 a une analyse d'homopolymères de 14 A, selon la séquence de référence du génome humain version 19. Toutefois, pour 7 des 13 échantillons, les renseignements de la référence composite bien caractérisée montraient 13 A dans cette analyse d'homopolymères. Dans ces sept échantillons, cette suppression d'une paire de bases représente un faux

9 négatif dans cette étude de précision de séquençage MiSeqDx.

L'amplicon 46 a une insertion de base qui est rapportée dans 9 échantillons de la base de données de référence bien caractérisée et correctement détectée dans tous les échantillons

10 analysés.

L'amplicon 95 a une analyse d'homopolymères de 14 A, selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, pour 13 échantillons sur 13, les renseignements de la référence composite bien caractérisée montraient 15 A dans cette analyse d'homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion d'une paire de bases représente un faux négatif dans l’étude de précision de séquençage MiSeqDx.

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Le tableau suivant contient les données de l’Étude 1, présentées avec la concordance positive et négative de un pour cent, où les résultats des variants sont comparés aux renseignements de la référence composite bien caractérisée pour le calcul de la concordance positive en pour cent (CPP). Étant donné que les renseignements de la référence composite fournissent uniquement des résultats pour les variants à simple nucléotide et les insertions/suppressions, les résultats des bases sans variants sont comparés à la séquence de référence du génome humain version 19 pour le calcul de la concordance négative en pour cent (CNP). Toutes les bases sans variants avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence de référence. Tous les SNV avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence de référence. Les variants qui ont été manqués étaient des insertions de base 1 ou de suppression de base 1 dans les régions d'homopolymères.

Tableau 2 Concordance des résultats des appels de bases de la plateforme MiSeqDx avec les données de référence pour

13 échantillons bien caractérisés

Échantillon

Nbre d’amplicons

% de couverture d’amplicons 1

Variants attendus par échantillon 2

Variants correctement appelés

Variants manqués 3

Bases sans variants appelées correctement

CPP 4

(%)

CNP 5 (%)

195

NA12877

NA12878

NA12879

NA12880

NA12881

NA12882

NA12883

NA12884

NA12885

NA12886

NA12887

NA12888

NA12893

100

24415

24416

24412

24417

24419

24412

24415

24417

24418

24417

24416

24417

24415

90,91

94,74

95,83

90,00

93,75

95,83

95,24

89,47

95,00

90,00

90,91

100

1 Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité.

Les variants prévus par échantillon comprennent les SNV et les indels.

Pour les variants manqués, veuillez consulter le premier tableau de l’étude 1 et les notes de bas de page 8 à 10.

4 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 x TP/(TP + FN), où les vrais positifs (TP) sont le nombre d'appels de variants positifs aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence et l’allèle mutant appelé est concordant avec la séquence de référence (colonne nommée Variants appelés correctement) et les faux négatifs (FN) sont le nombre d'appels de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence (colonne nommée

Variants manqués).

Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 x TN/(FP + TN) où les faux positifs (FP) sont le nombre d'appels de variants positifs aux coordonnées génomiques où sont absents les variants selon la séquence de référence, ou si l’allèle mutant appelé est discordant avec la séquence de référence (non référencé dans le tableau; aucun appel de variants faux positifs n’a été effectué dans cette étude) et les vrais négatifs (TN) sont le nombre d’appels de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont absents les variants selon la séquence de référence (colonne nommée Bases sans variants appelées correctement).

Mars 2015 nº 15070068 Rév. A FRA

Instrument MiSeqDx

Étude 2

Les résultats de séquençage pour le panel d’amplicons ci-dessus ont été comparés à un génotype d’une grande fiabilité

établi pour NA12878 par le National Institutes of Standards and Technology (NIST, Institut national des normes et de la technologie) (v.2.15

1 ). Sur les 195 amplicons, 184 amplicons étaient compris dans les appels de référence d’une grande fiabilité dans la séquence du NIST et ont été comparés. Des appels de bases sans variants ont été comparés à la séquence du génome humain de référence version 19.

Tableau 3 Comparaison des résultats de séquençage de la plateforme MiSeqDx pour l’échantillon NA12878 avec la base de données du NIST

Échantillon

Nbre d’amplicons

% de couverture d’amplicons 2

Variants attendus

Variants correctement appelés

Variants manqués

Bases sans variants appelées correctement

CPP 3

(%)

CNP 4

(%)

NA12878 184 100 17 16 1

23066 94,12 100

1 Zook, JM et al. Integrating sequencing datasets to form highly confident SNP and indel genotype calls for a whole human genome.

2 arXiv:1307.4661 [q-bio.GN].

Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité.

3 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 x TP/(TP + FN).

Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 x TN/(FP + TN).

Le variant manqué est la délétion d’une paire de bases dans l’amplicon 9 d’une analyse homopolymère de 14 A non appelés par le

MiSeqDx présente dans la séquence NIST. Notez que la séquence NIST n’inclut pas l’insertion d’une paire de bases dans l’autre homopolymère de A qui était présent dans l’autre base de données de référence utilisée ci-dessus dans l’étude 1.

Étude 3

Une étude de précision supplémentaire a été réalisée pour évaluer les performances des petites insertions et délétions dans le cadre d’un test représentatif, le test de fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx d’Illumina, qui comprenait un sous-ensemble de variations génétiques

CFTR significatives sur le plan clinique et analysées avec le logiciel MiSeq

Reporter en utilisant le flux de travail ciblé de séquençage de l’ADN associé à la plateforme MiSeqDx. Les insertions et délétions demandées ont été détectées à l’emplacement prévu avec une fiabilité élevée. Ces échantillons ont été caractérisés grâce au séquençage bidirectionnel Sanger utilisé comme méthode de référence pour établir la séquence prévue.

Tableau 4 Résumé de la détection des indels à l’aide de la plateforme MiSeqDx

Amplicon

Taille des inserts

Contenu génomique de l’amplicon

Nbre d’appels par

échantillon ayant été effectués

Nbre de bases appelées par

échantillon

Nbre d’aucunappel

Nbre d’appels corrects par

échantillon

1 129 130 130 0 130

154

167

134

Insertion d’une base

Délétion de trois bases

Délétion de deux bases

Délétion d’une base

151

165

133

151

165

133

151

165

133

Nbre d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon

Taille des inserts

Contenu génomique de l’amplicon

132

129

Délétion d’une base

Nbre d’appels par

échantillon ayant été effectués

Nbre de bases appelées par

échantillon

131 131

128 128

Nbre d’aucunappel

Nbre d’appels corrects par

échantillon

131

128

Nbre d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

Les données qui ressortent de ces études de précision confirment que la plateforme MiSeqDx peut séquencer avec précision les éléments suivants :

• Teneur en GC ≥ 19 % (toutes les bases des 135 amplicons séquencés qui avaient une teneur de 19 % en GC ont

été correctement appelées)

• Teneur en GC ≤ 72 % (toutes les bases des 135 amplicons séquencés qui avaient une teneur de 72 % en GC ont

été correctement appelées)

• Longueurs de PolyA ≤ 7 (la répétition PolyA de 7 nucléotides a été appelée correctement dans les

270 amplicons séquencés qui contenaient des PolyA = 7)

• Longueurs de PolyT ≤ 8 (la répétition PolyT de 8 nucléotides a été appelée correctement dans les 270 amplicons séquencés qui contenaient des PolyT = 8)

• Longueurs de PolyG ≤ 6 (la répétition PolyG de 6 nucléotides a été appelée correctement dans les

405 amplicons séquencés qui contenaient des PolyG = 6)

• Longueurs de PolyC ≤ 7 (la répétition PolyC de 7 nucléotides a été appelée correctement dans les 135 amplicons séquencés qui contenaient des PolyC = 7)

• Longueurs de répétition de dinucléotide ≤ 5x (toutes les bases des 135 amplicons séquencés qui avaient une répétition de dinucléotide de 5x ont été correctement appelées)

• Longueurs de répétition de trinucléotide ≤ 4x (toutes les bases des 810 amplicons séquencés qui avaient une répétition de trinucléotide de 4x ont été correctement appelées)

• Insertions de base 1 et suppression de 3 bases ou moins

— 2 des 3 insertions de base 1 testées ont été appelées correctement. Des appels corrects ont été effectués pour

2 insertions de base 1 dans des régions non homopolymères de 82 amplicons. Une insertion de base 1 n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur un chromosome 2 dans 135 amplicons.

— 3 suppressions de base 1 sur 4 ont été appelées correctement. Tous les appels corrects ont été effectués dans des régions non homopolymères de 4 amplicons. Une suppression de base 1 n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur un chromosome 9 dans 63 amplicons.

— Les suppressions de base 2 ont été appelées correctement dans un échantillon.

— Les suppressions de base 3 ont été appelées correctement dans 21 échantillons.

Reproductibilité

La reproductibilité de la plateforme MiSeqDx a été déterminée à l’aide de deux tests représentatifs.

Étude 1

Un test représentatif a été conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et contenant des exons potentiellement pertinents sur le plan clinique. L’étude a permis d’examiner 13 échantillons au cours de neuf analyses à l’aide de trois instruments MiSeqDx différents avec le concours de trois opérateurs distincts

(

Tableau 5 ). Un lot unique de réactifs de préparation de la librairie et deux lots de consommables pour le séquençage

ont été utilisés. Les 13 échantillons provenaient de deux parents et 11 enfants qui avaient été fréquemment séquencés par

Mars 2015 nº 15070068 Rév. A FRA

Instrument MiSeqDx plusieurs laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Deux échantillons ont été analysés en double exemplaire, donc chaque analyse a généré des résultats pour 15 échantillons.

Pour l’évaluation de la reproductibilité d’un lot à l’autre, 94 échantillons et deux contrôles sans modèle ont été testés dans l’ensemble des trois lots. Chaque lot a été scindé en deux analyses de 48 échantillons pour tester tous les réactifs et les combinaisons de primers d’index possibles. Toutes les analyses de séquençage ont été réalisées par un seul opérateur

sur un seul instrument MiSeqDx pour éviter toute variation éventuelle due à l’opérateur ou à l’instrument ( Tableau 6

Des appels corrects ont été déterminés pour les variants à simple nucléotide (SNV) en comparant les données de l’étude

à des renseignements de la référence bien caractérisée. Il n’y a eu aucun échec d’analyse ou répétition d’analyse pour l’étude de reproductibilité. Les tableaux suivants contiennent les résultats des études destinées à évaluer la reproductibilité du système.

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Tableau 5 Résultats de la reproductibilité d’instrument à instrument de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx (au niveau de l’amplicon)

MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’analyses d’échantillons

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

132

114

129

131

110

131

117

121

127

135

122

128

133

119

130

Poly T (5)

Poly A (14)

Poly A (5)

Poly A (5);

Poly T (5)

Poly C (5);

63 % de GC

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (5);

Poly C (5)

135

27 8

100

99,54

100

23 6

27 8

99,61 7

100

99,54

100

39 6

27 8

99,34 7

100

99,54

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

130

117

136

131

123

117

119

120

129

133

135

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (5)

Poly T (5);

SNV

Poly A (5)

Poly A (6);

Poly T (5);

Région homologue sur un chromosome différent

Poly T (5)

Poly C (7);

66 % de GC

Poly C (5);

69 % de GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

135

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

123

134

132

121

125

134

118

122

131

133

128

131

129

133

112

SNV

Poly A (5);

SNV

Poly T (5)

Poly A (5)

Poly T (6)

Poly A (5);

Poly T (5);

SNV

Poly T (5);

SNV

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

132

131

119

120

133

112

129

126

119

118

124

117

128

123

133

135

122

117

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (6)

Poly A (5)

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

112

120

115

112

135

131

121

132

133

120

135

126

134

122

Poly A (5)

CT(5)

SNV

Poly T (6)

63 % de GC

Poly A (6);

Poly T (8)

60 % de GC

Poly A (5);

59 % de GC

Poly C (5);

63 % de GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

127

123

125

133

116

135

118

136

131

119

122

123

127

129

130

116

67 % de GC

58 % de GC

Poly G (6);

61 % de GC

Poly T (5)

Poly A (6)

60 % de GC

57 % de GC

Poly T (5)

59 % de GC;

SNV

Poly A (5);

Poly T (5)

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

135 0 0

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

100 0

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

0 100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

0 100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

100

119

121

117

114

129

114

122

127

133

138

Contenu génomique de l’amplicon

Région homologue sur un chromosome différent

Poly A (14)

Région homologue sur un chromosome différent;

SNV

Poly A (5);

Poly C (5)

64 % de GC

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

135 0 0

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

100 0

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

0 100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

0 100

135

45 9

100

99,22

100

45 9

100

99,22

100

45 9

100

99,22

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

101

102

103

104

105

110

111

112

113

114

106

107

108

109

139

116

133

138

136

118

128

120

139

118

10 123

10 121

10 129

10 122

Poly A (5);

57 % de GC

Poly C (5);

67 % de GC

70 % de GC

62 % de GC

60 % de GC

58 % de GC;

SNV

57 % de GC

Poly T (5)

26 % de GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

124

135

119

125

131

10 117

10 116

10 129

11 117

117

113

Contenu génomique de l’amplicon

Poly C (5);

SNV

58 % de GC

Poly T (10)

Poly T (5)

Poly A (5)

Poly T (5);

Région homologue sur un chromosome différent

CA (4)

Poly A (6);

Région homologue sur un chromosome différent

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

135 0 0

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

100 0

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

0 100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

0 100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

131

132

133

134

127

128

129

130

135

136

137

138

139

140

141

129

121

123

127

136

132

115

117

134

131

133

137

131

128 -

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (6)

Poly T (5)

Poly T (8);

19 % de GC

Poly A (5);

Poly T (5)

Poly A (5)

SNV;

26 % de GC

Poly T (8);

SNV

Poly A (5)

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

152

153

154

155

156

157

158

146

147

148

149

142

143

144

145

150

151

133

136

124

122

116

133

117

124

123

115

13 125

13 121

13 123

13 114

13 119

14 122

Poly A (5)

59 % de GC

Poly C (5)

SNV

Poly T (6)

Poly T (5);

26 % de GC

Poly A (5)

58 % de GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

166

167

168

163

164

165

159

160

161

162

169

170

171

172

173

122

121

123

119

135

116

123

116

118

129

131

127

17 118

17 138

Poly C (5)

61 % de GC

Poly C (6);

60 % de GC;

SNV

62 % de GC

Poly C (5);

65 % de GC

Poly G (6);

67 % de GC;

SNV

61 % de GC

Poly C (5)

61 % de GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

178

179

180

181

174

175

176

177

182

183

184

185

186

131

112

124

134

129

133

118

114

118

122

139

19 131

19 141

Contenu génomique de l’amplicon

58 % de GC

Poly A (6)

60 % de GC

Poly G (6);

66 % de GC

64 % de GC

67 % de GC

59 % de GC;

Région homologue sur un chromosome différent

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

100

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

100

135

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

187

188

189

190

191

192

193

194

195

121

138

123

19 138

20 117

22 136

22 122

122

119

Contenu génomique de l’amplicon

Poly C (5);

72 % de GC;

Région homologue sur un chromosome différent

58 % de GC

64 % de GC

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (5);

Poly C (5)

62 % de GC;

SNV

66 % de GC

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels

Nombre total d’appels incorrects

135 0 0

MiSeqDx 2

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

100 0

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

Nombre total d’aucunappels

0 100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects

% d’appels corrects

0 100

135

100

S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible.

Le nombre d’échantillons est calculé à partir de 9 analyses de 15 échantillons (11 échantillons analysés une fois et 2 échantillons analysés deux fois).

3 Le nombre total d’aucun-appels est le nombre total d’aucun-appels obtenu pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx spécifié.

4 Le nombre total d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects obtenus pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx

5 spécifié.

Le pourcentage (%) d’appels corrects correspond au taux d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur la base de données de référence bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence d’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons doivent avoir un indel et d’autres non, par exemple l’amplicon 9.

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

L’amplicon 1 possédait un certain nombre de bases dont le génotype ne pouvait pas être appelé : 12 bases, dans une analyse sur neuf dans NA12881; une base, dans deux analyses sur neuf, et trois bases, dans une analyse sur neuf dans NA12886; 20 bases, dans une analyse sur neuf, et 26 bases, dans une analyse sur neuf dans NA12888. Cela est dû à la faible

8 couverture dans les bases sans aucun appel dans ces analyses, où la profondeur moyenne de séquençage était de 33,2, avec un minimum de 21 et un maximum de 52.

Lorsque le nombre d’aucun-appels n’est pas inclus dans le calcul, le taux d’appels corrects est de 100 %.

L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les renseignements de référence bien caractérisée pour 7 des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 7 échantillons, cette suppression de paire de bases s'appelle un faux négatif et est appelée ainsi de façon

9 reproductible dans les neuf analyses.

L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de renseignements de référence bien caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion d'une paire de bases n'est pas appelée de façon reproductible à 100 % (c.-à-d. qu'il s’agit d’un faux négatif).

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Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Les résultats de l’étude 1 de reproductibilité pour chaque échantillon sont présentés pour l’ensemble des neuf analyses en une seule colonne. Les résultats affichés portent uniquement sur les variants à simple nucléotide et les résultats des insertions/délétions par rapport à la séquence de la base de données de référence pour les trois analyses réalisées sur trois instruments. Cette analyse a montré que les résultats des variants étaient reproductibles dans neuf analyses pour ces

échantillons.

Tableau 6 Résumé des résultats de reproductibilité de la plateforme MiSeqDx pour 13 échantillons bien caractérisés

Nº d’ADN

Identifiant de l’échantillon d’ADN

Nombre d’analyses par échantillon

Nombre de SNV

Variants à simple nucléotide (SNV)

Nombre de bases appelées correctement

Nombre de faux positifs 1

Nombre de faux négatifs 2

Nombre d’indels

Insertions/délétions (indels)

Nombre de bases appelées correctement

Nombre de faux positifs 1

Nombre de faux négatifs 2

NA12877 3

NA12878 3

NA12879

NA12880

NA12881

NA12882

NA12883

NA12884

NA12885

NA12886

NA12887

NA12888

NA12893

1 Faux positif = variant appelé par l’analyse de séquençage MiSeqDx, mais ne figurant pas dans la base de données de référence.

Faux négatif = variant figurant dans la base de données de référence, mais non appelé au cours de l’analyse de séquençage MiSeqDx.

Les échantillons NA12877 et NA12878 ont été analysés deux fois. Les échantillons répliqués ont généré des résultats identiques.

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Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Étude 2

Une étude de reproductibilité de site à site a été effectuée avec un test représentatif, le test de la fibrose kystique à 139 variants Illumina MiSeqDx, incluant un sous-ensemble de variations du gène CFTR pertinentes d’un point de vue clinique analysées avec le logiciel MiSeq Reporter à l’aide de la plateforme de flux de travail de séquençage d’ADN ciblé MiSeqDx. L’étude en aveugle a été réalisée sur trois sites d’essais et a nécessité deux opérateurs sur chaque site. Deux panels bien caractérisés de 46 échantillons chacun ont été analysés par chacun des opérateurs sur chaque site pour un total de 810 appels par site. Les panels contenaient un mélange d’ADN génomique issu des lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR, ainsi que du sang déleucocyté enrichi de lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR. Les échantillons de sang ont été fournis pour permettre l’incorporation des étapes d’extraction utilisées dans la préparation d’ADNg qui sert d’entrée primaire pour le flux de travail du test. Le débit de passage des échantillons, défini comme le nombre d’échantillons passant les métriques QC lors de la première tentative, était de 99,88 %. Tous les résultats des tests sont basés sur un test initial.

Tableau 7 Résumé des résultats de l’étude de reproductibilité réalisée avec un test représentatif de la fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx.

Panel

N° d’échantillon

Génotype de l’échantillon

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

N° de ratés de typage

Nbre d’aucunappels

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

810

804

100

4 1

5 2

S549N (HET)

1812-1 G > A

(HET)

Q493X/F508del

(HET)

F508del/2184delA

(HET)

Y122X/R1158X

(HET)

F508del/2183AA >

G (HET)

R75X (HET)

I507del/F508del

(HET)

810

798

797

798

804

798

665

798

804

798

804

798

1 1

135 2

100

94,44

100

94,44

100

94,44

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Panel

N° d’échantillon

Génotype de l’échantillon

9 3

Variants

F508del/W1282X

(HET)

F508del/3272-26A

> G (HET)

F508del/3849 +

10kbC > T (HET)

621 + 1G > T/3120 +

1G > A (HET)

810

E60X/F508del

(HET)

M1101K (HET)

M1101K (HOM)

F508del (HOM)

F508del/3659delC

(HET)

R117H/F508del

(HET)

621 + 1 G > T / 711

+ 1G > T (HET)

G85E/621 + 1G > T

(HET)

A455E/F508del

(HET)

810

I506V, I507V,

F508C absents

828

810

(TG)10(T)9/

(TG)12(T)5

816

810

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

N° de ratés de typage

Nbre d’aucunappels

12 11 12 798 797 798 2 3 0

798

804

822

798

797

798

804

822

798

804

822

798

3 0

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

97,22

100

99,96

100

99,92

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

A 22

A 23

A 28

Panel

N° d’échantillon

Génotype de l’échantillon

F508del/R560T

(HET)

F508del/Y1092X (C

> A) (HET)

N1303K (HET)

G542X (HOM)

G542X (HET)

G551D/R553X

(HET)

3849 + 10kbC > T

(HOM)

F508del (HET)

1717-1G > A

(HET)

R1162X (HET)

R347P/G551D

(HET)

R334W (HET)

G85E (HET)

Variants

810

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

N° de ratés de typage

Nbre d’aucunappels

810 12 12 12 798 798 798 0 0

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100 100 100

12 12 12 798 798 798 0

804

798

804

798

804

798

804

100

810

804

810

804

810

804

798

804

798

804

798

804

810

804

810

804

810

804

0 s.o.

100

100 s.o.

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Panel

N° d’échantillon

Génotype de l’échantillon

Variants

I336K (HET)

F508del/3849 +

10kbC > T (HET)

621 + 1G > T/3120 +

1G > A (HET)

F508del/3659delC

(HET)

R117H/F508del

(HET)

G85E/621 + 1G > T

(HET)

A455E/F508del

(HET)

N1303K (HET)

(TG)10(T)9/

(TG)12(T)5

G551D/R553X

(HET)

2789 + 5G > A

(HOM)

CFTR dele2,

3/F508del (HET)

F508del/1898 + 1G

> A (HET)

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

N° de ratés de typage

Nbre d’aucunappels

810

804

810

798

804

810

798

804

810

798

810

816

810

798

804

798

804

798

804

798

804

798

804

798

804

798

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100 s.o.

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Panel

N° d’échantillon

Génotype de l’échantillon

F508del/2143delT

(HET)

3876delA (HET)

3905insT (HET)

394delTT (HET)

F508del (HET)

L206W (HET)

G330X (HET)

R347H (HET)

1078delT (HET)

G178R/F508del

(HET)

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

N° de ratés de typage

Nbre d’aucunappels

810

798

810

798

810

798

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

s.o.

100

810

804

810

804

810

804

810

804

810

804

798

804

810

804

810

804

810

804

810

804

798

804

810

804

810

804

810

804

810

804

798

0 s.o.

100

100 s.o.

100

100 s.o.

s.o.

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

B 67

B 72

75 2

B 78

Panel

N° d’échantillon

Génotype de l’échantillon

S549R (c.1647T >

G) (HET)

S549N (HET)

W846X (HET)

E92X/F508del

(HET)

621 + 1G >

T/1154insTC

(HET)

G542X (HET)

F508del (HET)

621 + 1G >

T/A455E (HET)

1812-1 G > A

(HET)

F508del/R553X

(HET)

Variants

810

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

N° de ratés de typage

Nbre d’aucunappels

810 6 6 6 804 804 804 0 0

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100 100 100

804

810

798

804

810

798

804

810

798

12 12 12 798 798 797 0

100

100 s.o.

100

99,96

100

99,96

6 6 6

804

798

804

670

804

798

804

798

804 804 804 0

810

798

810

798

810

798

135 2

100

94,44

100

100 s.o.

100

94,44

100

94,44

100

| nº 15070068 Rév. A FRA

Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Panel

N° d’échantillon

Génotype de l’échantillon

Total

Variants

F508del/G551D

(HET)

R347P/F508del

(HET)

R117H/F508del

(HET)

I507del (HET)

2789 + 5G > A

(HOM)

CFTR dele2,

3/F508del (HET)

F508del/1898 + 1G

> A (HET)

F508del/2143delT

(HET)

3905insT (HET)

394delTT (HET)

F508del (HET)

(TG)10(T)9/

(TG)12(T)5

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

N° de ratés de typage

Nbre d’aucunappels

810 12 12 12 798 798 798 0 0

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100 100 100

810

816

810

74 556

2209

798

804

798

810

798

804

221 182

798

804

797

798

810

798

804

798

804

798

810

798

804

273

100

100 s.o.

100

99,77

100

99,96

100

99,88

100

99,96

100

99,88

L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant N1303K pour un réplicat, n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.

Un réplicat des échantillons 5 et 75 avait un débit d’appel de 0 %. Le complément d’enquête indique que des échantillons pourraient ne pas avoir été ajoutés à la plaque d’échantillon

4 avant la préparation de la librairie, car les volumes d’échantillon restants dans les tubes ne correspondaient à aucun volume ayant été supprimé.

Des preuves indiquent que les échantillons 9 et 10 ont vraisemblablement été échangés par l’opérateur avant la préparation de la librairie.

L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant M1V pour un réplicat de chacun des deux échantillons n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.

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Mars 2015

Instrument MiSeqDx

Extraction d’ADN

Trois différentes méthodes d’extraction, à savoir l’extraction à base de billes magnétiques, la précipitation dans l’alcool et la filtration sur colonne de silice, ont été évaluées à l’aide du sang total anticoagulé K

EDTA. Quatorze échantillons de sang unique ont été utilisés dans l’étude, représentant une plage de génotypes d’un seul gène représentatif. Les trois méthodes d’extraction de l’ADN ont été testées indépendamment par 2 opérateurs différents qui ont chacun effectué

3 analyses par méthode d'extraction. Chaque extraction a été réalisée par chaque opérateur à des jours différents. La concentration d’ADN et le rapport A260/A280 des échantillons d’ADN génomique extrait ont été déterminés par spectrophotométrie. La taille totale des échantillons pour chaque méthode d’extraction dans cette étude était de 168

(14 échantillons x 2 opérateurs/méthode d’extraction x 3 analyses/opérateur x 2 réplicats/échantillon d’ADN génomique extrait).

Méthode d’extraction

Nombre d’échantillons testés

Débit d'appel

100 % Précipitation dans l’alcool

Filtration sur colonne de silice

Extraction à base de billes magnétiques

168

100 %

Précision 1

100 %

Débit au premier passage de l’échantillon 2

100 %

Précision : la concordance en pour cent avec une méthode d'essai de référence (séquençage bidirectionnel de Sanger) calculée pour les positions de base qui reçoivent un appel de base.

2 Débit au premier passage de l’échantillon : le nombre d'échantillons respectant le taux d’appel spécifié la première fois qu’ils sont traités (c’est-à-dire, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une nouvelle analyse ou un traitement supplémentaire) en pourcentage du nombre total d’analyses d’échantillons au cours d’une seule expérience de séquençage MiSeqDx.

Entrée d’ADN

La plage d’entrée d’ADN pour la plateforme MiSeqDx a été évaluée en effectuant une étude de dilution en série à l’aide de 14 échantillons d'ADN représentatifs contenant 16 variants du gène unique. Chaque échantillon a été testé en double exemplaire à 9 niveaux d'entrée d'ADN allant de 1 250 ng à 1 ng (1 250 ng, 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng,

10 ng, 5 ng et 1 ng). Pour la détermination de la précision, des génotypes de l’échantillon ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel par la méthode de Sanger. La limite supérieure de l’entrée d’ADN a été déterminée à

25 ng et la limite inférieure à 1 250 ng pour une entrée d'ADN, puisqu'elles présentaient un débit au premier passage de l'échantillon ≥ 95 sans appels incorrects (précision et débit d'appel de 100 %).

Les entrées d’ADN de 1 250 ng, 250 ng et 100 ng ont fait l’objet d’autres tests avec 4 échantillons d'ADN représentatifs et

20 réplicats par niveau d'entrée d’ADN pour chaque échantillon (n = 4 * 20 = 80 échantillons), tandis que la limite inférieure de 25 ng a été testée avec 14 échantillons, 20 réplicats pour chaque échantillon (n = 14 * 20 = 280 échantillons).

Le débit au premier passage de l’échantillon et le taux de précision était de 100 % à tous les niveaux d'entrée d'ADN et les taux d’appel de l’échantillon étaient > 99 %.

Substances interférentes

Pour évaluer l’impact des substances interférentes sur la plateforme MiSeqDx, un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases a été évalué en présence et en absence d’interférences potentielles. Huit échantillons de sang total représentant huit génotypes uniques ont été utilisés dans l’étude. Quatre substances interférentes endogènes

(bilirubine, cholestérol, hémoglobine et triglycérides) ont été testées en les intégrant dans les échantillons de sang total avant l’extraction d’ADN. Pour évaluer l’interférence résultant du prélèvement sanguin (petit volume), de l’EDTA a été intégré dans des échantillons de sang à deux concentrations. Les limites de concentration pour chaque substance sont indiquées dans le tableau ci-dessous. En outre, afin d’évaluer les interférences résultant de la préparation des

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Instrument MiSeqDx

échantillons, on a ajouté 15 % de tampon de lavage à 8 ADN génomiques purifiés. Un débit d’appel de 100 % a été atteint pour tous les échantillons testés, en plus des 100 % de reproductibilité dans les typages génotypiques entre les

échantillons en présence et l'absence de substances interférentes.

Substance de test

Bilirubine

Cholestérol

Hémoglobine

Triglycéride

EDTA

Nombre total de réplicats

Concentration analysée dans le sang

(limite supérieure)

684 µmol/L

13 mmol/L

2 g/L

37 mmol/L

7 mg/mL

Concentration analysée dans le sang

(limite inférieure)

137 µmol/L

2,6 mmol/L

0,4 g/L

7,4 mmol/L

2,8 mg/mL

Débit d’appel

100 %

Indexage de l’échantillon

Des primers d’indexage de l’échantillon sont utilisés dans la trousse pour attribuer un code à barres unique à chaque

échantillon d’ADN, permettant de grouper plusieurs échantillons en une seule analyse de séquençage.

Un total de 96 index d’échantillons a été analysé à l’aide d’un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases grâce à 8 échantillons d’ADN unique pour vérifier la capacité du test à faire systématiquement un appel de génotypage pour un échantillon donné à travers des combinaisons différentes de primers d’indexage. Chaque

échantillon a été analysé avec 12 combinaisons différentes de primers d’indexage. Quarante-huit (48) combinaisons d’index ont été testées en une seule analyse de séquençage. Les résultats des échantillons ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel de Sanger pour l’ensemble des positions/variants. La reproductibilité et la précision ont

été 100 % pour toutes les combinaisons de primers d’échantillon/index.

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