illumina MiSeqDx MD Manuel utilisateur
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Instrument MiSeqDxMD DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT Nº de référence DX-410-1001 Utilisation prévue Le MiSeqDx d’Illumina est un instrument de séquençage qui mesure les signaux de fluorescence des nucléotides marqués grâce à l’utilisation de Flow Cell et de réactifs spécifiques à l’instrument (Trousse universelle MiSeqDx 1.0), de matériel d’imagerie et d’un logiciel d’analyse de données. La plateforme MiSeqDx est destinée au séquençage ciblé d’ADN génomique humain provenant d’échantillons de sang total périphérique. La plateforme MiSeqDx n’est pas destinée au séquençage de génome entier ou de novo. MiSeqDx est destiné à être utilisé avec des tests de diagnostic in vitro et des trousses de réactifs fournis par Illumina. Principes procéduraux La plateforme MiSeqDx d’Illumina est destinée au reséquençage ciblé d’ADN génomique humain provenant d’échantillons de sang total périphérique à l’aide des consommables fournis par Illumina. L’ADN génomique est traité à travers les étapes de préparation de la librairie, qui amplifient spécifiquement les régions génomiques prévues de chaque échantillon en utilisant les oligonucléotides personnalisés conçus par l’utilisateur, tout en ajoutant les index et les séquences de capture des Flow Cell aux produits amplifiés. La préparation de la librairie comporte quatre étapes clés : l’hybridation, l’extension-ligation, l’amplification de PCR et la normalisation de librairie. Les librairies d’échantillons normalisées qui en résultent sont prêtes pour le séquençage sur l’instrument MiSeqDx d’Illumina à l’aide de la chimie SBS (séquençage par synthèse). La chimie SBS utilise une méthode basée sur des terminateurs réversibles pour détecter les bases à simple nucléotide à mesure qu’elles sont intégrées aux brins d’ADN croissants. Le logiciel d’analyse en temps réel (RTA) exécute les analyses d’images et la définition des bases tout en affectant un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Lorsque l’analyse primaire prend fin, le logiciel MiSeq Reporter sur l’instrument MiSeqDx traite les définitions de bases par le biais d’une analyse secondaire qui inclut le démultiplexage, la génération de fichiers FASTQ, l’alignement, l’appel des variants et la génération de fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants trouvés à des positions spécifiques dans un génome de référence. Limites de la procédure 1 2 3 4 5 6 Destiné au diagnostic in vitro. Ce produit présente les limites suivantes : — Sortie de séquençage > 1 Go — Lectures > 3 millions — Longueur de lecture (en analyse à lecture appariée) 2 × 150 bp — Bases supérieures à Q30 > 75 % (plus de 75 % des bases ont un score de qualité Phred supérieur à 30, indiquant une précision de définition des bases supérieure à 99,9 %) Les variants dans les analyses homopolymères comptant plus de huit bases seront filtrés dans les fichiers VCF (filtre R8). Le système a été validé pour la détection des SNV et des délétions de trois bases maximum. L’évaluation des insertions d’une base a été limitée à trois insertions différentes sur trois chromosomes distincts. Le système rencontre des problèmes de détection des insertions ou délétions d’une base dans les tronçons homopolymères (p. ex. le polyA). Le système MiSeqDx est conçu pour offrir des résultats qualitatifs (c.-à-d. de génotype). Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA |1 Instrument MiSeqDx 7 8 Comme avec n’importe quel flux de travail à base d’hybridation, les polymorphismes, mutations, insertions ou délétions sous-jacents dans les régions de liaison d’un oligonucléotide peuvent affecter les allèles sondés et, par conséquent, les appels faits. La couverture minimale recommandée par amplicon nécessaire pour un appel de variants précis (Q(max_gt | poly_site) >= 100) est de 75 ×. Composants du produit Le MiSeqDx d’Illumina comprend les composants suivants : • Instrument MiSeqDx (Nº de référence DX-410-1001) Les composants logiciels suivants sont nécessaires au fonctionnement et à l’analyse des données sur MiSeqDx : Application Fonction logicielle MOS : logiciel d’exploitation MiSeqDx RTA : logiciel d’analyse en temps réel MiSeq Reporter Commande le fonctionnement de l’instrument. Effectue l’analyse primaire. Effectue l’analyse secondaire. Description L’application logicielle MOS gère le fonctionnement de l’instrument au cours du séquençage et génère des images utilisées par le logiciel d’analyse en temps réel (RTA). L’application logicielle RTA convertit les images générées par MOS pour chaque plaque par cycle de l’analyse de séquençage dans les fichiers de définition des bases qui constituent des entrées pour le logiciel MiSeq Reporter. L’application logicielle RTA ne contient pas d’interface utilisateur. Le logiciel MiSeq Reporter traite les définitions de bases par le biais d’une analyse secondaire qui inclut le démultiplexage, la génération de fichiers FASTQ, l’alignement, l’appel des variants et la génération de fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants trouvés à des positions spécifiques dans un génome de référence. Stockage et manipulation Élément Caractéristique Température Transport et stockage : -10 à 40 °C (14 à 104 °F) Humidité Conditions d’utilisation : 19 à 25 °C (66 à 77 °F) Transport et stockage : humidité sans condensation Conditions d’utilisation : 30 à 75 % d’humidité relative (sans condensation) Équipement et matériel nécessaires, non fournis Consommables pour le séquençage Trousse universelle MiSeqDx 1.0 (nº de référence DX-103-1001) Consommables fournis par l’utilisateur Vérifiez que les consommables fournis par l’utilisateur qui suivent sont disponibles avant de commencer une analyse. Consommable Utilisation Lingettes alcoolisées, isopropyle à 70 % Nettoyage du portoir de Flow Cell ou éthanol à 70 % Tissu de laboratoire non pelucheux Papier pour lentilles, 10,1 × 15,2 cm (4 × 6 po). 2 | Référence 15050260, rév. B FRA Nettoyage de la platine de Flow Cell Nettoyage de la Flow Cell Février 2015 Instrument MiSeqDx Consommable Utilisation Tween 20 Brucelles en plastique à bout carré (facultatif) Eau sans DNase ni RNase Nettoyage de l’instrument Retrait de la Flow Cell de son contenant d’expédition Nettoyage de l’instrument Recommandations à propos de l’eau sans DNase ni RNase Utilisez toujours de lʼeau sans DNase ni RNase pour réaliser des procédures sur l’instrument. Nʼutilisez jamais dʼeau courante ou dʼeau déionisée. Tous les exemples suivants sont acceptables : • • • • Eau 18 mégaohms (MΩ) Eau Milli-Q Eau Super-Q Eau de qualité biologie moléculaire Avertissements et précautions ATTENTION La loi fédérale américaine n’autorise la vente de ce dispositif que sur ordonnance ou par un médecin ou tout autre professionnel de la santé autorisé par la législation de l’État dans lequel il ou elle exerce à utiliser ou ordonner l’utilisation de cet appareil. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Certains composants des réactifs fournis par Illumina à utiliser avec l’instrument MiSeqDx contiennent du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. (Consultez les notices propres aux produits pour plus de renseignements.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Certains composants des trousses de réactifs fournies par Illumina contiennent du 2-mercaptoéthanol, un agent réducteur. (Consultez les notices propres aux produits pour plus de renseignements.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Utilisez ces composants dans une zone bien aérée et mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Manipulez tous les échantillons comme s’ils étaient des agents potentiellement infectieux. Le non-respect des procédures comme décrites peut entraîner des résultats erronés ou une baisse considérable de la qualité des échantillons. Utilisez les précautions de routine en laboratoire. Ne pipettez pas avec la bouche. Il est interdit de manger, de boire et de fumer dans les zones de travail indiquées. Portez des gants jetables et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des échantillons et des réactifs de la trousse. Lavez-vous les mains soigneusement après avoir manipulé les échantillons et les réactifs de la trousse. Les pratiques de laboratoire appropriées et la bonne hygiène du laboratoire sont nécessaires pour empêcher les produits PCR de contaminer les réactifs, les instruments et les échantillons d’ADN génomique. La contamination par des produits PCR peut causer des résultats erronés et non fiables. Pour éviter la contamination, veillez à ce que les zones de préamplification et de post-amplification possèdent un équipement réservé (p. ex. pipettes, pointes de pipette, agitateur vortex et centrifugeuse). Une paire index-échantillon doit correspondre exactement à la feuille d’échantillons. Les inadéquations entre la feuille d’échantillons et le schéma de la plaque entraîneront une perte de l’identification positive des échantillons et un rapport de résultats incorrect. Durant l’étape de normalisation de la librairie de la notice du réactif en question, il est extrêmement important de resuspendre complètement le culot des billes de la librairie. Cette étape est essentielle pour obtenir une densité consistante des amplifiats sur la Flow Cell MiSeqDx. Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA |3 Instrument MiSeqDx 10 Suivez les temps d’incubation indiqués dans les étapes de normalisation de la librairie comme indiqué dans la notice d’accompagnement du réactif concerné. Une incubation inappropriée peut affecter la représentation de la librairie et la densité des amplifiats. 11 Il est vivement recommandé d’installer le logiciel antivirus fourni par l’utilisateur afin de protéger l’ordinateur des virus. Consultez le manuel de l’utilisateur pour obtenir des instructions relatives à l’installation. 12 N’utilisez pas l’instrument MiSeqDx si l’un des panneaux a été retiré. L’utilisation de l’instrument, lorsque l’un des panneaux a été retiré, crée un risque d’exposition à la tension secteur et à plusieurs tensions continues. 13 Ne touchez pas la platine de Flow Cell dans le compartiment de Flow Cell. Le réchauffeur dans ce compartiment fonctionne entre 22 et 95 °C et peut causer des brûlures. 14 L’instrument pèse environ 57 kg (126 livres) et peut causer des blessures graves s’il tombe ou s’il est manipulé sans précaution. Notes procédurales Le débit d’échantillons par analyse MiSeqDx peut être compris entre 8 et 48 échantillons. Les primers d’indexage utilisés pendant l’amplification par PCR doivent être choisis en fonction du débit d’échantillons final souhaité pour assurer la diversité dans la séquence d’indexage. REMARQUE Pour une efficacité maximale du débit, procédez à la préparation de la librairie pour 96 échantillons au plus, puis répartissez les échantillons en deux analyses de séquençage avec un maximum de 48 échantillons par analyse. MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour séquencer des bases G/T et un voyant DEL rouge pour séquencer des bases A/C. À chaque cycle, au moins un des deux nucléotides de chaque canal de couleur doit être lu pour assurer l’enregistrement approprié. Il est important de maintenir l’équilibrage des couleurs pour chaque base de la lecture d’index en cours de séquençage, sinon un échec de l’enregistrement pourrait se produire lors du séquençage de la lecture d’index. Si le séquençage est inférieur à 48 échantillons dans une analyse de séquençage, sélectionnez les index appropriés sur la base de leurs séquences pour maintenir l’équilibrage des couleurs dans les canaux verts et rouges. Au minimum, les analyses comportant 8 à 48 échantillons doivent inclure les combinaisons de primers d’indexage figurant dans la notice d’accompagnement de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0. Pour effectuer avec précision des analyses plus petites, au moins huit échantillons doivent être présents. Si six échantillons uniques (à l’exclusion des contrôles positifs et négatifs) ne sont pas disponibles, il convient d’effectuer l’analyse avec les réplicats d’échantillon ou n’importe quel échantillon d’ADN génomique humain. Consultez la notice d’accompagnement de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0 pour connaître l’ensemble minimal d’indices à équilibre chromatique à utiliser pour les analyses de séquençage de huit échantillons. Mode d’emploi Le mode d’emploi suivant de l’instrument MiSeqDx requiert l’utilisation des réactifs fournis dans la trousse Trousse universelle MiSeqDx 1.0. Préparation de la feuille d’échantillons MiSeqDx 1 2 3 4 5 6 4 Dans l’écran d’accueil de Illumina Worklist Manager, sélectionnez Create Worklist (Créer la liste de travail). Dans le champ Test Type (Type de test), sélectionnez MiSeqDx universel. Dans le champ Worklist Name (Nom de la liste de travail), saisissez un nom pour la feuille d’échantillons. — Si l’identifiant du code à barres de la cartouche de réactifs alphanumérique est utilisé pour le nom de la feuille d’échantillons, le MiSeq Operating Software (MOS) trouve automatiquement la feuille d’échantillons. — Si vous utilisez un autre nom pour la feuille d’échantillons, le bouton Browse (Parcourir) situé dans le MiSeq Operating Software (MOS) peut être utilisé afin de trouver la feuille d’échantillons appropriée. [Facultatif] Entrez une description pour identifier l’analyse. Assurez-vous que la date correspond à la date de début de l’analyse. Sélectionnez Next (Suivant). | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Entrer des renseignements sur l’échantillon 1 2 3 4 5 Dans l’onglet Table (Tableau) ou l’onglet Plate (Plaque), saisissez les renseignements suivants pour chaque puits contenant un échantillon : a Identifiant de l’échantillon : saisissez un seul identifiant d’échantillon. b Index 1 et Index 2 : spécifiez l’adaptateur d’index qui sera utilisé pour chaque lecture d’index. c Manifest (Manifeste) : précisez le nom du fichier de manifeste qui contient les renseignements sur les échantillons dans ce puits en particulier. [Facultatif] Pour enregistrer des renseignements plus détaillés sur les échantillons, saisissez un nom et une description. [Facultatif] Pour identifier les contrôles sur la plaque, sélectionnez Negative (Négatif) ou Positive (Positif) dans le menu déroulant Control (Contrôle). Accédez à l’onglet Plate Graphic (Graphique de la plaque) et utilisez les options Copy to Clipboard (Copier vers le bloc-notes) ou Print (Imprimer) pour capturer une image de la plaque d’échantillon. Sélectionnez Finish (Terminer). Préparation des échantillons Suivez les étapes suivantes conformément au mode d’emploi figurant dans la notice d’accompagnement de la trousse universelle MiSeqDx 1.0 : • • • • • • • Hybridation du pool d’oligonucléotides Retrait des oligonucléotides non liés Extension-ligation des oligonucléotides liés Amplification PCR Nettoyage PCR Normalisation de librairie Groupement de librairies Préparer la cartouche de réactifs 1 2 3 Décongelez la Cartouche de réactifs MiSeqDx dans un bain d’eau contenant assez d’eau déionisée à température ambiante pour submerger la base de la cartouche de réactifs jusqu’à la ligne de délimitation de l’eau imprimée sur la cartouche de réactifs. Le niveau de l’eau ne doit pas dépasser la ligne de délimitation de l’eau maximale. Laissez la cartouche de réactifs décongeler dans le bain dʼeau à température ambiante pendant environ une heure ou jusquʼà décongélation complète. Retirez la cartouche du bain d’eau et tapotez-la doucement contre la paillasse pour retirer l’eau de la base de la cartouche. Séchez la base de la cartouche. Assurez-vous que lʼeau n’a pas éclaboussé la partie supérieure de la cartouche de réactifs. Inspecter la cartouche de réactifs 1 Retournez la cartouche de réactifs 10 fois pour mélanger les réactifs décongelés, puis vérifiez visuellement que toutes les positions sont décongelées. REMARQUE Il est essentiel que les réactifs contenus dans la cartouche soient parfaitement décongelés et mélangés afin de garantir un séquençage correct. 2 Inspectez visuellement les réactifs des positions 1, 2 et 4 pour vérifier quʼils sont complètement mélangés et quʼils ne contiennent pas de précipités. Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA |5 Instrument MiSeqDx 3 Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair dans les réactifs. REMARQUE Les tubes des dispositifs dʼaspiration MiSeqDx descendant au fond de chaque réservoir pour aspirer les réactifs, il est important quʼaucune bulle dʼair ne reste dans les réservoirs. 4 Placez la cartouche de réactifs sur la glace ou réservez-la à une température comprise entre 2 et 8 °C (jusqu’à 6 heures) jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer lʼanalyse. Pour obtenir de meilleurs résultats, chargez directement l’échantillon et configurez lʼanalyse. Préparer des échantillons pour le séquençage 1 2 3 4 5 6 7 Ramenez le Tampon de dilution de librairie à température ambiante. Mélangez le Tampon de dilution de librairie et assurez-vous que tous les précipités sont complètement dissous. Si la plaque SGP a été conservée congelée, décongelez la plaque SGP à température ambiante. Centrifugez la plaque SGP à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute. Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube PAL). Déterminez les échantillons à regrouper pour le séquençage. Un maximum de 48 échantillons peut être regroupé pour le séquençage. Si la plaque SGP a été conservée congelée, mélangez chaque librairie à séquencer en pipettant de haut en bas trois à cinq fois. Transférez 5 µl de chaque librairie à séquencer de la plaque SGP, colonne par colonne, à une barrette de huit tubes PCR. Scellez la plaque SGP avec un joint adhésif de plaque et réservez. REMARQUE Après utilisation, conservez la plaque SGP scellée à une température de -25 °C à -15 °C. La plaque SGP scellée est stable pendant un maximum de trois jours. 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Combinez et transférez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL. Mélangez le tube PAL soigneusement. Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube DAL). Ajoutez 585 µl de Tampon de dilution de librairie au tube DAL. Ajoutez 6 µl de Contrôle interne PhiX de 20 pM au tube DAL. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total. Transférez 9 µl du PAL dans le tube DAL contenant le Tampon de dilution de librairie. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total. Mélangez le tube DAL sous agitateur vortex à vitesse maximale. Centrifugez le tube DAL à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute. Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant à 96 °C pendant 2 minutes. Après l’incubation, retournez le tube DAL une à deux fois pour mélanger, puis placez-le immédiatement dans un bain d’eau glacée. Gardez le tube DAL dans un bain d’eau glacée pendant 5 minutes. Charger des librairies d’échantillons sur la cartouche 1 2 3 6 Utilisez une pointe de pipette séparée, propre et vide de 1 ml pour percer l’opercule en aluminium scellant le réservoir sur la cartouche de réactifs étiquetée Load Samples (Charger les échantillons). Transférez à l’aide de la pipette 600 µl des librairies d’échantillons du DAL dans le réservoir Load Samples (Charger les échantillons). Prenez soin d’éviter de toucher l’opercule en aluminium lors de la distribution de l’échantillon. Vérifiez s’il y a des bulles d’air dans le réservoir après le chargement de l’échantillon. Si des bulles d’air sont présentes, tapotez légèrement la cartouche sur la paillasse pour les libérer. Passez directement à la configuration de l’analyse depuis l’interface MiSeq Operating Software (MOS). | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Configuration de l’analyse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Connectez-vous au MiSeq Operating Software (MOS). Sélectionnez Sequence (Séquencer). Une série d’écrans de configuration de l’analyse s’affichent dans l’ordre suivant : Select Run Type (Sélectionner le type dʼanalyse), Load Flow Cell (Charger la Flow Cell), Load Reagents (Charger les réactifs), Review (Révision) et Pre-Run Check (Vérification avant analyse). Sélectionnez Diagnostic Run (Analyse de diagnostic). Lorsque l’écran Load Flow Cell (Charger la Flow Cell) s’affiche, nettoyez et chargez la Flow Cell. Fermez le verrou de Flow Cell et la porte du compartiment de Flow Cell. Le verrou et la porte du compartiment doivent être fermés avant le lancement de l’analyse. Une fois la Flow Cell chargée, le logiciel lit et enregistre lʼidentification par radiofréquence (RFID). Une confirmation de lecture RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran. Lorsque l’écran Load Reagents (Charger les réactifs) s’affiche, videz le flacon à déchets, chargez le flacon de Solution SBS (PR2) MiSeqDx, puis chargez la cartouche de réactifs. Lorsque le flacon de MiSeqDx SBS Solution (PR2) et la cartouche de réactifs sont chargés, le logiciel lit et enregistre le RFID. Une confirmation de lecture RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran. Sélectionnez la feuille d’échantillons appropriée. Par défaut, le logiciel recherchera un fichier de feuille dʼéchantillons avec un nom correspondant au code à barres de la cartouche de réactifs chargée sur lʼinstrument. Confirmez les paramètres d’analyse et les résultats de la vérification avant analyse. Démarrez l’analyse. Lʼécran Sequencing (Séquençage) sʼouvre lorsque lʼanalyse démarre. Cet écran fournit une représentation visuelle de lʼanalyse en cours, y compris les intensités et les scores de qualité. Résultats Le logiciel d’analyse primaire intégré (analyse temps réel ou RTA) exécute les analyses d’images et les définitions de bases tout en affectant un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Une fois l’analyse primaire terminée, le logiciel MiSeq Reporter sur l’instrument MiSeqDx lance une analyse secondaire, comme décrit cidessous. Démultiplexage Le démultiplexage est la première étape dans l’analyse si la feuille d’échantillons répertorie plusieurs échantillons et que l’analyse comporte des lectures d’index. Le démultiplexage sépare les données des échantillons groupés en fonction de séquences d’indexage courtes qui marquent les échantillons provenant de librairies différentes. Chaque séquence de lecture d’index est comparée aux séquences d’indexage définies dans la feuille d’échantillons. Aucune valeur de qualité n’est prise en compte lors de cette étape. Génération de fichier FASTQ Après le démultiplexage, MiSeq Reporter génère des fichiers intermédiaires au format FASTQ, un format texte utilisé pour représenter des séquences. Les fichiers FASTQ contiennent les lectures pour chaque échantillon ainsi que les scores de qualité, à l’exclusion des lectures provenant de tout amplifiat qui n’est pas passé par le filtre. Le score de qualité est calculé de la façon suivante : -10 log10 P, où P est la probabilité que la définition des bases soit incorrecte. Alignement L’alignement compare les séquences par rapport à la référence pour identifier une relation entre les séquences et attribue un score en fonction des régions de similarité. Les lectures alignées sont écrites dans des fichiers au format BAM. Pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, MiSeq Reporter utilise un algorithme de Smith-Waterman par bande, qui effectue des alignements de séquence locaux pour identifier des régions similaires entre deux séquences. Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA |7 Instrument MiSeqDx Appel des variants Pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, MiSeq Reporter utilise le paramètre d’appel des variants Starling qui appelle les SNP et les petits indels et résume la profondeur et les probabilités pour chaque site du génome. Starling génère des rapports au format html sur les SNP et les indels ainsi que des fichiers de texte séparé par des tabulations contenant des variants au format Variant Call Format (VCF). Pour obtenir des renseignements sur le calcul des résultats à partir des fichiers VCF, consultez le Guide de l’utilisateur de MiSeq Reporter (nº 15039188). Caractéristiques de performance Précision Trois études distinctes ont été menées pour évaluer la précision de la plateforme MiSeqDx. Étude 1 Cette étude a utilisé un test représentatif conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et contenant des exons potentiellement pertinents d’un point de vue clinique. Les 13 échantillons uniques utilisés dans cette étude proviennent de deux parents et 11 enfants qui ont été fréquemment séquencés par plusieurs laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Il y a six échantillons de sujets féminins et sept échantillons de sujets masculins. La précision a été déterminée pour les variants mononucléotides (SNV) en comparant les données de l’étude à une base de données de référence bien caractérisée. La séquence de la base de données de référence a été obtenue à partir de la combinaison de plusieurs méthodes de séquençage, de données accessibles au public et de renseignements sur l’hérédité. Le tableau suivant permettant d’évaluer la précision du système a été établi à partir des données de la première analyse au cours de l’étude. Le test n’a pas été répété pour cette étude. Les résultats de cette étude sont présentés ci-dessous. 8 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Tableau 1 Données de précision de niveau amplicon de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx Amplicon 1 Chromosome 1 Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 132 Poly C (5), 13 15 132 0 132 0 100 6 % d’appels corrects7 63 % en GC 2 1 128 Poly T (5) 13 15 128 0 128 0 100 3 2 133 - 13 15 133 0 133 0 100 4 2 119 - 13 15 119 0 119 0 100 5 2 127 Poly T (5) 13 15 127 0 127 0 100 6 2 135 Poly A (6) 13 15 135 0 135 0 100 7 2 122 Poly T (5), 13 15 122 0 122 0 100 Poly C (5) 8 2 110 Poly T (5) 13 15 110 0 110 0 100 98 2 131 Poly A (14) 13 15 130-131 0 130-131 9 99,54 10 2 117 - 13 15 117 0 117 0 100 11 2 121 - 13 15 121 0 121 0 100 12 2 114 - 13 15 114 0 114 0 100 13 2 129 Poly A (5) 13 15 129 0 129 0 100 14 3 131 Poly A (5), 13 15 131 0 131 0 100 Poly T (5) 9 15 3 130 - 13 15 130 0 130 0 100 16 3 130 - 13 15 130 0 130 0 100 17 3 117 - 13 15 117 0 117 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 18 3 136 Poly T (5) 13 15 136 0 136 0 100 19 3 131 Poly T (5), 13 15 131 0 131 0 100 SNV 20 3 123 Poly A (5) 13 15 123 0 123 0 100 21 3 117 Poly A (6), 13 15 117 0 117 0 100 Poly T (5), Région homologue sur un chromosome différent 22 3 119 Région homologue sur un chromosome différent 13 15 119 0 119 0 100 23 3 120 - 13 15 120 0 120 0 100 24 3 129 Poly T (5) 13 15 129 0 129 0 100 25 4 133 Poly C (7), 13 15 133 0 133 0 100 13 15 135 0 135 0 100 66 % en GC 26 4 135 Poly C (5), 69 % en GC 10 27 4 123 SNV 13 15 123 0 123 0 100 28 4 134 - 13 15 134 0 134 0 100 29 4 132 - 13 15 132 0 132 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon 30 Chromosome 4 Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 121 Poly A (5), 13 15 121 0 121 0 100 6 % d’appels corrects7 SNV 31 4 125 - 13 15 125 0 125 0 100 32 4 134 Poly T (5) 13 15 134 0 134 0 100 33 4 118 - 13 15 118 0 118 0 100 34 4 122 Poly A (5) 13 15 122 0 122 0 100 35 4 131 - 13 15 131 0 131 0 100 36 4 133 - 13 15 133 0 133 0 100 37 4 128 Poly T (6) 13 15 128 0 128 0 100 38 4 131 - 13 15 131 0 131 0 100 39 4 129 Poly A (5), 13 15 129 0 129 0 100 13 15 133 0 133 0 100 Poly T (5), SNV 40 4 133 Poly T (5), SNV 11 41 4 112 SNV 13 15 112 0 112 0 100 42 4 133 - 13 15 133 0 133 0 100 43 4 135 - 13 15 135 0 135 0 100 44 4 122 - 13 15 122 0 122 0 100 45 4 117 - 13 15 117 0 117 0 100 469 4 124 - 13 15 125 0 125 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon 12 Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 47 4 117 Poly T (5) 13 15 117 0 117 0 100 48 4 128 Poly A (7) 13 15 128 0 128 0 100 49 4 123 Poly A (6) 13 15 123 0 123 0 100 50 4 133 - 13 15 133 0 133 0 100 51 4 112 - 13 15 112 0 112 0 100 52 4 129 - 13 15 129 0 129 0 100 53 4 126 - 13 15 126 0 126 0 100 54 4 132 - 13 15 132 0 132 0 100 55 5 131 - 13 15 131 0 131 0 100 56 5 119 - 13 15 119 0 119 0 100 57 5 120 Poly A (5) 13 15 120 0 120 0 100 58 5 119 - 13 15 119 0 119 0 100 59 5 118 - 13 15 118 0 118 0 100 60 5 112 - 13 15 112 0 112 0 100 61 5 120 - 13 15 120 0 120 0 100 62 5 120 Poly A (5) 13 15 120 0 120 0 100 63 5 115 CT(5) 13 15 115 0 115 0 100 64 5 112 SNV 13 15 112 0 112 0 100 65 5 135 Poly T (6) 13 15 135 0 135 0 100 66 5 131 63 % en GC 13 15 131 0 131 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 67 5 121 - 13 15 121 0 121 0 100 68 5 132 Poly A (6), 13 15 132 0 132 0 100 Poly T (8) 69 7 133 - 13 15 133 0 133 0 100 70 7 120 60 % en GC 13 15 120 0 120 0 100 71 7 135 - 13 15 135 0 135 0 100 72 7 126 Poly A (5), 13 15 126 0 126 0 100 59 % en GC 73 7 134 - 13 15 134 0 134 0 100 74 7 122 Poly C (5), 13 15 122 0 122 0 100 13 15 127 0 127 0 100 63 % en GC 75 7 127 59 % en GC; SNV 76 7 123 - 13 15 123 0 123 0 100 77 7 125 - 13 15 125 0 125 0 100 78 7 133 Poly A (5), 13 15 133 0 133 0 100 Poly T (5) 13 79 7 116 - 13 15 116 0 116 0 100 80 7 135 - 13 15 135 0 135 0 100 81 7 118 - 13 15 118 0 118 0 100 82 7 136 67 % en GC 13 15 136 0 136 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 83 7 131 58 % en GC 13 15 131 0 131 0 100 84 7 119 Poly G (6), 13 15 119 0 119 0 100 61 % en GC 14 85 7 122 Poly T (5) 13 15 122 0 122 0 100 86 7 123 Poly A (6) 13 15 123 0 123 0 100 87 8 127 60 % en GC 13 15 127 0 127 0 100 88 8 129 57 % en GC 13 15 129 0 129 0 100 89 9 130 Poly T (5) 13 15 130 0 130 0 100 90 9 116 - 13 15 116 0 116 0 100 91 9 119 Région homologue sur un chromosome différent 13 15 119 0 119 0 100 92 9 121 - 13 15 121 0 121 0 100 93 9 117 Région homologue sur un chromosome différent 13 15 117 0 117 0 100 94 9 114 - 13 15 114 0 114 0 100 9510 9 129 Poly A (14) 13 15 130 0 129 (sur 130) 15 99,23 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon 96 Chromosome 9 Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 114 Région homologue sur un chromosome différent 13 15 114 0 114 0 100 6 % d’appels corrects7 SNV 97 9 122 - 13 15 122 0 122 0 100 98 9 127 Poly A (5), 13 15 127 0 127 0 100 Poly C (5) 99 9 133 - 13 15 133 0 133 0 100 100 9 138 64 % en GC 13 15 138 0 138 0 100 101 9 139 - 13 15 139 0 139 0 100 102 9 116 - 13 15 116 0 116 0 100 103 9 133 Poly A (5), 13 15 133 0 133 0 100 57 % en GC 104 9 138 57 % en GC 13 15 138 0 138 0 100 105 9 136 Poly C (5), 13 15 136 0 136 0 100 67 % en GC 106 9 118 70 % en GC 13 15 118 0 118 0 100 107 10 128 62 % en GC 13 15 128 0 128 0 100 108 10 120 60 % en GC 13 15 120 0 120 0 100 109 10 139 58 % en GC; 13 15 139 0 139 0 100 13 15 118 0 118 0 100 SNV 110 15 10 118 | Référence 15050260, rév. B FRA 57 % en GC Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 111 10 123 Poly T (5) 13 15 123 0 123 0 100 112 10 121 - 13 15 121 0 121 0 100 113 10 129 26 % en GC 13 15 129 0 129 0 100 114 10 122 - 13 15 122 0 122 0 100 115 10 124 Poly T (5); 13 15 124 0 124 0 100 Région homologue sur un chromosome différent 116 10 135 CA (4) 13 15 135 0 135 0 100 117 10 135 Poly A (6); 13 15 135 0 135 0 100 13 15 119 0 119 0 100 Région homologue sur un chromosome différent 118 10 119 Poly C (5); SNV 16 119 10 125 - 13 15 125 0 125 0 100 120 10 131 - 13 15 131 0 131 0 100 121 10 117 - 13 15 117 0 117 0 100 122 10 116 - 13 15 116 0 116 0 100 123 10 129 58 % en GC 13 15 129 0 129 0 100 124 11 117 Poly T (10) 13 15 117 0 117 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 125 11 117 Poly T (5) 13 15 117 0 117 0 100 126 11 113 Poly A (5) 13 15 113 0 113 0 100 127 11 129 - 13 15 129 0 129 0 100 128 11 121 Poly T (5) 13 15 121 0 121 0 100 129 11 123 - 13 15 123 0 123 0 100 130 11 127 Poly A (6) 13 15 127 0 127 0 100 131 11 136 Poly T (6) 13 15 136 0 136 0 100 132 11 132 Poly T (5) 13 15 132 0 132 0 100 133 11 115 - 13 15 115 0 115 0 100 134 11 117 Poly T (8); 13 15 117 0 117 0 100 13 15 134 0 134 0 100 19 % en GC 135 11 134 Poly A (5); Poly T (5) 136 11 131 Poly A (5) 13 15 131 0 131 0 100 137 11 133 26 % en GC; 13 15 133 0 133 0 100 13 15 137 0 137 0 100 SNV 138 11 137 Poly T (8); SNV 17 139 11 131 Poly A (5) 13 15 131 0 131 0 100 140 12 131 - 13 15 131 0 131 0 100 141 12 128 - 13 15 128 0 128 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 142 12 133 Poly A (5) 13 15 133 0 133 0 100 143 12 136 - 13 15 136 0 136 0 100 144 12 124 - 13 15 124 0 124 0 100 145 12 122 59 % en GC 13 15 122 0 122 0 100 146 13 122 - 13 15 122 0 122 0 100 147 13 116 Poly C (5) 13 15 116 0 116 0 100 148 13 133 - 13 15 133 0 133 0 100 149 13 117 SNV 13 15 117 0 117 0 100 150 13 124 Poly T (6) 13 15 124 0 124 0 100 151 13 123 Poly T (5); 13 15 123 0 123 0 100 26 % en GC 18 152 13 115 Poly A (5) 13 15 115 0 115 0 100 153 13 125 - 13 15 125 0 125 0 100 154 13 121 - 13 15 121 0 121 0 100 155 13 123 - 13 15 123 0 123 0 100 156 13 114 - 13 15 114 0 114 0 100 157 13 119 - 13 15 119 0 119 0 100 158 14 122 58 % en GC 13 15 122 0 122 0 100 159 16 122 - 13 15 122 0 122 0 100 160 16 121 - 13 15 121 0 121 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 161 16 123 Poly C (5) 13 15 123 0 123 0 100 162 17 119 - 13 15 119 0 119 0 100 163 17 119 61 % en GC 13 15 119 0 119 0 100 164 17 135 - 13 15 135 0 135 0 100 165 17 116 Poly C (6); 13 15 116 0 116 0 100 60 % en GC; SNV 166 17 123 - 13 15 123 0 123 0 100 167 17 116 62 % en GC 13 15 116 0 116 0 100 168 17 118 Poly C (5); 13 15 118 0 118 0 100 65 % en GC 169 17 129 - 13 15 129 0 129 0 100 170 17 131 Poly G (6); 13 15 131 0 131 0 100 67 % en GC; SNV 19 171 17 127 61 % en GC 13 15 127 0 127 0 100 172 17 118 Poly C (5) 13 15 118 0 118 0 100 173 17 138 61 % en GC 13 15 138 0 138 0 100 174 17 131 58 % en GC 13 15 131 0 131 0 100 175 18 112 - 13 15 112 0 112 0 100 176 18 124 - 13 15 124 0 124 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 177 18 134 Poly A (6) 13 15 134 0 134 0 100 178 18 129 - 13 15 129 0 129 0 100 179 18 133 - 13 15 133 0 133 0 100 180 18 118 - 13 15 118 0 118 0 100 181 18 114 60 % en GC 13 15 114 0 114 0 100 182 18 118 - 13 15 118 0 118 0 100 183 19 122 Poly G (6); 13 15 122 0 122 0 100 66 % en GC 184 19 139 64 % en GC 13 15 139 0 139 0 100 185 19 131 67 % en GC 13 15 131 0 131 0 100 186 19 141 59 % en GC; 13 15 141 0 141 0 100 13 15 121 0 121 0 100 Région homologue sur un chromosome différent 187 19 121 Poly C (5); 72 % en GC; Région homologue sur un chromosome différent 20 188 19 138 58 % en GC 13 15 138 0 138 0 100 189 19 123 64 % en GC 13 15 123 0 123 0 100 190 19 138 - 13 15 138 0 138 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Amplicon Chromosome Taille du fragment analysé 1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’échantillons uniques Nombre total d’échantillons analysés 2 Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués 3 Nombre d’aucunappel 4 Nombre d’appels corrects par échantillon 5 Nombre d’appels incorrects 6 % d’appels corrects7 191 20 117 Poly T (5) 13 15 117 0 117 0 100 192 22 136 Poly A (7) 13 15 136 0 136 0 100 193 22 122 Poly A (5); 13 15 122 0 122 0 100 13 15 122 0 122 0 100 13 15 119 0 119 0 100 Poly C (5) 194 22 122 62 % en GC; SNV 195 22 119 66 % en GC S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible. Le nombre total d’échantillons répertoriés est de 15, car deux des 13 échantillons uniques analysés ont été analysés en deux réplicats indépendants. 3 Le nombre d’appels par échantillon ayant été effectués est le nombre de bases ayant une qualité suffisante pour être définis par le système. 4 Le nombre d’aucun-appels est le nombre de bases dans un amplicon entraînant aucun appel dans l’analyse. 5 Le nombre d’appels corrects par échantillon est le nombre de bases dans l’amplicon qui ont été définies et ayant des résultats correspondant à la séquence de référence du génome humain version 19 et la référence composite bien caractérisée. 6 Le nombre d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects pour le SNV ou l’indel dans cet amplicon; des détails supplémentaires sur les appels incorrects sont présentés dans les notes de bas de page ci-dessous. 7 Le % d’appels corrects correspond au taux d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur les renseignements de référence composite bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence de l’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons contiennent un indel et d’autres non, par exemple, l’amplicon 9. Le % d’appels corrects pour les échantillons avec un résultat incorrect est présenté dans le tableau. 8 L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Toutefois, les renseignements de référence composite bien caractérisée pour sept des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces sept échantillons, cette suppression d’une paire de bases représente un faux négatif dans l’étude de précision de séquençage MiSeqDx. 9 L’amplicon 46 a une insertion de bases qui est rapportée dans neuf échantillons dans la base de données de référence bien caractérisée et est correctement détectée dans tous les échantillons analysés. 10 L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de référence composite bien caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion de paire de bases représente un faux négatif dans l’étude de précision de séquençage MiSeqDx. 1 2 21 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Le tableau suivant contient les données de l’Étude 1 présentées avec la concordance positive et négative en pour cent, où les résultats des variants sont comparés aux renseignements de référence composite bien caractérisée pour le calcul de la concordance positive en pour cent (CPP). Étant donné que les renseignements de référence composite fournissent uniquement des résultats pour les variants mononucléotides et les insertions/suppressions, les résultats des bases sans variants sont comparés à la séquence de référence du génome humain version 19 pour le calcul de la concordance négative en pour cent (CNP). Toutes les bases sans variants avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence de référence. Tous les SNV avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence de référence. Les variants qui ont été manqués étaient des insertions d’une base ou des suppressions d’une base dans les régions d’homopolymères. Tableau 2 Concordance des résultats des définitions des bases de la plateforme MiSeqDx avec les données de référence pour 13 échantillons bien caractérisés Échantillon Nbre d’amplicons % de couverture d’amplicons1 Variants attendus par échantillon 2 Variants Variants correctement manqués3 appelés Bases sans variants appelées correctement CPP 4 (%) CNP 5 (%) NA12877 195 100 19 17 2 24418 89,47 100 NA12878 195 100 19 17 2 24417 89,47 100 NA12879 195 100 20 19 1 24416 95,00 100 NA12880 195 100 20 18 2 24417 90,00 100 NA12881 195 100 22 20 2 24415 90,91 100 NA12882 195 100 16 15 1 24419 93,75 100 NA12883 195 100 24 23 1 24412 95,83 100 NA12884 195 100 21 20 1 24415 95,24 100 NA12885 195 100 19 17 2 24417 89,47 100 NA12886 195 100 22 20 2 24415 90,91 100 NA12887 195 100 19 18 1 24416 94,74 100 NA12888 195 100 24 23 1 24412 95,83 100 NA12893 195 100 20 18 2 24417 90,00 100 Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité. Les variants prévus par échantillon comprennent les SNV et les indels. 3 Pour les variants manqués, veuillez consulter le premier tableau de l’étude 1 et les notes de bas de page 8 à 10. 4 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 × TP/(TP + FN), où les vrais positifs (TP) sont le nombre d’appels de variants positifs aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence et l’allèle mutant appelé est concordant avec la séquence de référence (colonne nommée « Variants appelés correctement ») et les faux négatifs (FN) sont le nombre d’appels de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence (colonne nommée « Variants manqués »). 5 Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 × TN/(FP + TN) où les faux positifs (FP) sont le nombre d’appels de variants positifs aux coordonnées génomiques où sont absents les variants selon la séquence de référence, ou si l’allèle mutant appelé est discordant avec la séquence de référence (non référencé dans le tableau; aucun appel de variants faux positifs n’a été effectué dans cette étude) et les vrais négatifs (TN) sont le nombre d’appels de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont absents les variants selon la séquence de référence (colonne nommée « Bases sans variants appelées correctement »). 1 2 Étude 2 Les résultats de séquençage pour le panel d’amplicons ci-dessus ont été comparés à un génotype d’une grande fiabilité établi pour NA12878 par le National Institutes of Standards and Technology (NIST, Institut national des normes et de la Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA | 22 Instrument MiSeqDx technologie) (v.2.151). Sur les 195 amplicons, 184 amplicons étaient compris dans les appels de référence d’une grande fiabilité dans la séquence du NIST et ont été comparés. Les définitions des bases sans variants ont été comparées à la séquence du génome humain de référence version 19. Tableau 3 Comparaison des résultats de séquençage de la plateforme MiSeqDx pour l’échantillon NA12878 avec la base de données du NIST Échantillon Nbre d’amplicons % de couverture d’amplicons2 Variants attendus Variants correctement appelés Variants manqués Bases sans variants appelées correctement CPP 3 (%) CNP 4 (%) NA12878 184 100 17 16 15 23066 94,12 100 Zook, JM et coll. Integrating sequencing datasets to form highly confident SNP and indel genotype calls for a whole human genome. arXiv:1307.4661 [q-bio.GN]. 2 Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité. 3 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 × TP/(TP + FN). 4 Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 × TN/(FP + TN). 5 Le variant manqué est la suppression d’une paire de bases dans l’amplicon 9 d’une analyse homopolymère de 14 A non appelés par le système MiSeqDx présente dans la séquence NIST. Notez que la séquence NIST n’inclut pas l’insertion d’une paire de bases dans l’autre homopolymère de A qui était présent dans l’autre base de données de référence utilisée ci-dessus dans l’étude 1. 1 Étude 3 Une étude de précision supplémentaire a été réalisée pour évaluer les performances des petites insertions et délétions dans le cadre d’un test représentatif, le test de fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx d’Illumina, qui comprenait un sous-ensemble de variations génétiques CFTR significatives sur le plan clinique et analysées avec le logiciel MiSeq Reporter en utilisant le flux de travail ciblé de séquençage de l’ADN associé à la plateforme MiSeqDx. Les insertions et délétions demandées ont été détectées à l’emplacement prévu avec une fiabilité élevée. Ces échantillons ont été caractérisés grâce au séquençage bidirectionnel Sanger utilisé comme méthode de référence pour établir la séquence prévue. Tableau 4 Résumé de la détection des indels à l’aide de la plateforme MiSeqDx 23 Nbre d’appels par échantillon ayant été effectués Nbre de bases appelées par échantillon Nbre d’aucunappel Nbre d’appels corrects par échantillon Nbre d’appels incorrects % d’appels corrects Insertion d’une base 130 130 0 130 0 100 154 Délétion de trois bases 151 151 0 151 0 100 3 167 Délétion de deux bases 165 165 0 165 0 100 4 134 Délétion d’une base 133 133 0 133 0 100 5 132 Délétion d’une base 131 131 0 131 0 100 6 129 Délétion d’une base 128 128 0 128 0 100 Amplicon Taille des inserts Contenu génomique de l’amplicon 1 129 2 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Les données qui ressortent de ces études de précision confirment que la plateforme MiSeqDx peut séquencer avec précision les éléments suivants. • Teneur en GC ≥ 19 % (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés ayant un taux de 19 % de teneur en GC appelé correctement) • Teneur en GC ≤ 72 % (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés ayant un taux de 72 % de teneur en GC appelé correctement) • Longueurs de PolyA ≤ 7 (la répétition PolyA de sept nucléotides a été appelée correctement dans 270 des 270 amplicons séquencés contenant PolyA = 7) • Longueurs de PolyT ≤ 8 (la répétition PolyT de huit nucléotides a été appelée correctement dans 270 des 270 amplicons séquencés contenant PolyT = 8) • Longueurs de PolyG ≤ 6 (la répétition PolyG de six nucléotides a été appelée correctement dans 405 des 405 amplicons séquencés contenant PolyG = 6) • Longueurs de PolyC ≤ 7 (la répétition PolyC de sept nucléotides a été appelée correctement dans 135 des 135 amplicons séquencés contenant PolyC = 7) • Longueurs de répétition de dinucléotides ≤ 5 × (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés avec une répétition de dinucléotides de 5 × ont été appelées correctement) • Longueurs de répétition de trinucléotides ≤ 4 × (toutes les bases dans 810 des 810 amplicons séquencés avec une répétition de trinucléotides de 4 × ont été appelées correctement) • Insertions d’une base et suppression de trois bases ou moins — Deux des trois insertions d’une base testées ont été appelées correctement. Des appels corrects ont été effectués pour deux insertions d’une base dans des régions non homopolymères dans 82 amplicons. Une insertion d’une base n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur le chromosome 2 dans 135 amplicons. — Trois des quatre suppressions d’une base ont été appelées correctement. Tous les appels corrects ont été effectués dans des régions non homopolymères dans quatre amplicons. Une suppression d’une base n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur le chromosome 9 dans 63 amplicons. — La suppression de deux bases a été appelée correctement dans un échantillon. — Les suppressions de trois bases ont été appelées correctement dans 21 échantillons. Reproductibilité La reproductibilité de la plateforme MiSeqDx a été déterminée à l’aide de deux tests représentatifs. Étude 1 Un test représentatif a été conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et contenant des exons potentiellement pertinents sur le plan clinique. L’étude a permis d’examiner 13 échantillons au cours de neuf analyses à l’aide de trois instruments MiSeqDx différents avec le concours de trois opérateurs distincts (Tableau 5). Un lot unique de réactifs de préparation de la librairie et deux lots de consommables pour le séquençage ont été utilisés. Les 13 échantillons provenaient de deux parents et 11 enfants qui avaient été fréquemment séquencés par plusieurs laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Deux échantillons ont été analysés en double exemplaire, donc chaque analyse a généré des résultats pour 15 échantillons. Pour l’évaluation de la reproductibilité d’un lot à l’autre, 94 échantillons et deux contrôles sans modèle ont été testés dans l’ensemble des trois lots. Chaque lot a été scindé en deux analyses de 48 échantillons pour tester tous les réactifs et les combinaisons de primers d’index possibles. Toutes les analyses de séquençage ont été réalisées par un seul opérateur sur un seul instrument MiSeqDx pour éviter toute variation éventuelle due à l’opérateur ou à l’instrument (Tableau 6). Des appels corrects ont été déterminés pour les variants mononucléotides (SNV) en comparant les données de l’étude à des renseignements de référence bien caractérisée. Il n’y a eu aucun échec d’analyse ou répétition d’analyse pour l’étude de reproductibilité. Les tableaux suivants contiennent les résultats des études destinées à évaluer la reproductibilité du système. Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA | 24 Instrument MiSeqDx Tableau 5 Résultats de la reproductibilité d’instrument-à-instrument de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx (au niveau de l’amplicon) MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 1 1 132 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 Poly C (5); MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 236 0 99,617 396 0 99,347 63 % en GC 2 1 128 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 3 2 133 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 4 2 119 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 5 2 127 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 6 2 135 Poly A (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 7 2 122 Poly T (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly C (5) 8 2 110 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 9 2 131 Poly A (14) 135 0 278 99,54 0 278 99,54 0 278 99,54 10 2 117 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 11 2 121 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 12 2 114 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 13 2 129 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 14 3 131 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly T (5) 15 25 3 130 - | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 16 3 130 - 17 3 117 18 3 136 19 3 131 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly T (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly A (6); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 SNV 20 3 123 21 3 117 Poly T (5); Région homologue sur un chromosome différent 22 3 119 Région homologue sur un chromosome différent 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 23 3 120 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 24 3 129 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 25 4 133 Poly C (7); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 66 % en GC 26 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 26 4 135 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 Poly C (5); MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 69 % en GC 27 4 123 SNV 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 28 4 134 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 29 4 132 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 30 4 121 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 SNV 31 4 125 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 32 4 134 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 33 4 118 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 34 4 122 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 35 4 131 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 36 4 133 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 37 4 128 Poly T (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 38 4 131 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 39 4 129 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly T (5); SNV 40 4 133 Poly T (5); SNV 27 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 28 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 41 4 112 SNV 42 4 133 43 4 44 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 4 122 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 45 4 117 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 46 4 124 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 47 4 117 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 48 4 128 Poly A (7) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 49 4 123 Poly A (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 50 4 133 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 51 4 112 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 52 4 129 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 53 4 126 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 54 4 132 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 55 5 131 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 56 5 119 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 57 5 120 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 58 5 119 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 59 5 118 - 60 5 112 61 5 62 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 120 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 5 120 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 63 5 115 CT(5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 64 5 112 SNV 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 65 5 135 Poly T (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 66 5 131 63 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 67 5 121 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 68 5 132 Poly A (6); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly T (8) 69 7 133 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 70 7 120 60 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 71 7 135 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 72 7 126 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 59 % en GC 73 7 134 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 74 7 122 Poly C (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 63 % en GC 29 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 75 7 127 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 59 % en GC; MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 SNV 76 7 123 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 77 7 125 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 78 7 133 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly T (5) 79 7 116 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 80 7 135 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 81 7 118 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 82 7 136 67 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 83 7 131 58 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 84 7 119 Poly G (6); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 61 % en GC 30 85 7 122 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 86 7 123 Poly A (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 87 8 127 60 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 88 8 129 57 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 89 9 130 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 90 9 116 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon 91 9 119 Région homologue sur un chromosome différent 92 9 121 93 9 94 Nombre d’analyses d’échantillons2 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 117 Région homologue sur un chromosome différent 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 9 114 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 95 9 129 Poly A (14) 135 0 459 99,22 0 459 99,22 0 459 99,22 96 9 114 Région homologue sur un chromosome différent; 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 SNV 97 9 122 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 98 9 127 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly C (5) 31 99 9 133 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 100 9 138 64 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 101 9 139 - 102 9 116 103 9 133 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 57 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly C (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 57 % en GC 104 9 138 105 9 136 67 % en GC 106 9 118 70 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 107 10 128 62 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 108 10 120 60 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 109 10 139 58 % en GC; 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 SNV 32 110 10 118 57 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 111 10 123 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 112 10 121 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 113 10 129 26 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 114 10 122 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 115 10 124 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 Poly T (5); MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 CA (4) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly A (6); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Région homologue sur un chromosome différent 116 10 135 117 10 135 Région homologue sur un chromosome différent 118 10 119 Poly C (5); SNV 33 119 10 125 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 120 10 131 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 121 10 117 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 122 10 116 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 123 10 129 58 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 124 11 117 Poly T (10) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 125 11 117 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 126 11 113 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 127 11 129 - 128 11 121 129 11 130 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 123 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 11 127 Poly A (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 131 11 136 Poly T (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 132 11 132 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 133 11 115 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 134 11 117 Poly T (8); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 SNV; 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 19 % en GC 135 11 134 Poly A (5); Poly T (5) 136 11 131 137 11 133 26 % en GC 138 11 137 Poly T (8); SNV 34 139 11 131 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 140 12 131 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 141 12 128 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 142 12 133 Poly A (5) 143 12 136 144 12 145 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 124 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 12 122 59 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 146 13 122 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 147 13 116 Poly C (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 148 13 133 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 149 13 117 SNV 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 150 13 124 Poly T (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 151 13 123 Poly T (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 26 % en GC 35 152 13 115 Poly A (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 153 13 125 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 154 13 121 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 155 13 123 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 156 13 114 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 157 13 119 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 158 14 122 58 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 159 16 122 - 160 16 121 161 16 162 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 123 Poly C (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 17 119 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 163 17 119 61 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 164 17 135 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 165 17 116 Poly C (6); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 60 % en GC; SNV 166 17 123 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 167 17 116 62 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 168 17 118 Poly C (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 65 % en GC 169 17 129 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 170 17 131 Poly G (6); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 67 % en GC; SNV 36 171 17 127 61 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 172 17 118 Poly C (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 173 17 138 61 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 174 17 131 58 % en GC 175 18 112 176 18 177 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 124 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 18 134 Poly A (6) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 178 18 129 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 179 18 133 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 180 18 118 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 181 18 114 60 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 182 18 118 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 183 19 122 Poly G (6); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 66 % en GC 184 19 139 64 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 185 19 131 67 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 186 19 141 59 % en GC; 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Région homologue sur un chromosome différent 37 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx MiSeqDx 1 Amplicon Chr. Taille du fragment analysé1 187 19 121 Contenu génomique de l’amplicon Nombre d’analyses d’échantillons2 Poly C (5); MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 Nombre total d’aucunappels3 Nombre total d’appels incorrects4 % d’appels corrects5 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 72 % en GC; Région homologue sur un chromosome différent 188 19 138 58 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 189 19 123 64 % en GC 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 190 19 138 - 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 191 20 117 Poly T (5) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 192 22 136 Poly A (7) 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 193 22 122 Poly A (5); 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 135 0 0 100 0 0 100 0 0 100 Poly C (5) 194 22 122 62 % en GC; SNV 195 22 119 66 % en GC S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible. Le nombre d’échantillons est calculé à partir de neuf analyses de 15 échantillons (11 échantillons analysés une fois et deux échantillons analysés deux fois). 3 Le nombre total d’aucun-appels est le nombre total d’aucun-appels obtenu pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx spécifié. 4 Le nombre total d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects obtenus pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx spécifié. 5 Le % d’appels corrects correspond au débit d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur la base de données de référence bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence d’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons doivent avoir un indel et d’autres non, par exemple, l’amplicon 9. 1 2 38 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx L’amplicon 1 possédait un certain nombre de bases dont le génotype ne pouvait pas être appelé : 12 bases dans une analyse sur neuf dans NA12881; une base dans deux analyses sur neuf et trois bases dans une analyse sur neuf dans NA12886; 20 bases dans une analyse sur neuf et 26 bases dans une analyse sur neuf dans NA12888. Cela est dû à la faible couverture dans les bases sans aucun appel dans ces analyses, où la profondeur moyenne de séquençage était de 33,2, avec un minimum de 21 et un maximum de 52. 7 Lorsque le nombre d’aucun-appels n’est pas inclus dans le calcul, le taux d’appels corrects est de 100 %. 8 L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les renseignements de référence bien caractérisée pour sept des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces sept échantillons, cette suppression d’une paire de bases s’appelle un faux négatif et est appelée comme faux négatif de façon reproductible dans les neuf analyses. 9 L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de renseignements de référence bien caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion d’une paire de bases n’est pas appelée de façon reproductible à 100 % (c.-à-d. qu’il s’agit d’un faux négatif). 6 39 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Les résultats de l’étude 1 de reproductibilité pour chaque échantillon sont présentés pour l’ensemble des neuf analyses en une seule colonne. Les résultats affichés portent uniquement sur les variants à simple nucléotide et les résultats des insertions/délétions par rapport à la séquence de la base de données de référence pour les trois analyses réalisées sur trois instruments. Cette analyse a montré que les résultats des variants étaient reproductibles dans neuf analyses pour ces échantillons. Tableau 6 Résumé des résultats de reproductibilité de la plateforme MiSeqDx pour 13 échantillons bien caractérisés Variants mononucléotides (SNV) Nº d’ADN Identifiant de l’échantillon d’ADN Nombre d’analyses par échantillon Nombre de SNV 1 NA128773 18 2 NA128783 3 Insertions/délétions (indels) Nombre de bases appelées correctement Nombre de faux positifs1 Nombre de faux négatifs2 16 16 0 0 18 17 17 0 NA12879 9 18 18 4 NA12880 9 17 5 NA12881 9 6 NA12882 7 Nombre d’indels Nombre de bases appelées correctement Nombre de faux positifs1 Nombre de faux négatifs2 3 1 0 2 0 2 0 0 2 0 0 2 1 0 1 17 0 0 3 1 0 2 19 19 0 0 3 1 0 2 9 15 15 0 0 1 0 0 1 NA12883 9 22 22 0 0 2 1 0 1 8 NA12884 9 19 19 0 0 2 1 0 1 9 NA12885 9 17 17 0 0 2 0 0 2 10 NA12886 9 19 19 0 0 3 1 0 2 11 NA12887 9 18 18 0 0 1 0 0 1 12 NA12888 9 22 22 0 0 2 1 0 1 13 NA12893 9 17 17 0 0 3 1 0 2 Faux positif = variant appelé par l’analyse de séquençage MiSeqDx, mais ne figurant pas dans la base de données de référence. Faux négatif = variant figurant dans la base de données de référence, mais non appelé au cours de l’analyse de séquençage MiSeqDx. 3 Les échantillons NA12877 et NA12878 ont été analysés deux fois. Les échantillons répliqués ont généré des résultats identiques. 1 2 40 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Étude 2 Une étude de reproductibilité de site à site a été effectuée avec un test représentatif, le test de la fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx d’Illumina, incluant un sous-ensemble de variations du gène CFTR pertinentes d’un point de vue clinique analysées avec le logiciel MiSeq Reporter à l’aide de la plateforme de flux de travail de séquençage d’ADN ciblé MiSeqDx. L’étude en aveugle a été réalisée sur trois sites d’essais et a nécessité deux opérateurs sur chaque site. Deux panels bien caractérisés de 46 échantillons chacun ont été analysés par chacun des opérateurs sur chaque site pour un total de 810 appels par site. Les panels contenaient un mélange d’ADN génomique issu des lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR, ainsi que du sang déleucocyté enrichi de lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR. Les échantillons de sang ont été fournis pour permettre l’incorporation des étapes d’extraction utilisées dans la préparation d’ADNg qui sert d’entrée primaire pour le flux de travail du test. Le débit de passage des échantillons, défini comme le nombre d’échantillons passant les indicateurs de contrôle qualité lors de la première tentative, était de 99,88 %. Tous les résultats des tests sont basés sur un test initial. Tableau 7 Résumé des résultats de l’étude de reproductibilité réalisée avec un test représentatif de la fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx. Panel Nº d’échantillon Génotype de l’échantillon Variants Nombre Appels concordants total positifs (variants) d’appels par site 41 Appels concordants négatifs (de type Nbre Nbre sauvage) d’appels d’aucun- incorrects appels Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Concordance Concordance Concordance positive (%) négative (%) globale (%) A 1 S549N (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 2 1812-1 G>A (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 3 Q493X/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 41 F508del/2184delA (HET) 810 12 12 12 797 798 798 0 11 100 100 100 A 52 Y122X/R1158X (HET) 810 12 10 12 798 665 798 0 1352 94,44 94,44 94,44 A 6 F508del/2183AA>G (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 7 R75X (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 8 I507del/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 93 F508del/W1282X (HET) 810 12 11 12 798 797 798 23 0 97,22 99,96 99,92 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Panel Nº d’échantillon Génotype de l’échantillon Variants Nombre Appels concordants total positifs (variants) d’appels par site 42 Appels concordants négatifs (de type Nbre Nbre sauvage) d’appels d’aucun- incorrects appels Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Concordance Concordance Concordance positive (%) négative (%) globale (%) A 103 F508del/3272-26A>G (HET) 810 12 11 12 798 797 798 23 0 97,22 99,96 99,92 A 11 F508del/3849+10kbC>T (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 12 621+1G>T/3120+1G>A (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 13 E60X/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 14 M1101K (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 15 M1101K (HOM) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 16 F508del (HOM) 828 6 6 6 822 822 822 0 0 100 100 100 A 17 F508del/3659delC (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 18 R117H/F508del (HET) 816 18 18 18 798 798 798 0 0 100 100 100 A 19 621+1G>T/711+1G>T (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 20 G85E/621+1G>T (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 21 A455E/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 | Référence 15050260, rév. B FRA I506V, I507V, F508C absents (TG)10 (T)9/ (TG)12 (T)5 Février 2015 Instrument MiSeqDx Panel Nº d’échantillon Génotype de l’échantillon Variants Nombre Appels concordants total positifs (variants) d’appels par site 43 Appels concordants négatifs (de type Nbre Nbre sauvage) d’appels d’aucun- incorrects appels Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Concordance Concordance Concordance positive (%) négative (%) globale (%) A 22 F508del/R560T (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 23 F508del/Y1092X (C>A) (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 24 N1303K (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 25 G542X (HOM) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 26 G542X (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 27 G551D/R553X (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 28 3849+10kbC>T (HOM) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 29 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 A 30 F508del (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 31 1717-1G>A (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 32 R1162X (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 33 R347P/G551D (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 34 R334W (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 35 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 A 36 G85E (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 37 I336K (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 38 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Panel Nº d’échantillon Génotype de l’échantillon Variants Nombre Appels concordants total positifs (variants) d’appels par site 44 Appels concordants négatifs (de type Nbre Nbre sauvage) d’appels d’aucun- incorrects appels Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Concordance Concordance Concordance positive (%) négative (%) globale (%) A 39 F508del/3849+10kbC>T (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 40 621+1G>T/3120+1G>A (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 41 F508del/3659delC (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 42 R117H/F508del (HET) 816 18 18 18 798 798 798 0 0 100 100 100 A 43 G85E/621+1G>T (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 44 A455E/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 45 N1303K (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 46 G551D/R553X (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 47 2789+5G>A (HOM) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 48 CFTR dele2, 3/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 49 F508del/1898+1G>A (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 50 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 51 F508del/2143delT (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 | Référence 15050260, rév. B FRA (TG)10 (T)9/ (TG)12 (T)5 Février 2015 Instrument MiSeqDx Panel Nº d’échantillon Génotype de l’échantillon Variants Nombre Appels concordants total positifs (variants) d’appels par site 45 Appels concordants négatifs (de type Nbre Nbre sauvage) d’appels d’aucun- incorrects appels Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Concordance Concordance Concordance positive (%) négative (%) globale (%) B 52 3876delA (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 53 3905insT (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 54 394delTT (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 55 F508del (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 56 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 57 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 58 F508del (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 59 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 60 L206W (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 61 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 62 G330X (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 63 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 64 R347H (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 65 1078delT (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 66 G178R/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 67 S549R (c.1647T>G) (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 68 S549N (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Panel Nº d’échantillon Génotype de l’échantillon Variants Nombre Appels concordants total positifs (variants) d’appels par site 46 Appels concordants négatifs (de type Nbre Nbre sauvage) d’appels d’aucun- incorrects appels Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Concordance Concordance Concordance positive (%) négative (%) globale (%) B 69 W846X (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 70 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 71 E92X/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 724 621+1G>T/1154insTC (HET) 810 12 12 12 798 798 797 0 14 100 99,96 99,96 B 73 G542X (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 74 F508del (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 752 F508del (HET) 810 6 5 6 804 670 804 0 1352 94,44 94,44 94,44 B 76 F508del (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 77 621+1G>T/A455E (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 78 1812-1 G>A (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 79 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 80 F508del/R553X (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 81 F508del/G551D (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 82 R347P/F508del (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 83 R117H/F508del (HET) 816 18 18 18 798 798 798 0 0 100 100 100 | Référence 15050260, rév. B FRA (TG)10 (T)9/ (TG)12 (T)5 Février 2015 Instrument MiSeqDx Panel Nº d’échantillon Génotype de l’échantillon Variants Nombre Appels concordants total positifs (variants) d’appels par site Appels concordants négatifs (de type Nbre Nbre sauvage) d’appels d’aucun- incorrects appels Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Concordance Concordance Concordance positive (%) négative (%) globale (%) B 84 I507del (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 85 2789+5G>A (HOM) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 864 CFTR dele2, 3/F508del (HET) 810 12 12 12 798 797 798 0 14 100 99,96 99,96 B 87 F508del/1898+1G>A (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 88 TS 810 0 0 0 810 810 810 0 0 S.O. 100 100 B 89 F508del/2143delT (HET) 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 B 90 3905insT (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 91 394delTT (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 B 92 F508del (HET) 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 74 556 2 209 4 273 99,77 99,88 99,88 Total 221 182 L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant N1303K pour un réplicat, n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante. Un réplicat des échantillons 5 et 75 avait un débit d’appel de 0 %. Le complément d’enquête indique que des échantillons peuvent ne pas avoir été ajoutés à la plaque d’échantillons avant la préparation de la librairie, car les volumes d’échantillon restants dans les tubes ne correspondaient à aucun volume ayant été supprimé. 3 Des preuves indiquent que les échantillons 9 et 10 ont été vraisemblablement échangés par l’opérateur avant la préparation de la librairie. 4 L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant M1V pour un réplicat de chacun des deux échantillons n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante. 1 2 47 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Extraction d’ADN Trois différentes méthodes d’extraction, à savoir l’extraction à base de billes magnétiques, la précipitation dans l’alcool et la filtration sur colonne de silice, ont été évaluées à l’aide de sang total K2EDTA anticoagulé. Quatorze échantillons de sang unique ont été utilisés dans l’étude, représentant une plage de génotypes d’un seul gène représentatif. Les trois méthodes d’extraction de l’ADN ont été testées indépendamment par deux opérateurs différents qui ont chacun effectué trois analyses par la méthode d’extraction. Chaque extraction a été réalisée par chaque opérateur à des jours différents. La concentration d’ADN et le rapport A260/A280 des échantillons d’ADNg extrait ont été déterminés par spectrophotométrie. La taille totale des échantillons pour chaque méthode d’extraction dans cette étude était de 168 (14 échantillons × 2 opérateurs/méthode d’extraction × 3 analyses/opérateur × 2 réplicats/échantillon d’ADNg extrait). Méthode d’extraction Nombre d’échantillons testés Débit d’appel Précision 1 Débit au premier passage de l’échantillon 2 Précipitation dans l’alcool 168 100 % 100 % 100 % Filtration sur colonne de silice 168 100 % 100 % 100 % Extraction à base de billes magnétiques 168 100 % 100 % 100 % Précision : la concordance en pour cent avec une méthode d’essai de référence (séquençage bidirectionnel de Sanger) calculée pour les positions de base qui reçoivent une définition des bases. 2 Débit au premier passage de l’échantillon : le nombre d’échantillons respectant le débit d’appel spécifié la première fois qu’ils sont traités (c’est-à-dire, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une nouvelle analyse ou un traitement supplémentaire) en pourcentage du nombre total d’analyses d’échantillons au cours d’une seule expérience de séquençage MiSeqDx. 1 Entrée d’ADN La plage d’entrée d’ADN pour la plateforme MiSeqDx a été évaluée en effectuant une étude de dilution en série à l’aide de 14 échantillons d’ADN représentatifs contenant 16 variants du gène unique. Chaque échantillon a été testé en double exemplaire sur neuf niveaux d’entrée d’ADN allant de 1 250 ng à 1 ng (1 250 ng, 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng et 1 ng). Pour la détermination de la précision, des génotypes de l’échantillon ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel par la méthode de Sanger. Les limites supérieure et inférieure identifiées pour une entrée d’ADN sont respectivement de 1 250 ng et 25 ng, car elles présentaient un débit au premier passage ≥ 95 % sans aucun appel incorrect (précision et débit d’appel de 100 %). Les entrées d’ADN de 1 250 ng, 250 ng et 100 ng ont fait l’objet d’autres tests avec quatre échantillons d’ADN représentatifs et 20 réplicats par niveau d’entrée d’ADN pour chaque échantillon (n = 4 × 20 = 80 échantillons), tandis que la limite inférieure de 25 ng a été testée avec 14 échantillons, 20 réplicats pour chaque échantillon (n = 14 × 20 = 280 échantillons). Le débit au premier passage de l’échantillon et le taux de précision était de 100 % à tous les niveaux d’entrée d’ADN et les débits d’appel de l’échantillon étaient > 99 %. Substances interférentes Pour évaluer l’impact des substances interférentes sur la plateforme MiSeqDx, un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases a été évalué en présence et en l’absence d’interférences potentielles. Huit échantillons de sang total représentant huit génotypes uniques ont été utilisés dans l’étude. Quatre substances interférentes endogènes (bilirubine, cholestérol, hémoglobine et triglycérides) ont été testées en les intégrant dans les échantillons de sang total avant l’extraction d’ADN. Pour évaluer l’interférence résultant du prélèvement sanguin (petit volume), de l’EDTA a été intégré dans des échantillons de sang à deux concentrations. Les limites de concentration pour chaque substance sont indiquées dans le tableau ci-dessous. En outre, afin d’évaluer les interférences résultant de la préparation des échantillons, on a ajouté 15 % de tampon de lavage à huit ADN génomiques purifiés. Un débit d’appel de 100 % a été Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA | 48 Instrument MiSeqDx atteint pour tous les échantillons testés en plus des 100 % de reproductibilité dans les typages génotypiques entre les échantillons en présence et en l’absence de substances interférentes. Substance de test Nombre total de réplicats Concentration analysée dans le sang (limite supérieure) Concentration analysée dans le sang (limite inférieure) Débit d’appel Bilirubine 16 684 µmol/l 137 µmol/l 100 % Cholestérol 16 13 mmol/l 2,6 mmol/l 100 % Hémoglobine 16 2 g/l 0,4 g/l 100 % Triglycéride 16 37 mmol/l 7,4 mmol/l 100 % EDTA 16 7 mg/ml 2,8 mg/ml 100 % Indexage de l’échantillon Des primers d’indexage de l’échantillon sont utilisés dans la trousse pour attribuer un code à barres unique à chaque échantillon d’ADN, permettant de grouper plusieurs échantillons en une seule analyse de séquençage. Un total de 96 index d’échantillons a été analysé à l’aide d’un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases grâce à huit échantillons d’ADN unique pour vérifier la capacité du test à faire systématiquement un appel de génotypage pour un échantillon donné à travers des combinaisons différentes de primers d’indexage. Chaque échantillon a été analysé avec 12 combinaisons différentes de primers d’indexage. Quarante-huit (48) combinaisons d’index ont été testées en une seule analyse de séquençage. Les résultats des échantillons ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel de Sanger pour l’ensemble des positions/variants. La reproductibilité et la précision ont été de 100 % pour toutes les combinaisons de primers d’indexage/échantillon. Brevets et marques de commerce Ce document et son contenu sont exclusifs à Illumina, Inc. et ses sociétés affiliées (« Illumina ») et sont exclusivement destinés à l’usage contractuel de son client dans le cadre de l’utilisation du ou des produits décrits dans les présentes et ne peuvent servir à aucune autre fin. Ce document et son contenu ne seront utilisés ou distribués à aucune autre fin et/ou communiqués, divulgués ou reproduits d’aucune façon sans le consentement écrit préalable d’Illumina. Illumina ne cède aucune licence en vertu de son brevet, de sa marque de commerce, de son copyright, ou de ses droits traditionnels ni des droits similaires d’un tiers quelconque par ce document. Les instructions contenues dans ce document doivent être suivies strictement et explicitement par un personnel qualifié et adéquatement formé de façon à assurer l’utilisation correcte et sûre du ou des produits décrits dans les présentes. Le contenu intégral de ce document doit être lu et compris avant d’utiliser ces produits. LE MANQUEMENT À LIRE COMPLÈTEMENT ET À SUIVRE EXPLICITEMENT TOUTES LES INSTRUCTIONS CONTENUES DANS LES PRÉSENTES POURRA CAUSER DES DOMMAGES AUX PRODUITS, DES BLESSURES AUX PERSONNES, UTILISATEURS OU AUTRES, ET DES DOMMAGES AUX AUTRES BIENS. ILLUMINA REJETTE TOUTE RESPONSABILITÉ RÉSULTANT DE L’USAGE ABUSIF DU OU DES PRODUITS DÉCRITS DANS LES PRÉSENTES (Y COMPRIS LES PIÈCES DE RECHANGE DE CES PRODUITS OU LE LOGICIEL) OU DE TOUTE UTILISATION DE CE(S) PRODUIT(S) QUI SORT DU CADRE DES LICENCES OU DES PERMISSIONS ÉCRITES EXPRESSES ACCORDÉES PAR ILLUMINA EN RAPPORT À L’ACQUISITION DE CES PRODUITS PAR LE CLIENT. DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT © 2015 Illumina, Inc. Tous droits réservés. Illumina, Genetic Energy, MiSeqDx, Powered by Illumina, la couleur citrouille et la conception de bases en flux sont des marques de commerce d’Illumina, Inc. ou de ses sociétés affiliées aux États-Unis ou dans d’autres pays. Tous les autres noms, logos et marques de commerce appartiennent à leur propriétaire respectif. 49 | Référence 15050260, rév. B FRA Février 2015 Instrument MiSeqDx Coordonnées Illumina 5200 Illumina Way San Diego, Californie 92122 États-Unis +(1) 800 809 ILMN (4566) +(1) 858 202 4566 (en dehors de l’Amérique du Nord) [email protected] www.illumina.com Emergo Europe Molenstraat 15 2513 BH La Haye Pays-Bas Étiquette du produit Reportez-vous à la légende des symboles livrée avec chaque trousse pour une référence complète aux symboles qui peuvent apparaître sur l’emballage et l’étiquetage du produit. Février 2015 Référence 15050260, rév. B FRA | 50 ">
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