illumina MiSeqDx MD Manuel utilisateur

Instrument MiSeqDxMD
DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT
Nº de référence DX-410-1001
Utilisation prévue
Le MiSeqDx d’Illumina est un instrument de séquençage qui mesure les signaux de fluorescence des nucléotides
marqués grâce à l’utilisation de Flow Cell et de réactifs spécifiques à l’instrument (Trousse universelle MiSeqDx 1.0), de
matériel d’imagerie et d’un logiciel d’analyse de données. La plateforme MiSeqDx est destinée au séquençage ciblé
d’ADN génomique humain provenant d’échantillons de sang total périphérique. La plateforme MiSeqDx n’est pas
destinée au séquençage de génome entier ou de novo. MiSeqDx est destiné à être utilisé avec des tests de diagnostic in
vitro et des trousses de réactifs fournis par Illumina.
Principes procéduraux
La plateforme MiSeqDx d’Illumina est destinée au reséquençage ciblé d’ADN génomique humain provenant
d’échantillons de sang total périphérique à l’aide des consommables fournis par Illumina. L’ADN génomique est traité à
travers les étapes de préparation de la librairie, qui amplifient spécifiquement les régions génomiques prévues de
chaque échantillon en utilisant les oligonucléotides personnalisés conçus par l’utilisateur, tout en ajoutant les index et
les séquences de capture des Flow Cell aux produits amplifiés. La préparation de la librairie comporte quatre étapes
clés : l’hybridation, l’extension-ligation, l’amplification de PCR et la normalisation de librairie. Les librairies
d’échantillons normalisées qui en résultent sont prêtes pour le séquençage sur l’instrument MiSeqDx d’Illumina à l’aide
de la chimie SBS (séquençage par synthèse). La chimie SBS utilise une méthode basée sur des terminateurs réversibles
pour détecter les bases à simple nucléotide à mesure qu’elles sont intégrées aux brins d’ADN croissants. Le logiciel
d’analyse en temps réel (RTA) exécute les analyses d’images et la définition des bases tout en affectant un score de
qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Lorsque l’analyse primaire prend fin, le logiciel MiSeq
Reporter sur l’instrument MiSeqDx traite les définitions de bases par le biais d’une analyse secondaire qui inclut le
démultiplexage, la génération de fichiers FASTQ, l’alignement, l’appel des variants et la génération de fichiers VCF
contenant des renseignements sur les variants trouvés à des positions spécifiques dans un génome de référence.
Limites de la procédure
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Destiné au diagnostic in vitro.
Ce produit présente les limites suivantes :
— Sortie de séquençage > 1 Go
— Lectures > 3 millions
— Longueur de lecture (en analyse à lecture appariée) 2 × 150 bp
— Bases supérieures à Q30 > 75 % (plus de 75 % des bases ont un score de qualité Phred supérieur à 30,
indiquant une précision de définition des bases supérieure à 99,9 %)
Les variants dans les analyses homopolymères comptant plus de huit bases seront filtrés dans les fichiers VCF
(filtre R8).
Le système a été validé pour la détection des SNV et des délétions de trois bases maximum. L’évaluation des
insertions d’une base a été limitée à trois insertions différentes sur trois chromosomes distincts.
Le système rencontre des problèmes de détection des insertions ou délétions d’une base dans les tronçons
homopolymères (p. ex. le polyA).
Le système MiSeqDx est conçu pour offrir des résultats qualitatifs (c.-à-d. de génotype).
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Comme avec n’importe quel flux de travail à base d’hybridation, les polymorphismes, mutations, insertions ou
délétions sous-jacents dans les régions de liaison d’un oligonucléotide peuvent affecter les allèles sondés et, par
conséquent, les appels faits.
La couverture minimale recommandée par amplicon nécessaire pour un appel de variants précis (Q(max_gt |
poly_site) >= 100) est de 75 ×.
Composants du produit
Le MiSeqDx d’Illumina comprend les composants suivants :
• Instrument MiSeqDx (Nº de référence DX-410-1001)
Les composants logiciels suivants sont nécessaires au fonctionnement et à l’analyse des données sur MiSeqDx :
Application
Fonction
logicielle
MOS :
logiciel
d’exploitation
MiSeqDx
RTA : logiciel
d’analyse en
temps réel
MiSeq
Reporter
Commande le
fonctionnement
de
l’instrument.
Effectue
l’analyse
primaire.
Effectue
l’analyse
secondaire.
Description
L’application logicielle MOS gère le fonctionnement de l’instrument au cours du séquençage et génère des images
utilisées par le logiciel d’analyse en temps réel (RTA).
L’application logicielle RTA convertit les images générées par MOS pour chaque plaque par cycle de l’analyse de
séquençage dans les fichiers de définition des bases qui constituent des entrées pour le logiciel MiSeq Reporter.
L’application logicielle RTA ne contient pas d’interface utilisateur.
Le logiciel MiSeq Reporter traite les définitions de bases par le biais d’une analyse secondaire qui inclut le
démultiplexage, la génération de fichiers FASTQ, l’alignement, l’appel des variants et la génération de fichiers
VCF contenant des renseignements sur les variants trouvés à des positions spécifiques dans un génome de
référence.
Stockage et manipulation
Élément
Caractéristique
Température
Transport et stockage : -10 à 40 °C (14 à 104 °F)
Humidité
Conditions d’utilisation : 19 à 25 °C (66 à 77 °F)
Transport et stockage : humidité sans condensation
Conditions d’utilisation : 30 à 75 % d’humidité relative (sans condensation)
Équipement et matériel nécessaires, non fournis
Consommables pour le séquençage
Trousse universelle MiSeqDx 1.0 (nº de référence DX-103-1001)
Consommables fournis par l’utilisateur
Vérifiez que les consommables fournis par l’utilisateur qui suivent sont disponibles avant de commencer une analyse.
Consommable
Utilisation
Lingettes alcoolisées, isopropyle à 70 %
Nettoyage du portoir de Flow Cell
ou
éthanol à 70 %
Tissu de laboratoire non pelucheux
Papier pour lentilles, 10,1 × 15,2 cm (4 × 6 po).
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Nettoyage de la platine de Flow Cell
Nettoyage de la Flow Cell
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Instrument MiSeqDx
Consommable
Utilisation
Tween 20
Brucelles en plastique à bout carré (facultatif)
Eau sans DNase ni RNase
Nettoyage de l’instrument
Retrait de la Flow Cell de son contenant d’expédition
Nettoyage de l’instrument
Recommandations à propos de l’eau sans DNase ni RNase
Utilisez toujours de lʼeau sans DNase ni RNase pour réaliser des procédures sur l’instrument. Nʼutilisez jamais dʼeau
courante ou dʼeau déionisée. Tous les exemples suivants sont acceptables :
•
•
•
•
Eau 18 mégaohms (MΩ)
Eau Milli-Q
Eau Super-Q
Eau de qualité biologie moléculaire
Avertissements et précautions
ATTENTION
La loi fédérale américaine n’autorise la vente de ce dispositif que sur ordonnance ou par un médecin ou tout autre
professionnel de la santé autorisé par la législation de l’État dans lequel il ou elle exerce à utiliser ou ordonner
l’utilisation de cet appareil.
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Certains composants des réactifs fournis par Illumina à utiliser avec l’instrument MiSeqDx contiennent du
formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. (Consultez les notices
propres aux produits pour plus de renseignements.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par
inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Mettez au rebut les conteneurs et tout
contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de
renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.
Certains composants des trousses de réactifs fournies par Illumina contiennent du 2-mercaptoéthanol, un agent
réducteur. (Consultez les notices propres aux produits pour plus de renseignements.) Des risques de lésions
corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Utilisez
ces composants dans une zone bien aérée et mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé
conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements,
communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.
Manipulez tous les échantillons comme s’ils étaient des agents potentiellement infectieux.
Le non-respect des procédures comme décrites peut entraîner des résultats erronés ou une baisse considérable
de la qualité des échantillons.
Utilisez les précautions de routine en laboratoire. Ne pipettez pas avec la bouche. Il est interdit de manger, de
boire et de fumer dans les zones de travail indiquées. Portez des gants jetables et des blouses de laboratoire lors
de la manipulation des échantillons et des réactifs de la trousse. Lavez-vous les mains soigneusement après
avoir manipulé les échantillons et les réactifs de la trousse.
Les pratiques de laboratoire appropriées et la bonne hygiène du laboratoire sont nécessaires pour empêcher les
produits PCR de contaminer les réactifs, les instruments et les échantillons d’ADN génomique. La
contamination par des produits PCR peut causer des résultats erronés et non fiables.
Pour éviter la contamination, veillez à ce que les zones de préamplification et de post-amplification possèdent
un équipement réservé (p. ex. pipettes, pointes de pipette, agitateur vortex et centrifugeuse).
Une paire index-échantillon doit correspondre exactement à la feuille d’échantillons. Les inadéquations entre la
feuille d’échantillons et le schéma de la plaque entraîneront une perte de l’identification positive des
échantillons et un rapport de résultats incorrect.
Durant l’étape de normalisation de la librairie de la notice du réactif en question, il est extrêmement important
de resuspendre complètement le culot des billes de la librairie. Cette étape est essentielle pour obtenir une
densité consistante des amplifiats sur la Flow Cell MiSeqDx.
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10 Suivez les temps d’incubation indiqués dans les étapes de normalisation de la librairie comme indiqué dans la
notice d’accompagnement du réactif concerné. Une incubation inappropriée peut affecter la représentation de la
librairie et la densité des amplifiats.
11 Il est vivement recommandé d’installer le logiciel antivirus fourni par l’utilisateur afin de protéger l’ordinateur
des virus. Consultez le manuel de l’utilisateur pour obtenir des instructions relatives à l’installation.
12 N’utilisez pas l’instrument MiSeqDx si l’un des panneaux a été retiré. L’utilisation de l’instrument, lorsque
l’un des panneaux a été retiré, crée un risque d’exposition à la tension secteur et à plusieurs tensions continues.
13 Ne touchez pas la platine de Flow Cell dans le compartiment de Flow Cell. Le réchauffeur dans ce
compartiment fonctionne entre 22 et 95 °C et peut causer des brûlures.
14 L’instrument pèse environ 57 kg (126 livres) et peut causer des blessures graves s’il tombe ou s’il est manipulé
sans précaution.
Notes procédurales
Le débit d’échantillons par analyse MiSeqDx peut être compris entre 8 et 48 échantillons. Les primers d’indexage
utilisés pendant l’amplification par PCR doivent être choisis en fonction du débit d’échantillons final souhaité pour
assurer la diversité dans la séquence d’indexage.
REMARQUE
Pour une efficacité maximale du débit, procédez à la préparation de la librairie pour 96 échantillons au plus, puis
répartissez les échantillons en deux analyses de séquençage avec un maximum de 48 échantillons par analyse.
MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour séquencer des bases G/T et un voyant DEL rouge pour séquencer des bases
A/C. À chaque cycle, au moins un des deux nucléotides de chaque canal de couleur doit être lu pour assurer
l’enregistrement approprié. Il est important de maintenir l’équilibrage des couleurs pour chaque base de la lecture
d’index en cours de séquençage, sinon un échec de l’enregistrement pourrait se produire lors du séquençage de la
lecture d’index.
Si le séquençage est inférieur à 48 échantillons dans une analyse de séquençage, sélectionnez les index appropriés sur la
base de leurs séquences pour maintenir l’équilibrage des couleurs dans les canaux verts et rouges. Au minimum, les
analyses comportant 8 à 48 échantillons doivent inclure les combinaisons de primers d’indexage figurant dans la notice
d’accompagnement de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0.
Pour effectuer avec précision des analyses plus petites, au moins huit échantillons doivent être présents. Si
six échantillons uniques (à l’exclusion des contrôles positifs et négatifs) ne sont pas disponibles, il convient d’effectuer
l’analyse avec les réplicats d’échantillon ou n’importe quel échantillon d’ADN génomique humain. Consultez la notice
d’accompagnement de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0 pour connaître l’ensemble minimal d’indices à équilibre
chromatique à utiliser pour les analyses de séquençage de huit échantillons.
Mode d’emploi
Le mode d’emploi suivant de l’instrument MiSeqDx requiert l’utilisation des réactifs fournis dans la trousse Trousse
universelle MiSeqDx 1.0.
Préparation de la feuille d’échantillons MiSeqDx
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Dans l’écran d’accueil de Illumina Worklist Manager, sélectionnez Create Worklist (Créer la liste de travail).
Dans le champ Test Type (Type de test), sélectionnez MiSeqDx universel.
Dans le champ Worklist Name (Nom de la liste de travail), saisissez un nom pour la feuille d’échantillons.
— Si l’identifiant du code à barres de la cartouche de réactifs alphanumérique est utilisé pour le nom de la
feuille d’échantillons, le MiSeq Operating Software (MOS) trouve automatiquement la feuille d’échantillons.
— Si vous utilisez un autre nom pour la feuille d’échantillons, le bouton Browse (Parcourir) situé dans le
MiSeq Operating Software (MOS) peut être utilisé afin de trouver la feuille d’échantillons appropriée.
[Facultatif] Entrez une description pour identifier l’analyse.
Assurez-vous que la date correspond à la date de début de l’analyse.
Sélectionnez Next (Suivant).
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Entrer des renseignements sur l’échantillon
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Dans l’onglet Table (Tableau) ou l’onglet Plate (Plaque), saisissez les renseignements suivants pour chaque
puits contenant un échantillon :
a Identifiant de l’échantillon : saisissez un seul identifiant d’échantillon.
b Index 1 et Index 2 : spécifiez l’adaptateur d’index qui sera utilisé pour chaque lecture d’index.
c Manifest (Manifeste) : précisez le nom du fichier de manifeste qui contient les renseignements sur les
échantillons dans ce puits en particulier.
[Facultatif] Pour enregistrer des renseignements plus détaillés sur les échantillons, saisissez un nom et une
description.
[Facultatif] Pour identifier les contrôles sur la plaque, sélectionnez Negative (Négatif) ou Positive (Positif) dans
le menu déroulant Control (Contrôle).
Accédez à l’onglet Plate Graphic (Graphique de la plaque) et utilisez les options Copy to Clipboard (Copier
vers le bloc-notes) ou Print (Imprimer) pour capturer une image de la plaque d’échantillon.
Sélectionnez Finish (Terminer).
Préparation des échantillons
Suivez les étapes suivantes conformément au mode d’emploi figurant dans la notice d’accompagnement de la trousse
universelle MiSeqDx 1.0 :
•
•
•
•
•
•
•
Hybridation du pool d’oligonucléotides
Retrait des oligonucléotides non liés
Extension-ligation des oligonucléotides liés
Amplification PCR
Nettoyage PCR
Normalisation de librairie
Groupement de librairies
Préparer la cartouche de réactifs
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Décongelez la Cartouche de réactifs MiSeqDx dans un bain d’eau contenant assez d’eau déionisée à
température ambiante pour submerger la base de la cartouche de réactifs jusqu’à la ligne de délimitation de
l’eau imprimée sur la cartouche de réactifs. Le niveau de l’eau ne doit pas dépasser la ligne de délimitation de
l’eau maximale.
Laissez la cartouche de réactifs décongeler dans le bain dʼeau à température ambiante pendant environ
une heure ou jusquʼà décongélation complète.
Retirez la cartouche du bain d’eau et tapotez-la doucement contre la paillasse pour retirer l’eau de la base de la
cartouche. Séchez la base de la cartouche. Assurez-vous que lʼeau n’a pas éclaboussé la partie supérieure de la
cartouche de réactifs.
Inspecter la cartouche de réactifs
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Retournez la cartouche de réactifs 10 fois pour mélanger les réactifs décongelés, puis vérifiez visuellement que
toutes les positions sont décongelées.
REMARQUE
Il est essentiel que les réactifs contenus dans la cartouche soient parfaitement décongelés et mélangés afin de
garantir un séquençage correct.
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Inspectez visuellement les réactifs des positions 1, 2 et 4 pour vérifier quʼils sont complètement mélangés et
quʼils ne contiennent pas de précipités.
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Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair dans les réactifs.
REMARQUE
Les tubes des dispositifs dʼaspiration MiSeqDx descendant au fond de chaque réservoir pour aspirer les réactifs, il
est important quʼaucune bulle dʼair ne reste dans les réservoirs.
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Placez la cartouche de réactifs sur la glace ou réservez-la à une température comprise entre 2 et 8 °C (jusqu’à
6 heures) jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer lʼanalyse. Pour obtenir de meilleurs résultats, chargez
directement l’échantillon et configurez lʼanalyse.
Préparer des échantillons pour le séquençage
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Ramenez le Tampon de dilution de librairie à température ambiante. Mélangez le Tampon de dilution de
librairie et assurez-vous que tous les précipités sont complètement dissous.
Si la plaque SGP a été conservée congelée, décongelez la plaque SGP à température ambiante.
Centrifugez la plaque SGP à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute.
Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube PAL).
Déterminez les échantillons à regrouper pour le séquençage. Un maximum de 48 échantillons peut être
regroupé pour le séquençage.
Si la plaque SGP a été conservée congelée, mélangez chaque librairie à séquencer en pipettant de haut en bas
trois à cinq fois.
Transférez 5 µl de chaque librairie à séquencer de la plaque SGP, colonne par colonne, à une barrette de huit
tubes PCR. Scellez la plaque SGP avec un joint adhésif de plaque et réservez.
REMARQUE
Après utilisation, conservez la plaque SGP scellée à une température de -25 °C à -15 °C. La plaque SGP scellée est
stable pendant un maximum de trois jours.
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Combinez et transférez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL. Mélangez le tube PAL
soigneusement.
Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube DAL).
Ajoutez 585 µl de Tampon de dilution de librairie au tube DAL.
Ajoutez 6 µl de Contrôle interne PhiX de 20 pM au tube DAL. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour
rincer la pointe et assurer un transfert total.
Transférez 9 µl du PAL dans le tube DAL contenant le Tampon de dilution de librairie. Pipettez de haut en bas
trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total.
Mélangez le tube DAL sous agitateur vortex à vitesse maximale.
Centrifugez le tube DAL à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute.
Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant à 96 °C pendant 2 minutes.
Après l’incubation, retournez le tube DAL une à deux fois pour mélanger, puis placez-le immédiatement dans
un bain d’eau glacée.
Gardez le tube DAL dans un bain d’eau glacée pendant 5 minutes.
Charger des librairies d’échantillons sur la cartouche
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Utilisez une pointe de pipette séparée, propre et vide de 1 ml pour percer l’opercule en aluminium scellant le
réservoir sur la cartouche de réactifs étiquetée Load Samples (Charger les échantillons).
Transférez à l’aide de la pipette 600 µl des librairies d’échantillons du DAL dans le réservoir Load Samples
(Charger les échantillons). Prenez soin d’éviter de toucher l’opercule en aluminium lors de la distribution de
l’échantillon.
Vérifiez s’il y a des bulles d’air dans le réservoir après le chargement de l’échantillon. Si des bulles d’air sont
présentes, tapotez légèrement la cartouche sur la paillasse pour les libérer.
Passez directement à la configuration de l’analyse depuis l’interface MiSeq Operating Software (MOS).
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Configuration de l’analyse
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Connectez-vous au MiSeq Operating Software (MOS).
Sélectionnez Sequence (Séquencer).
Une série d’écrans de configuration de l’analyse s’affichent dans l’ordre suivant : Select Run Type (Sélectionner
le type dʼanalyse), Load Flow Cell (Charger la Flow Cell), Load Reagents (Charger les réactifs), Review
(Révision) et Pre-Run Check (Vérification avant analyse).
Sélectionnez Diagnostic Run (Analyse de diagnostic).
Lorsque l’écran Load Flow Cell (Charger la Flow Cell) s’affiche, nettoyez et chargez la Flow Cell.
Fermez le verrou de Flow Cell et la porte du compartiment de Flow Cell.
Le verrou et la porte du compartiment doivent être fermés avant le lancement de l’analyse. Une fois la Flow
Cell chargée, le logiciel lit et enregistre lʼidentification par radiofréquence (RFID). Une confirmation de lecture
RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran.
Lorsque l’écran Load Reagents (Charger les réactifs) s’affiche, videz le flacon à déchets, chargez le flacon de
Solution SBS (PR2) MiSeqDx, puis chargez la cartouche de réactifs.
Lorsque le flacon de MiSeqDx SBS Solution (PR2) et la cartouche de réactifs sont chargés, le logiciel lit et
enregistre le RFID. Une confirmation de lecture RFID correcte sʼaffiche dans le coin inférieur droit de lʼécran.
Sélectionnez la feuille d’échantillons appropriée.
Par défaut, le logiciel recherchera un fichier de feuille dʼéchantillons avec un nom correspondant au code à
barres de la cartouche de réactifs chargée sur lʼinstrument.
Confirmez les paramètres d’analyse et les résultats de la vérification avant analyse.
Démarrez l’analyse.
Lʼécran Sequencing (Séquençage) sʼouvre lorsque lʼanalyse démarre. Cet écran fournit une représentation
visuelle de lʼanalyse en cours, y compris les intensités et les scores de qualité.
Résultats
Le logiciel d’analyse primaire intégré (analyse temps réel ou RTA) exécute les analyses d’images et les définitions de
bases tout en affectant un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Une fois l’analyse
primaire terminée, le logiciel MiSeq Reporter sur l’instrument MiSeqDx lance une analyse secondaire, comme décrit cidessous.
Démultiplexage
Le démultiplexage est la première étape dans l’analyse si la feuille d’échantillons répertorie plusieurs échantillons et
que l’analyse comporte des lectures d’index. Le démultiplexage sépare les données des échantillons groupés en fonction
de séquences d’indexage courtes qui marquent les échantillons provenant de librairies différentes. Chaque séquence de
lecture d’index est comparée aux séquences d’indexage définies dans la feuille d’échantillons. Aucune valeur de qualité
n’est prise en compte lors de cette étape.
Génération de fichier FASTQ
Après le démultiplexage, MiSeq Reporter génère des fichiers intermédiaires au format FASTQ, un format texte utilisé
pour représenter des séquences. Les fichiers FASTQ contiennent les lectures pour chaque échantillon ainsi que les scores
de qualité, à l’exclusion des lectures provenant de tout amplifiat qui n’est pas passé par le filtre. Le score de qualité est
calculé de la façon suivante : -10 log10 P, où P est la probabilité que la définition des bases soit incorrecte.
Alignement
L’alignement compare les séquences par rapport à la référence pour identifier une relation entre les séquences et
attribue un score en fonction des régions de similarité. Les lectures alignées sont écrites dans des fichiers au format
BAM. Pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, MiSeq Reporter utilise un algorithme de Smith-Waterman par bande,
qui effectue des alignements de séquence locaux pour identifier des régions similaires entre deux séquences.
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Instrument MiSeqDx
Appel des variants
Pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, MiSeq Reporter utilise le paramètre d’appel des variants Starling qui appelle
les SNP et les petits indels et résume la profondeur et les probabilités pour chaque site du génome. Starling génère des
rapports au format html sur les SNP et les indels ainsi que des fichiers de texte séparé par des tabulations contenant des
variants au format Variant Call Format (VCF). Pour obtenir des renseignements sur le calcul des résultats à partir des
fichiers VCF, consultez le Guide de l’utilisateur de MiSeq Reporter (nº 15039188).
Caractéristiques de performance
Précision
Trois études distinctes ont été menées pour évaluer la précision de la plateforme MiSeqDx.
Étude 1
Cette étude a utilisé un test représentatif conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes
différents et contenant des exons potentiellement pertinents d’un point de vue clinique. Les 13 échantillons uniques
utilisés dans cette étude proviennent de deux parents et 11 enfants qui ont été fréquemment séquencés par plusieurs
laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Il y a six échantillons de sujets féminins et sept échantillons de
sujets masculins. La précision a été déterminée pour les variants mononucléotides (SNV) en comparant les données de
l’étude à une base de données de référence bien caractérisée. La séquence de la base de données de référence a été
obtenue à partir de la combinaison de plusieurs méthodes de séquençage, de données accessibles au public et de
renseignements sur l’hérédité. Le tableau suivant permettant d’évaluer la précision du système a été établi à partir des
données de la première analyse au cours de l’étude. Le test n’a pas été répété pour cette étude.
Les résultats de cette étude sont présentés ci-dessous.
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Tableau 1 Données de précision de niveau amplicon de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx
Amplicon
1
Chromosome
1
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
132
Poly C (5),
13
15
132
0
132
0
100
6
%
d’appels
corrects7
63 % en GC
2
1
128
Poly T (5)
13
15
128
0
128
0
100
3
2
133
-
13
15
133
0
133
0
100
4
2
119
-
13
15
119
0
119
0
100
5
2
127
Poly T (5)
13
15
127
0
127
0
100
6
2
135
Poly A (6)
13
15
135
0
135
0
100
7
2
122
Poly T (5),
13
15
122
0
122
0
100
Poly C (5)
8
2
110
Poly T (5)
13
15
110
0
110
0
100
98
2
131
Poly A (14)
13
15
130-131
0
130-131
9
99,54
10
2
117
-
13
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117
0
117
0
100
11
2
121
-
13
15
121
0
121
0
100
12
2
114
-
13
15
114
0
114
0
100
13
2
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Poly A (5)
13
15
129
0
129
0
100
14
3
131
Poly A (5),
13
15
131
0
131
0
100
Poly T (5)
9
15
3
130
-
13
15
130
0
130
0
100
16
3
130
-
13
15
130
0
130
0
100
17
3
117
-
13
15
117
0
117
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
18
3
136
Poly T (5)
13
15
136
0
136
0
100
19
3
131
Poly T (5),
13
15
131
0
131
0
100
SNV
20
3
123
Poly A (5)
13
15
123
0
123
0
100
21
3
117
Poly A (6),
13
15
117
0
117
0
100
Poly T (5),
Région homologue
sur un
chromosome
différent
22
3
119
Région homologue
sur un
chromosome
différent
13
15
119
0
119
0
100
23
3
120
-
13
15
120
0
120
0
100
24
3
129
Poly T (5)
13
15
129
0
129
0
100
25
4
133
Poly C (7),
13
15
133
0
133
0
100
13
15
135
0
135
0
100
66 % en GC
26
4
135
Poly C (5),
69 % en GC
10
27
4
123
SNV
13
15
123
0
123
0
100
28
4
134
-
13
15
134
0
134
0
100
29
4
132
-
13
15
132
0
132
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
30
Chromosome
4
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
121
Poly A (5),
13
15
121
0
121
0
100
6
%
d’appels
corrects7
SNV
31
4
125
-
13
15
125
0
125
0
100
32
4
134
Poly T (5)
13
15
134
0
134
0
100
33
4
118
-
13
15
118
0
118
0
100
34
4
122
Poly A (5)
13
15
122
0
122
0
100
35
4
131
-
13
15
131
0
131
0
100
36
4
133
-
13
15
133
0
133
0
100
37
4
128
Poly T (6)
13
15
128
0
128
0
100
38
4
131
-
13
15
131
0
131
0
100
39
4
129
Poly A (5),
13
15
129
0
129
0
100
13
15
133
0
133
0
100
Poly T (5),
SNV
40
4
133
Poly T (5),
SNV
11
41
4
112
SNV
13
15
112
0
112
0
100
42
4
133
-
13
15
133
0
133
0
100
43
4
135
-
13
15
135
0
135
0
100
44
4
122
-
13
15
122
0
122
0
100
45
4
117
-
13
15
117
0
117
0
100
469
4
124
-
13
15
125
0
125
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
12
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
47
4
117
Poly T (5)
13
15
117
0
117
0
100
48
4
128
Poly A (7)
13
15
128
0
128
0
100
49
4
123
Poly A (6)
13
15
123
0
123
0
100
50
4
133
-
13
15
133
0
133
0
100
51
4
112
-
13
15
112
0
112
0
100
52
4
129
-
13
15
129
0
129
0
100
53
4
126
-
13
15
126
0
126
0
100
54
4
132
-
13
15
132
0
132
0
100
55
5
131
-
13
15
131
0
131
0
100
56
5
119
-
13
15
119
0
119
0
100
57
5
120
Poly A (5)
13
15
120
0
120
0
100
58
5
119
-
13
15
119
0
119
0
100
59
5
118
-
13
15
118
0
118
0
100
60
5
112
-
13
15
112
0
112
0
100
61
5
120
-
13
15
120
0
120
0
100
62
5
120
Poly A (5)
13
15
120
0
120
0
100
63
5
115
CT(5)
13
15
115
0
115
0
100
64
5
112
SNV
13
15
112
0
112
0
100
65
5
135
Poly T (6)
13
15
135
0
135
0
100
66
5
131
63 % en GC
13
15
131
0
131
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
67
5
121
-
13
15
121
0
121
0
100
68
5
132
Poly A (6),
13
15
132
0
132
0
100
Poly T (8)
69
7
133
-
13
15
133
0
133
0
100
70
7
120
60 % en GC
13
15
120
0
120
0
100
71
7
135
-
13
15
135
0
135
0
100
72
7
126
Poly A (5),
13
15
126
0
126
0
100
59 % en GC
73
7
134
-
13
15
134
0
134
0
100
74
7
122
Poly C (5),
13
15
122
0
122
0
100
13
15
127
0
127
0
100
63 % en GC
75
7
127
59 % en GC;
SNV
76
7
123
-
13
15
123
0
123
0
100
77
7
125
-
13
15
125
0
125
0
100
78
7
133
Poly A (5),
13
15
133
0
133
0
100
Poly T (5)
13
79
7
116
-
13
15
116
0
116
0
100
80
7
135
-
13
15
135
0
135
0
100
81
7
118
-
13
15
118
0
118
0
100
82
7
136
67 % en GC
13
15
136
0
136
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
83
7
131
58 % en GC
13
15
131
0
131
0
100
84
7
119
Poly G (6),
13
15
119
0
119
0
100
61 % en GC
14
85
7
122
Poly T (5)
13
15
122
0
122
0
100
86
7
123
Poly A (6)
13
15
123
0
123
0
100
87
8
127
60 % en GC
13
15
127
0
127
0
100
88
8
129
57 % en GC
13
15
129
0
129
0
100
89
9
130
Poly T (5)
13
15
130
0
130
0
100
90
9
116
-
13
15
116
0
116
0
100
91
9
119
Région homologue
sur un
chromosome
différent
13
15
119
0
119
0
100
92
9
121
-
13
15
121
0
121
0
100
93
9
117
Région homologue
sur un
chromosome
différent
13
15
117
0
117
0
100
94
9
114
-
13
15
114
0
114
0
100
9510
9
129
Poly A (14)
13
15
130
0
129 (sur 130)
15
99,23
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
96
Chromosome
9
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
114
Région homologue
sur un
chromosome
différent
13
15
114
0
114
0
100
6
%
d’appels
corrects7
SNV
97
9
122
-
13
15
122
0
122
0
100
98
9
127
Poly A (5),
13
15
127
0
127
0
100
Poly C (5)
99
9
133
-
13
15
133
0
133
0
100
100
9
138
64 % en GC
13
15
138
0
138
0
100
101
9
139
-
13
15
139
0
139
0
100
102
9
116
-
13
15
116
0
116
0
100
103
9
133
Poly A (5),
13
15
133
0
133
0
100
57 % en GC
104
9
138
57 % en GC
13
15
138
0
138
0
100
105
9
136
Poly C (5),
13
15
136
0
136
0
100
67 % en GC
106
9
118
70 % en GC
13
15
118
0
118
0
100
107
10
128
62 % en GC
13
15
128
0
128
0
100
108
10
120
60 % en GC
13
15
120
0
120
0
100
109
10
139
58 % en GC;
13
15
139
0
139
0
100
13
15
118
0
118
0
100
SNV
110
15
10
118
| Référence 15050260, rév. B FRA
57 % en GC
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
111
10
123
Poly T (5)
13
15
123
0
123
0
100
112
10
121
-
13
15
121
0
121
0
100
113
10
129
26 % en GC
13
15
129
0
129
0
100
114
10
122
-
13
15
122
0
122
0
100
115
10
124
Poly T (5);
13
15
124
0
124
0
100
Région homologue
sur un
chromosome
différent
116
10
135
CA (4)
13
15
135
0
135
0
100
117
10
135
Poly A (6);
13
15
135
0
135
0
100
13
15
119
0
119
0
100
Région homologue
sur un
chromosome
différent
118
10
119
Poly C (5);
SNV
16
119
10
125
-
13
15
125
0
125
0
100
120
10
131
-
13
15
131
0
131
0
100
121
10
117
-
13
15
117
0
117
0
100
122
10
116
-
13
15
116
0
116
0
100
123
10
129
58 % en GC
13
15
129
0
129
0
100
124
11
117
Poly T (10)
13
15
117
0
117
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
125
11
117
Poly T (5)
13
15
117
0
117
0
100
126
11
113
Poly A (5)
13
15
113
0
113
0
100
127
11
129
-
13
15
129
0
129
0
100
128
11
121
Poly T (5)
13
15
121
0
121
0
100
129
11
123
-
13
15
123
0
123
0
100
130
11
127
Poly A (6)
13
15
127
0
127
0
100
131
11
136
Poly T (6)
13
15
136
0
136
0
100
132
11
132
Poly T (5)
13
15
132
0
132
0
100
133
11
115
-
13
15
115
0
115
0
100
134
11
117
Poly T (8);
13
15
117
0
117
0
100
13
15
134
0
134
0
100
19 % en GC
135
11
134
Poly A (5);
Poly T (5)
136
11
131
Poly A (5)
13
15
131
0
131
0
100
137
11
133
26 % en GC;
13
15
133
0
133
0
100
13
15
137
0
137
0
100
SNV
138
11
137
Poly T (8);
SNV
17
139
11
131
Poly A (5)
13
15
131
0
131
0
100
140
12
131
-
13
15
131
0
131
0
100
141
12
128
-
13
15
128
0
128
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
142
12
133
Poly A (5)
13
15
133
0
133
0
100
143
12
136
-
13
15
136
0
136
0
100
144
12
124
-
13
15
124
0
124
0
100
145
12
122
59 % en GC
13
15
122
0
122
0
100
146
13
122
-
13
15
122
0
122
0
100
147
13
116
Poly C (5)
13
15
116
0
116
0
100
148
13
133
-
13
15
133
0
133
0
100
149
13
117
SNV
13
15
117
0
117
0
100
150
13
124
Poly T (6)
13
15
124
0
124
0
100
151
13
123
Poly T (5);
13
15
123
0
123
0
100
26 % en GC
18
152
13
115
Poly A (5)
13
15
115
0
115
0
100
153
13
125
-
13
15
125
0
125
0
100
154
13
121
-
13
15
121
0
121
0
100
155
13
123
-
13
15
123
0
123
0
100
156
13
114
-
13
15
114
0
114
0
100
157
13
119
-
13
15
119
0
119
0
100
158
14
122
58 % en GC
13
15
122
0
122
0
100
159
16
122
-
13
15
122
0
122
0
100
160
16
121
-
13
15
121
0
121
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
161
16
123
Poly C (5)
13
15
123
0
123
0
100
162
17
119
-
13
15
119
0
119
0
100
163
17
119
61 % en GC
13
15
119
0
119
0
100
164
17
135
-
13
15
135
0
135
0
100
165
17
116
Poly C (6);
13
15
116
0
116
0
100
60 % en GC;
SNV
166
17
123
-
13
15
123
0
123
0
100
167
17
116
62 % en GC
13
15
116
0
116
0
100
168
17
118
Poly C (5);
13
15
118
0
118
0
100
65 % en GC
169
17
129
-
13
15
129
0
129
0
100
170
17
131
Poly G (6);
13
15
131
0
131
0
100
67 % en GC;
SNV
19
171
17
127
61 % en GC
13
15
127
0
127
0
100
172
17
118
Poly C (5)
13
15
118
0
118
0
100
173
17
138
61 % en GC
13
15
138
0
138
0
100
174
17
131
58 % en GC
13
15
131
0
131
0
100
175
18
112
-
13
15
112
0
112
0
100
176
18
124
-
13
15
124
0
124
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
177
18
134
Poly A (6)
13
15
134
0
134
0
100
178
18
129
-
13
15
129
0
129
0
100
179
18
133
-
13
15
133
0
133
0
100
180
18
118
-
13
15
118
0
118
0
100
181
18
114
60 % en GC
13
15
114
0
114
0
100
182
18
118
-
13
15
118
0
118
0
100
183
19
122
Poly G (6);
13
15
122
0
122
0
100
66 % en GC
184
19
139
64 % en GC
13
15
139
0
139
0
100
185
19
131
67 % en GC
13
15
131
0
131
0
100
186
19
141
59 % en GC;
13
15
141
0
141
0
100
13
15
121
0
121
0
100
Région homologue
sur un
chromosome
différent
187
19
121
Poly C (5);
72 % en GC;
Région homologue
sur un
chromosome
différent
20
188
19
138
58 % en GC
13
15
138
0
138
0
100
189
19
123
64 % en GC
13
15
123
0
123
0
100
190
19
138
-
13
15
138
0
138
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Amplicon
Chromosome
Taille du
fragment
analysé 1
Contenu
génomique de
l’amplicon
Nombre
d’échantillons
uniques
Nombre total
d’échantillons
analysés 2
Nombre d’appels par
échantillon ayant été
effectués 3
Nombre
d’aucunappel 4
Nombre
d’appels corrects
par échantillon 5
Nombre
d’appels
incorrects
6
%
d’appels
corrects7
191
20
117
Poly T (5)
13
15
117
0
117
0
100
192
22
136
Poly A (7)
13
15
136
0
136
0
100
193
22
122
Poly A (5);
13
15
122
0
122
0
100
13
15
122
0
122
0
100
13
15
119
0
119
0
100
Poly C (5)
194
22
122
62 % en GC;
SNV
195
22
119
66 % en GC
S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible.
Le nombre total d’échantillons répertoriés est de 15, car deux des 13 échantillons uniques analysés ont été analysés en deux réplicats indépendants.
3 Le nombre d’appels par échantillon ayant été effectués est le nombre de bases ayant une qualité suffisante pour être définis par le système.
4 Le nombre d’aucun-appels est le nombre de bases dans un amplicon entraînant aucun appel dans l’analyse.
5 Le nombre d’appels corrects par échantillon est le nombre de bases dans l’amplicon qui ont été définies et ayant des résultats correspondant à la séquence de référence du génome
humain version 19 et la référence composite bien caractérisée.
6 Le nombre d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects pour le SNV ou l’indel dans cet amplicon; des détails supplémentaires sur les appels incorrects sont présentés dans
les notes de bas de page ci-dessous.
7 Le % d’appels corrects correspond au taux d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur les renseignements de référence
composite bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence de l’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain
version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons contiennent un indel et d’autres non, par exemple, l’amplicon 9. Le %
d’appels corrects pour les échantillons avec un résultat incorrect est présenté dans le tableau.
8 L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Toutefois, les renseignements de référence composite bien
caractérisée pour sept des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces sept échantillons, cette suppression d’une paire de bases représente un faux négatif
dans l’étude de précision de séquençage MiSeqDx.
9 L’amplicon 46 a une insertion de bases qui est rapportée dans neuf échantillons dans la base de données de référence bien caractérisée et est correctement détectée dans tous les
échantillons analysés.
10 L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de référence composite bien
caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion de paire de bases représente un faux négatif dans
l’étude de précision de séquençage MiSeqDx.
1
2
21
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Le tableau suivant contient les données de l’Étude 1 présentées avec la concordance positive et négative en pour cent,
où les résultats des variants sont comparés aux renseignements de référence composite bien caractérisée pour le calcul
de la concordance positive en pour cent (CPP). Étant donné que les renseignements de référence composite fournissent
uniquement des résultats pour les variants mononucléotides et les insertions/suppressions, les résultats des bases sans
variants sont comparés à la séquence de référence du génome humain version 19 pour le calcul de la concordance
négative en pour cent (CNP). Toutes les bases sans variants avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence
de référence. Tous les SNV avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence de référence. Les variants qui ont
été manqués étaient des insertions d’une base ou des suppressions d’une base dans les régions d’homopolymères.
Tableau 2 Concordance des résultats des définitions des bases de la plateforme MiSeqDx avec les données de référence pour
13 échantillons bien caractérisés
Échantillon
Nbre
d’amplicons
% de
couverture
d’amplicons1
Variants attendus
par échantillon 2
Variants
Variants
correctement
manqués3
appelés
Bases sans
variants appelées
correctement
CPP 4
(%)
CNP 5
(%)
NA12877
195
100
19
17
2
24418
89,47
100
NA12878
195
100
19
17
2
24417
89,47
100
NA12879
195
100
20
19
1
24416
95,00
100
NA12880
195
100
20
18
2
24417
90,00
100
NA12881
195
100
22
20
2
24415
90,91
100
NA12882
195
100
16
15
1
24419
93,75
100
NA12883
195
100
24
23
1
24412
95,83
100
NA12884
195
100
21
20
1
24415
95,24
100
NA12885
195
100
19
17
2
24417
89,47
100
NA12886
195
100
22
20
2
24415
90,91
100
NA12887
195
100
19
18
1
24416
94,74
100
NA12888
195
100
24
23
1
24412
95,83
100
NA12893
195
100
20
18
2
24417
90,00
100
Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité.
Les variants prévus par échantillon comprennent les SNV et les indels.
3 Pour les variants manqués, veuillez consulter le premier tableau de l’étude 1 et les notes de bas de page 8 à 10.
4 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 × TP/(TP + FN), où les vrais positifs (TP) sont le nombre d’appels de variants positifs
aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence et l’allèle mutant appelé est concordant
avec la séquence de référence (colonne nommée « Variants appelés correctement ») et les faux négatifs (FN) sont le nombre d’appels
de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence (colonne nommée
« Variants manqués »).
5 Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 × TN/(FP + TN) où les faux positifs (FP) sont le nombre d’appels de variants positifs
aux coordonnées génomiques où sont absents les variants selon la séquence de référence, ou si l’allèle mutant appelé est discordant
avec la séquence de référence (non référencé dans le tableau; aucun appel de variants faux positifs n’a été effectué dans cette étude)
et les vrais négatifs (TN) sont le nombre d’appels de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont absents les variants
selon la séquence de référence (colonne nommée « Bases sans variants appelées correctement »).
1
2
Étude 2
Les résultats de séquençage pour le panel d’amplicons ci-dessus ont été comparés à un génotype d’une grande fiabilité
établi pour NA12878 par le National Institutes of Standards and Technology (NIST, Institut national des normes et de la
Février 2015
Référence 15050260, rév. B FRA
| 22
Instrument MiSeqDx
technologie) (v.2.151). Sur les 195 amplicons, 184 amplicons étaient compris dans les appels de référence d’une grande
fiabilité dans la séquence du NIST et ont été comparés. Les définitions des bases sans variants ont été comparées à la
séquence du génome humain de référence version 19.
Tableau 3 Comparaison des résultats de séquençage de la plateforme MiSeqDx pour l’échantillon NA12878 avec la base de
données du NIST
Échantillon
Nbre
d’amplicons
% de
couverture
d’amplicons2
Variants
attendus
Variants
correctement
appelés
Variants
manqués
Bases sans
variants appelées
correctement
CPP 3
(%)
CNP 4
(%)
NA12878
184
100
17
16
15
23066
94,12
100
Zook, JM et coll. Integrating sequencing datasets to form highly confident SNP and indel genotype calls for a whole human genome.
arXiv:1307.4661 [q-bio.GN].
2 Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité.
3 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 × TP/(TP + FN).
4 Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 × TN/(FP + TN).
5 Le variant manqué est la suppression d’une paire de bases dans l’amplicon 9 d’une analyse homopolymère de 14 A non appelés par le
système MiSeqDx présente dans la séquence NIST. Notez que la séquence NIST n’inclut pas l’insertion d’une paire de bases dans
l’autre homopolymère de A qui était présent dans l’autre base de données de référence utilisée ci-dessus dans l’étude 1.
1
Étude 3
Une étude de précision supplémentaire a été réalisée pour évaluer les performances des petites insertions et délétions
dans le cadre d’un test représentatif, le test de fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx d’Illumina, qui comprenait un
sous-ensemble de variations génétiques CFTR significatives sur le plan clinique et analysées avec le logiciel MiSeq
Reporter en utilisant le flux de travail ciblé de séquençage de l’ADN associé à la plateforme MiSeqDx. Les insertions et
délétions demandées ont été détectées à l’emplacement prévu avec une fiabilité élevée. Ces échantillons ont été
caractérisés grâce au séquençage bidirectionnel Sanger utilisé comme méthode de référence pour établir la séquence
prévue.
Tableau 4 Résumé de la détection des indels à l’aide de la plateforme MiSeqDx
23
Nbre
d’appels par
échantillon
ayant été
effectués
Nbre de bases
appelées par
échantillon
Nbre
d’aucunappel
Nbre d’appels
corrects par
échantillon
Nbre
d’appels
incorrects
%
d’appels
corrects
Insertion d’une
base
130
130
0
130
0
100
154
Délétion de trois
bases
151
151
0
151
0
100
3
167
Délétion de
deux bases
165
165
0
165
0
100
4
134
Délétion d’une
base
133
133
0
133
0
100
5
132
Délétion d’une
base
131
131
0
131
0
100
6
129
Délétion d’une
base
128
128
0
128
0
100
Amplicon
Taille
des
inserts
Contenu
génomique de
l’amplicon
1
129
2
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Les données qui ressortent de ces études de précision confirment que la plateforme MiSeqDx peut séquencer avec
précision les éléments suivants.
• Teneur en GC ≥ 19 % (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés ayant un taux de 19 % de teneur
en GC appelé correctement)
• Teneur en GC ≤ 72 % (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés ayant un taux de 72 % de teneur
en GC appelé correctement)
• Longueurs de PolyA ≤ 7 (la répétition PolyA de sept nucléotides a été appelée correctement dans 270 des
270 amplicons séquencés contenant PolyA = 7)
• Longueurs de PolyT ≤ 8 (la répétition PolyT de huit nucléotides a été appelée correctement dans 270 des
270 amplicons séquencés contenant PolyT = 8)
• Longueurs de PolyG ≤ 6 (la répétition PolyG de six nucléotides a été appelée correctement dans 405 des
405 amplicons séquencés contenant PolyG = 6)
• Longueurs de PolyC ≤ 7 (la répétition PolyC de sept nucléotides a été appelée correctement dans 135 des
135 amplicons séquencés contenant PolyC = 7)
• Longueurs de répétition de dinucléotides ≤ 5 × (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés avec
une répétition de dinucléotides de 5 × ont été appelées correctement)
• Longueurs de répétition de trinucléotides ≤ 4 × (toutes les bases dans 810 des 810 amplicons séquencés avec
une répétition de trinucléotides de 4 × ont été appelées correctement)
• Insertions d’une base et suppression de trois bases ou moins
— Deux des trois insertions d’une base testées ont été appelées correctement. Des appels corrects ont été
effectués pour deux insertions d’une base dans des régions non homopolymères dans 82 amplicons. Une
insertion d’une base n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur le chromosome 2
dans 135 amplicons.
— Trois des quatre suppressions d’une base ont été appelées correctement. Tous les appels corrects ont été
effectués dans des régions non homopolymères dans quatre amplicons. Une suppression d’une base n’a
pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur le chromosome 9 dans 63 amplicons.
— La suppression de deux bases a été appelée correctement dans un échantillon.
— Les suppressions de trois bases ont été appelées correctement dans 21 échantillons.
Reproductibilité
La reproductibilité de la plateforme MiSeqDx a été déterminée à l’aide de deux tests représentatifs.
Étude 1
Un test représentatif a été conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et
contenant des exons potentiellement pertinents sur le plan clinique. L’étude a permis d’examiner 13 échantillons au
cours de neuf analyses à l’aide de trois instruments MiSeqDx différents avec le concours de trois opérateurs distincts
(Tableau 5). Un lot unique de réactifs de préparation de la librairie et deux lots de consommables pour le séquençage
ont été utilisés. Les 13 échantillons provenaient de deux parents et 11 enfants qui avaient été fréquemment séquencés par
plusieurs laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Deux échantillons ont été analysés en double
exemplaire, donc chaque analyse a généré des résultats pour 15 échantillons.
Pour l’évaluation de la reproductibilité d’un lot à l’autre, 94 échantillons et deux contrôles sans modèle ont été testés
dans l’ensemble des trois lots. Chaque lot a été scindé en deux analyses de 48 échantillons pour tester tous les réactifs et
les combinaisons de primers d’index possibles. Toutes les analyses de séquençage ont été réalisées par un seul opérateur
sur un seul instrument MiSeqDx pour éviter toute variation éventuelle due à l’opérateur ou à l’instrument (Tableau 6).
Des appels corrects ont été déterminés pour les variants mononucléotides (SNV) en comparant les données de l’étude à
des renseignements de référence bien caractérisée. Il n’y a eu aucun échec d’analyse ou répétition d’analyse pour l’étude
de reproductibilité. Les tableaux suivants contiennent les résultats des études destinées à évaluer la reproductibilité du
système.
Février 2015
Référence 15050260, rév. B FRA
| 24
Instrument MiSeqDx
Tableau 5 Résultats de la reproductibilité d’instrument-à-instrument de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx (au niveau de l’amplicon)
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
1
1
132
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
Poly C (5);
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
236
0
99,617
396
0
99,347
63 % en GC
2
1
128
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
3
2
133
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
4
2
119
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
5
2
127
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
6
2
135
Poly A (6)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
7
2
122
Poly T (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly C (5)
8
2
110
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
9
2
131
Poly A (14)
135
0
278
99,54
0
278
99,54
0
278
99,54
10
2
117
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
11
2
121
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
12
2
114
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
13
2
129
Poly A (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
14
3
131
Poly A (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly T (5)
15
25
3
130
-
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
16
3
130
-
17
3
117
18
3
136
19
3
131
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly T (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly A (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly A (6);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
SNV
20
3
123
21
3
117
Poly T (5);
Région
homologue
sur un
chromosome
différent
22
3
119
Région
homologue
sur un
chromosome
différent
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
23
3
120
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
24
3
129
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
25
4
133
Poly C (7);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
66 % en GC
26
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
26
4
135
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
Poly C (5);
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
69 % en GC
27
4
123
SNV
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
28
4
134
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
29
4
132
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
30
4
121
Poly A (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
SNV
31
4
125
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
32
4
134
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
33
4
118
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
34
4
122
Poly A (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
35
4
131
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
36
4
133
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
37
4
128
Poly T (6)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
38
4
131
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
39
4
129
Poly A (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly T (5);
SNV
40
4
133
Poly T (5);
SNV
27
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
28
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
41
4
112
SNV
42
4
133
43
4
44
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
135
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
4
122
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
45
4
117
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
46
4
124
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
47
4
117
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
48
4
128
Poly A (7)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
49
4
123
Poly A (6)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
50
4
133
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
51
4
112
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
52
4
129
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
53
4
126
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
54
4
132
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
55
5
131
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
56
5
119
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
57
5
120
Poly A (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
58
5
119
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
59
5
118
-
60
5
112
61
5
62
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
120
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
5
120
Poly A (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
63
5
115
CT(5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
64
5
112
SNV
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
65
5
135
Poly T (6)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
66
5
131
63 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
67
5
121
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
68
5
132
Poly A (6);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly T (8)
69
7
133
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
70
7
120
60 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
71
7
135
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
72
7
126
Poly A (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
59 % en GC
73
7
134
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
74
7
122
Poly C (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
63 % en GC
29
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
75
7
127
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
59 % en GC;
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
SNV
76
7
123
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
77
7
125
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
78
7
133
Poly A (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
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100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
de
l’amplicon
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9
119
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homologue
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chromosome
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| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
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l’amplicon
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100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
115
10
124
Contenu
génomique
de
l’amplicon
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| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
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l’amplicon
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100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
de
l’amplicon
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100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
159
16
122
-
160
16
121
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162
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
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d’aucunappels3
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d’appels
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d’aucunappels3
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0
0
100
0
0
100
172
17
118
Poly C (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
173
17
138
61 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
174
17
131
58 % en GC
175
18
112
176
18
177
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
124
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
18
134
Poly A (6)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
178
18
129
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
179
18
133
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
180
18
118
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
181
18
114
60 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
182
18
118
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
183
19
122
Poly G (6);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
66 % en GC
184
19
139
64 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
185
19
131
67 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
186
19
141
59 % en GC;
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Région
homologue
sur un
chromosome
différent
37
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
MiSeqDx 1
Amplicon
Chr.
Taille
du
fragment
analysé1
187
19
121
Contenu
génomique
de
l’amplicon
Nombre
d’analyses
d’échantillons2
Poly C (5);
MiSeqDx 2
MiSeqDx 3
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
Nombre
total
d’aucunappels3
Nombre
total
d’appels
incorrects4
%
d’appels
corrects5
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
72 % en GC;
Région
homologue
sur un
chromosome
différent
188
19
138
58 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
189
19
123
64 % en GC
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
190
19
138
-
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
191
20
117
Poly T (5)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
192
22
136
Poly A (7)
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
193
22
122
Poly A (5);
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
135
0
0
100
0
0
100
0
0
100
Poly C (5)
194
22
122
62 % en GC;
SNV
195
22
119
66 % en GC
S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible.
Le nombre d’échantillons est calculé à partir de neuf analyses de 15 échantillons (11 échantillons analysés une fois et deux échantillons analysés deux fois).
3 Le nombre total d’aucun-appels est le nombre total d’aucun-appels obtenu pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx spécifié.
4 Le nombre total d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects obtenus pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx
spécifié.
5 Le % d’appels corrects correspond au débit d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur la base de données de
référence bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence d’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain
version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons doivent avoir un indel et d’autres non, par exemple, l’amplicon 9.
1
2
38
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
L’amplicon 1 possédait un certain nombre de bases dont le génotype ne pouvait pas être appelé : 12 bases dans une analyse sur neuf dans NA12881; une base dans deux analyses sur
neuf et trois bases dans une analyse sur neuf dans NA12886; 20 bases dans une analyse sur neuf et 26 bases dans une analyse sur neuf dans NA12888. Cela est dû à la faible
couverture dans les bases sans aucun appel dans ces analyses, où la profondeur moyenne de séquençage était de 33,2, avec un minimum de 21 et un maximum de 52.
7 Lorsque le nombre d’aucun-appels n’est pas inclus dans le calcul, le taux d’appels corrects est de 100 %.
8 L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les renseignements de référence bien caractérisée pour
sept des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces sept échantillons, cette suppression d’une paire de bases s’appelle un faux négatif et est appelée
comme faux négatif de façon reproductible dans les neuf analyses.
9 L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de renseignements de référence bien
caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion d’une paire de bases n’est pas appelée de façon
reproductible à 100 % (c.-à-d. qu’il s’agit d’un faux négatif).
6
39
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Les résultats de l’étude 1 de reproductibilité pour chaque échantillon sont présentés pour l’ensemble des neuf analyses en une seule colonne. Les résultats affichés
portent uniquement sur les variants à simple nucléotide et les résultats des insertions/délétions par rapport à la séquence de la base de données de référence pour
les trois analyses réalisées sur trois instruments. Cette analyse a montré que les résultats des variants étaient reproductibles dans neuf analyses pour ces
échantillons.
Tableau 6 Résumé des résultats de reproductibilité de la plateforme MiSeqDx pour 13 échantillons bien caractérisés
Variants mononucléotides (SNV)
Nº
d’ADN
Identifiant de
l’échantillon
d’ADN
Nombre
d’analyses par
échantillon
Nombre
de SNV
1
NA128773
18
2
NA128783
3
Insertions/délétions (indels)
Nombre de bases
appelées
correctement
Nombre de
faux
positifs1
Nombre de
faux
négatifs2
16
16
0
0
18
17
17
0
NA12879
9
18
18
4
NA12880
9
17
5
NA12881
9
6
NA12882
7
Nombre
d’indels
Nombre de bases
appelées
correctement
Nombre de
faux
positifs1
Nombre de
faux
négatifs2
3
1
0
2
0
2
0
0
2
0
0
2
1
0
1
17
0
0
3
1
0
2
19
19
0
0
3
1
0
2
9
15
15
0
0
1
0
0
1
NA12883
9
22
22
0
0
2
1
0
1
8
NA12884
9
19
19
0
0
2
1
0
1
9
NA12885
9
17
17
0
0
2
0
0
2
10
NA12886
9
19
19
0
0
3
1
0
2
11
NA12887
9
18
18
0
0
1
0
0
1
12
NA12888
9
22
22
0
0
2
1
0
1
13
NA12893
9
17
17
0
0
3
1
0
2
Faux positif = variant appelé par l’analyse de séquençage MiSeqDx, mais ne figurant pas dans la base de données de référence.
Faux négatif = variant figurant dans la base de données de référence, mais non appelé au cours de l’analyse de séquençage MiSeqDx.
3 Les échantillons NA12877 et NA12878 ont été analysés deux fois. Les échantillons répliqués ont généré des résultats identiques.
1
2
40
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Étude 2
Une étude de reproductibilité de site à site a été effectuée avec un test représentatif, le test de la fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx d’Illumina, incluant un
sous-ensemble de variations du gène CFTR pertinentes d’un point de vue clinique analysées avec le logiciel MiSeq Reporter à l’aide de la plateforme de flux de
travail de séquençage d’ADN ciblé MiSeqDx. L’étude en aveugle a été réalisée sur trois sites d’essais et a nécessité deux opérateurs sur chaque site. Deux panels
bien caractérisés de 46 échantillons chacun ont été analysés par chacun des opérateurs sur chaque site pour un total de 810 appels par site. Les panels contenaient
un mélange d’ADN génomique issu des lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR, ainsi que du sang déleucocyté enrichi de lignées
cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR. Les échantillons de sang ont été fournis pour permettre l’incorporation des étapes d’extraction utilisées
dans la préparation d’ADNg qui sert d’entrée primaire pour le flux de travail du test. Le débit de passage des échantillons, défini comme le nombre
d’échantillons passant les indicateurs de contrôle qualité lors de la première tentative, était de 99,88 %. Tous les résultats des tests sont basés sur un test initial.
Tableau 7 Résumé des résultats de l’étude de reproductibilité réalisée avec un test représentatif de la fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx.
Panel
Nº
d’échantillon
Génotype de
l’échantillon
Variants
Nombre
Appels concordants
total
positifs (variants)
d’appels
par site
41
Appels concordants
négatifs (de type
Nbre
Nbre
sauvage)
d’appels
d’aucun-
incorrects
appels
Site 1
Site 2
Site 3
Site 1
Site 2
Site 3
Concordance
Concordance
Concordance
positive (%)
négative (%)
globale (%)
A
1
S549N (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
2
1812-1 G>A (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
3
Q493X/F508del (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
41
F508del/2184delA
(HET)
810
12
12
12
797
798
798
0
11
100
100
100
A
52
Y122X/R1158X (HET)
810
12
10
12
798
665
798
0
1352
94,44
94,44
94,44
A
6
F508del/2183AA>G
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
7
R75X (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
8
I507del/F508del
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
93
F508del/W1282X
(HET)
810
12
11
12
798
797
798
23
0
97,22
99,96
99,92
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
Nº
d’échantillon
Génotype de
l’échantillon
Variants
Nombre
Appels concordants
total
positifs (variants)
d’appels
par site
42
Appels concordants
négatifs (de type
Nbre
Nbre
sauvage)
d’appels
d’aucun-
incorrects
appels
Site 1
Site 2
Site 3
Site 1
Site 2
Site 3
Concordance
Concordance
Concordance
positive (%)
négative (%)
globale (%)
A
103
F508del/3272-26A>G
(HET)
810
12
11
12
798
797
798
23
0
97,22
99,96
99,92
A
11
F508del/3849+10kbC>T
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
12
621+1G>T/3120+1G>A
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
13
E60X/F508del (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
14
M1101K (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
15
M1101K (HOM)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
16
F508del (HOM)
828
6
6
6
822
822
822
0
0
100
100
100
A
17
F508del/3659delC
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
18
R117H/F508del (HET)
816
18
18
18
798
798
798
0
0
100
100
100
A
19
621+1G>T/711+1G>T
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
20
G85E/621+1G>T
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
21
A455E/F508del (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
I506V,
I507V,
F508C
absents
(TG)10
(T)9/
(TG)12
(T)5
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
Nº
d’échantillon
Génotype de
l’échantillon
Variants
Nombre
Appels concordants
total
positifs (variants)
d’appels
par site
43
Appels concordants
négatifs (de type
Nbre
Nbre
sauvage)
d’appels
d’aucun-
incorrects
appels
Site 1
Site 2
Site 3
Site 1
Site 2
Site 3
Concordance
Concordance
Concordance
positive (%)
négative (%)
globale (%)
A
22
F508del/R560T (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
23
F508del/Y1092X (C>A)
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
24
N1303K (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
25
G542X (HOM)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
26
G542X (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
27
G551D/R553X (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
28
3849+10kbC>T (HOM)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
29
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
A
30
F508del (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
31
1717-1G>A (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
32
R1162X (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
33
R347P/G551D (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
34
R334W (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
35
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
A
36
G85E (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
37
I336K (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
38
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
Nº
d’échantillon
Génotype de
l’échantillon
Variants
Nombre
Appels concordants
total
positifs (variants)
d’appels
par site
44
Appels concordants
négatifs (de type
Nbre
Nbre
sauvage)
d’appels
d’aucun-
incorrects
appels
Site 1
Site 2
Site 3
Site 1
Site 2
Site 3
Concordance
Concordance
Concordance
positive (%)
négative (%)
globale (%)
A
39
F508del/3849+10kbC>T
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
40
621+1G>T/3120+1G>A
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
41
F508del/3659delC
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
42
R117H/F508del (HET)
816
18
18
18
798
798
798
0
0
100
100
100
A
43
G85E/621+1G>T
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
44
A455E/F508del (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
A
45
N1303K (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
A
46
G551D/R553X (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
47
2789+5G>A (HOM)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
48
CFTR dele2, 3/F508del
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
49
F508del/1898+1G>A
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
50
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
51
F508del/2143delT
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
(TG)10
(T)9/
(TG)12
(T)5
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
Nº
d’échantillon
Génotype de
l’échantillon
Variants
Nombre
Appels concordants
total
positifs (variants)
d’appels
par site
45
Appels concordants
négatifs (de type
Nbre
Nbre
sauvage)
d’appels
d’aucun-
incorrects
appels
Site 1
Site 2
Site 3
Site 1
Site 2
Site 3
Concordance
Concordance
Concordance
positive (%)
négative (%)
globale (%)
B
52
3876delA (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
53
3905insT (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
54
394delTT (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
55
F508del (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
56
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
57
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
58
F508del (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
59
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
60
L206W (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
61
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
62
G330X (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
63
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
64
R347H (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
65
1078delT (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
66
G178R/F508del (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
67
S549R (c.1647T>G)
(HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
68
S549N (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
Nº
d’échantillon
Génotype de
l’échantillon
Variants
Nombre
Appels concordants
total
positifs (variants)
d’appels
par site
46
Appels concordants
négatifs (de type
Nbre
Nbre
sauvage)
d’appels
d’aucun-
incorrects
appels
Site 1
Site 2
Site 3
Site 1
Site 2
Site 3
Concordance
Concordance
Concordance
positive (%)
négative (%)
globale (%)
B
69
W846X (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
70
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
71
E92X/F508del (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
724
621+1G>T/1154insTC
(HET)
810
12
12
12
798
798
797
0
14
100
99,96
99,96
B
73
G542X (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
74
F508del (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
752
F508del (HET)
810
6
5
6
804
670
804
0
1352
94,44
94,44
94,44
B
76
F508del (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
77
621+1G>T/A455E
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
78
1812-1 G>A (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
79
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
80
F508del/R553X (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
81
F508del/G551D (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
82
R347P/F508del (HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
83
R117H/F508del (HET)
816
18
18
18
798
798
798
0
0
100
100
100
| Référence 15050260, rév. B FRA
(TG)10
(T)9/
(TG)12
(T)5
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Panel
Nº
d’échantillon
Génotype de
l’échantillon
Variants
Nombre
Appels concordants
total
positifs (variants)
d’appels
par site
Appels concordants
négatifs (de type
Nbre
Nbre
sauvage)
d’appels
d’aucun-
incorrects
appels
Site 1
Site 2
Site 3
Site 1
Site 2
Site 3
Concordance
Concordance
Concordance
positive (%)
négative (%)
globale (%)
B
84
I507del (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
85
2789+5G>A (HOM)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
864
CFTR dele2, 3/F508del
(HET)
810
12
12
12
798
797
798
0
14
100
99,96
99,96
B
87
F508del/1898+1G>A
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
88
TS
810
0
0
0
810
810
810
0
0
S.O.
100
100
B
89
F508del/2143delT
(HET)
810
12
12
12
798
798
798
0
0
100
100
100
B
90
3905insT (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
91
394delTT (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
B
92
F508del (HET)
810
6
6
6
804
804
804
0
0
100
100
100
74 556
2 209
4
273
99,77
99,88
99,88
Total
221 182
L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant N1303K pour un réplicat, n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.
Un réplicat des échantillons 5 et 75 avait un débit d’appel de 0 %. Le complément d’enquête indique que des échantillons peuvent ne pas avoir été ajoutés à la plaque d’échantillons avant
la préparation de la librairie, car les volumes d’échantillon restants dans les tubes ne correspondaient à aucun volume ayant été supprimé.
3 Des preuves indiquent que les échantillons 9 et 10 ont été vraisemblablement échangés par l’opérateur avant la préparation de la librairie.
4 L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant M1V pour un réplicat de chacun des deux échantillons n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.
1
2
47
| Référence 15050260, rév. B FRA
Février 2015
Instrument MiSeqDx
Extraction d’ADN
Trois différentes méthodes d’extraction, à savoir l’extraction à base de billes magnétiques, la précipitation dans l’alcool
et la filtration sur colonne de silice, ont été évaluées à l’aide de sang total K2EDTA anticoagulé. Quatorze échantillons de
sang unique ont été utilisés dans l’étude, représentant une plage de génotypes d’un seul gène représentatif. Les trois
méthodes d’extraction de l’ADN ont été testées indépendamment par deux opérateurs différents qui ont chacun effectué
trois analyses par la méthode d’extraction. Chaque extraction a été réalisée par chaque opérateur à des jours différents.
La concentration d’ADN et le rapport A260/A280 des échantillons d’ADNg extrait ont été déterminés par
spectrophotométrie. La taille totale des échantillons pour chaque méthode d’extraction dans cette étude était de 168
(14 échantillons × 2 opérateurs/méthode d’extraction × 3 analyses/opérateur × 2 réplicats/échantillon d’ADNg extrait).
Méthode d’extraction
Nombre d’échantillons
testés
Débit d’appel
Précision 1
Débit au premier
passage de
l’échantillon 2
Précipitation dans l’alcool
168
100 %
100 %
100 %
Filtration sur colonne de
silice
168
100 %
100 %
100 %
Extraction à base de
billes magnétiques
168
100 %
100 %
100 %
Précision : la concordance en pour cent avec une méthode d’essai de référence (séquençage bidirectionnel de Sanger) calculée pour les
positions de base qui reçoivent une définition des bases.
2 Débit au premier passage de l’échantillon : le nombre d’échantillons respectant le débit d’appel spécifié la première fois qu’ils sont
traités (c’est-à-dire, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une nouvelle analyse ou un traitement supplémentaire) en pourcentage
du nombre total d’analyses d’échantillons au cours d’une seule expérience de séquençage MiSeqDx.
1
Entrée d’ADN
La plage d’entrée d’ADN pour la plateforme MiSeqDx a été évaluée en effectuant une étude de dilution en série à
l’aide de 14 échantillons d’ADN représentatifs contenant 16 variants du gène unique. Chaque échantillon a été testé en
double exemplaire sur neuf niveaux d’entrée d’ADN allant de 1 250 ng à 1 ng (1 250 ng, 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng,
25 ng, 10 ng, 5 ng et 1 ng). Pour la détermination de la précision, des génotypes de l’échantillon ont été comparés aux
données de séquençage bidirectionnel par la méthode de Sanger. Les limites supérieure et inférieure identifiées pour
une entrée d’ADN sont respectivement de 1 250 ng et 25 ng, car elles présentaient un débit au premier passage ≥ 95 %
sans aucun appel incorrect (précision et débit d’appel de 100 %).
Les entrées d’ADN de 1 250 ng, 250 ng et 100 ng ont fait l’objet d’autres tests avec quatre échantillons d’ADN
représentatifs et 20 réplicats par niveau d’entrée d’ADN pour chaque échantillon (n = 4 × 20 = 80 échantillons), tandis
que la limite inférieure de 25 ng a été testée avec 14 échantillons, 20 réplicats pour chaque échantillon
(n = 14 × 20 = 280 échantillons). Le débit au premier passage de l’échantillon et le taux de précision était de 100 % à tous
les niveaux d’entrée d’ADN et les débits d’appel de l’échantillon étaient > 99 %.
Substances interférentes
Pour évaluer l’impact des substances interférentes sur la plateforme MiSeqDx, un test représentatif conçu pour étudier
un seul gène couvrant 11 529 bases a été évalué en présence et en l’absence d’interférences potentielles. Huit échantillons
de sang total représentant huit génotypes uniques ont été utilisés dans l’étude. Quatre substances interférentes endogènes
(bilirubine, cholestérol, hémoglobine et triglycérides) ont été testées en les intégrant dans les échantillons de sang total
avant l’extraction d’ADN. Pour évaluer l’interférence résultant du prélèvement sanguin (petit volume), de l’EDTA a été
intégré dans des échantillons de sang à deux concentrations. Les limites de concentration pour chaque substance sont
indiquées dans le tableau ci-dessous. En outre, afin d’évaluer les interférences résultant de la préparation des
échantillons, on a ajouté 15 % de tampon de lavage à huit ADN génomiques purifiés. Un débit d’appel de 100 % a été
Février 2015
Référence 15050260, rév. B FRA
| 48
Instrument MiSeqDx
atteint pour tous les échantillons testés en plus des 100 % de reproductibilité dans les typages génotypiques entre les
échantillons en présence et en l’absence de substances interférentes.
Substance de test
Nombre total de
réplicats
Concentration analysée
dans le sang
(limite supérieure)
Concentration analysée
dans le sang
(limite inférieure)
Débit d’appel
Bilirubine
16
684 µmol/l
137 µmol/l
100 %
Cholestérol
16
13 mmol/l
2,6 mmol/l
100 %
Hémoglobine
16
2 g/l
0,4 g/l
100 %
Triglycéride
16
37 mmol/l
7,4 mmol/l
100 %
EDTA
16
7 mg/ml
2,8 mg/ml
100 %
Indexage de l’échantillon
Des primers d’indexage de l’échantillon sont utilisés dans la trousse pour attribuer un code à barres unique à chaque
échantillon d’ADN, permettant de grouper plusieurs échantillons en une seule analyse de séquençage.
Un total de 96 index d’échantillons a été analysé à l’aide d’un test représentatif conçu pour étudier un seul gène
couvrant 11 529 bases grâce à huit échantillons d’ADN unique pour vérifier la capacité du test à faire systématiquement
un appel de génotypage pour un échantillon donné à travers des combinaisons différentes de primers d’indexage.
Chaque échantillon a été analysé avec 12 combinaisons différentes de primers d’indexage. Quarante-huit (48)
combinaisons d’index ont été testées en une seule analyse de séquençage. Les résultats des échantillons ont été comparés
aux données de séquençage bidirectionnel de Sanger pour l’ensemble des positions/variants. La reproductibilité et la
précision ont été de 100 % pour toutes les combinaisons de primers d’indexage/échantillon.
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