Bio-Rad RAPID'E.coli 2 Manuel utilisateur

V4 - 09/03/2015
RAPID’E.coli 2 Agar
pour le contrôle des eaux
356-3982
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356-4024
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DOMAINE D'APPLICATION
Le RAPID'E.coli 2 permet le dénombrement direct
(sans confirmation) et simultané, des Escherichia coli
et des coliformes totaux, par méthode de filtration sur
membrane.
Il s'avère particulièrement adapté pour le contrôle
des eaux de consommation humaine, notamment
les eaux non traitées (telles que les eaux de puits,
lacs et rivières), qui présentent une flore hydrique
interférante abondante, pour lesquelles les milieux
normalisés sont mal adaptés.
CERTIFICATION AFNOR selon le protocole
AFNOR Rev 1
La méthode RAPID'E.coli 2 pour le contrôle des eaux
est certifiée NF Validation comme méthode
alternative à la norme EN ISO 9308-1, pour le
dénombrement des Escherichia coli et des
Coliformes totaux à 36°C dans les eaux à faible
teneur en MES, dont les eaux de réseau et les
eaux embouteillées, selon le Référentiel de validation
« Protocole de Validation d'une méthode alternative
commerciale par rapport à une méthode de référence
(révision 1) » (adopté par AFNOR Certification le
10/05/2010), sous le n° d'attestation : BRD 07/20 03/11.Pour toute information concernant la validité de
la certification NF VALIDATION, consulter
l’attestation disponible auprès de votre représentant
BIO-RAD ou d’AFNOR Certification.
BRD 07/20 - 03/11
Méthodes d'analyse de l'eau
Performances analytiques certifiées
http://nf-validation.afnor.org
PRINCIPE
Le principe du milieu complet (RAPID'E.coli 2
supplémenté) repose sur la détection simultanée de
deux activités enzymatiques: la β-D-glucuronidase
(GLUC) et la β-D-galactosidase (GAL), par deux
substrats chromogéniques :
• le clivage du substrat spécifique de la GAL
conduit à la formation d'un précipité donnant une
coloration verte aux colonies positives pour cette
enzyme (Coliformes),
• le clivage du substrat spécifique de la GLUC
conduit à la formation d'un précipité donnant une
coloration rose aux colonies positives pour cette
enzyme (E. coli).
Les coliformes (GAL+/GLUC-) forment des colonies
vertes, les E. coli (GAL+/GLUC+) forment des
colonies bleu-foncé à violette en raison de la
superposition des deux couleurs.
Le milieu complet est rendu inhibiteur vis-à-vis de
la flore interférente très importante dans l'eau, par le
mélange sélectif contenu dans le supplément.
PRESENTATION
• RAPID'E.coli 2 Agar
55 mm x 20 boîtes
100 ml x 6 flacons
200 ml x 6 flacons
500g
code 356-3982
code 355-5299
code 355-5297
code 355-4024
• RAPID'E.coli 2 Kit Contrôle des eaux
code 355-5296
Pack incluant :
- 6 flacons de 100 ml de milieu RAPID'E.coli 2
- 1 coffret de 6 ampoules (code 355-5298)
(1 ampoule contient une quantité de lyophilisat
suffisante pour 1 flacon de 100 ml de milieu
RAPID'E.coli 2)
CONSERVATION/VALIDITE/LOT
• Lyophilisé : +2-8°C et à l'abri de la lumière
• Ampoule réhydratée : 7 jours à +2-8°C et à l'abri
de la lumière
• Boîtes de Petri (milieu complet) préparées par
l'utilisateur à partir de l'ampoule réhydratée (non
décongelée) : 3 jours à +2-8°C et à l'abri de la
lumière
• La date de péremption et le numéro de lot sont
indiqués sur le conditionnement.
FORMULE THEORIQUE
Milieu RAPID'E.coli 2
Peptones
Chlorure de sodium
Extrait de levure
Mélange sélectif chromogénique
Agar
Eau distillée
pH (25°C) final = 7,2 ± 0,2
10 g
5g
3g
6g
13 g
1000 ml
1/3
RAPID’E.coli 2 Agar
pour le contrôle des eaux
3 - 04/04/11
Supplément RAPID'E.coli 2
(par ampoule)
Mélange sélectif.
AUTRE(S) PRODUIT(S) NECESSAIRE(S)
NON FOURNI(S)
Eau distillée stérile
MATERIEL NECESSAIRE NON FOURNI
(liste non exhaustive)
• Agitateur-homogénéisateur
• Dispositif de filtration
• Pinces pour la manipulation des membranes
• Pipettes stériles (1 ml, 5 ml….)
• Boîtes de Petri stériles (Ø = 55 mm)
• Membranes filtrantes stériles (Ø = 47 mm,
0,45 µm Millipore HAWG 047 Type HA)
• Bain-marie avec une précision de ±1°C
• Etuves ou enceintes thermostatées avec une
précision de ±1°C
• Tout matériel courant d'un laboratoire
PREPARATION DU MILIEU DESHYDRATE
Toujours agiter avant chaque utilisation
Dissoudre 37 grammes de poudre dans un litre
d’eau distillée. Attendre 5 minutes, puis mélanger
jusqu'à l’obtention d’une suspension homogène.
Chauffer lentement, en agitant fréquemment, puis
porter à ébullition jusqu'à complète dissolution.
Répartir, puis stériliser à l’autoclave à 121°C (± 1°C)
pendant 15 minutes.
Taux de reconstitution : 37 g/l
500 grammes de poudre permettent de reconstituer
13,5 litres de milieu.
REHYDRATATION DU SUPPLÉMENT
RAPID'E.coli 2
Reprendre le lyophilisat en ajoutant aseptiquement
1,1 ml d'eau distillée stérile dans l'ampoule. Agiter
jusqu'à dissolution complète du lyophilisat.
PREPARATION DU MILIEU COMPLET
(Milieu RAPID'E.coli 2 + Supplément)
A l'aide d'une pipette ou d'une seringue, ajouter
stérilement 1,0 ml de supplément réhydraté (ou
décongelé) à 100 ml de gélose stérile RAPID'E.coli 2
refroidie et maintenue à 47 ± 2°C (= milieu
complet).
NB : Il reste volontairement 0,1 ml de supplément
réhydraté dans le fond de l'ampoule.
Agiter de façon à bien homogénéiser l'ensemble.
Couler 8 à 10 ml de milieu complet par boîte de
Petri stérile (55 mm). Laisser solidifier sur une
surface fraîche et horizontale.
1 ampoule de supplément RAPID'E.coli 2
réhydraté permet de complémenter 100 ml de
milieu RAPID'E.coli 2.
PROTOCOLE
• Préparation des échantillons
A effectuer conformément à la norme du produit
concerné.
• Ensemencement et incubation
Après filtration de 100 ml d'échantillon d'eau à
analyser (ou plus selon l'origine), la membrane est
déposée à la surface de la gélose, face quadrillée
vers le haut.
Retourner les boîtes et incuber à la seule
température de 36 ± 2°C pendant 21 ± 3 h (pour
le dénombrement d'E. coli et des coliformes totaux).
LECTURE ET INTERPRETATION
• Comptage des colonies (UFC)
Après incubation, effectuer la lecture des boîtes par
le dessus de la membrane et procéder au
comptage des colonies caractéristiques :
- Coliformes (autres qu'E. coli) = GAL(+) colonies
vertes,
- E. coli = variabilité d'apparence :
• bleues foncées à violettes = GLUC(+)
• gris-bleues = GLUC(+ faible)
• possible halo violet autour des colonies.
Escherichia coli étant une espèce appartenant au
groupe des coliformes, le dénombrement des
coliformes totaux s'obtient en faisant la somme des
colonies bleu et bleu foncé à violet, et des colonies
vertes.
NB : Ne retenir que les boîtes contenant moins de
50 colonies caractéristiques et moins de 100
colonies au total.
• Expression des résultats/Calculs
Reporter le nombre d'E. coli et/ou de coliformes
totaux par unité de volume d'échantillon filtré.
LIMITES D'UTILISATION
Les matériaux de référence microbiologiques
quantitatifs certifiés (capsules, lenticules et pastilles)
sont fréquemment utilisés dans le cadre des
contrôles qualité internes ou contrôles interlaboratoires, afin de contrôler et valider les
performances culturales des milieux de culture.
Selon le mode de fabrication, certaines souches de
collection peuvent présenter des difficultés de
croissance liées au stress physiologique des
cellules, qui ne remettent cependant pas en cause
les performances de fertilité du milieu de culture
utilisé.
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RAPID’E.coli 2 Agar
pour le contrôle des eaux
Certaines souches de collection E.. coli et autres
coliformes présentées en Pastilles Bio-Référence
(Institut Pasteur, France) peuvent ainsi présenter des
rendements plus faibles (RR < 66%) sur le milieu
RAPID’E.coli 2 supplémenté. Aussi, pour garantir
l’intégrité physiologique des cellules, il est
recommandé de préparer une suspension fraîche
calibrée à partir d’une souche relancée en milieu
nutritif. L’utilisation de tout autre matériel de référence
commercialisé demeure cependant possible.
PRECAUTIONS D'EMPLOI
- Eviter d'enfermer des bulles d'air en dessous de la
membrane lors de son dépôt sur la gélose. Si
nécessaire, aplatir doucement et avec précaution la
membrane avec la pince.
- Respecter les Bonnes Pratiques de Laboratoire.
PERFORMANCES/CONTROLE QUALITE DU
TEST
Les performances culturales sont contrôlées à
l'aide des souches suivantes :
SOUCHES
Escherichia coli*
RIVM WR1**
Aeromonas
hydrophila
Résultats après 18-24
hrs d’incubation à 36°C
CROISSANCE
COULEUR
+
Violet avec
halo violet
Inhibition
NA
*
Rendement de fertilité : R = [66% - 150%]
** RIVM WR1 est équivalente à NCTC 13167
NA : Non Applicable
CONTROLE QUALITE DU FABRICANT
Tous les produits fabriqués et commercialisés par
la société Bio-Rad sont placés sous un système
d'assurance qualité de la réception des matières
premières jusqu'à la commercialisation des produits
Finis.
Chaque lot du produit fini fait l'objet d'un contrôle
de qualité et il n'est commercialisé que s'il est
conforme aux critères d'acceptation.
La documentation relative à la production et au
contrôle de chaque lot est conservée.
MOTS CLES
RAPID'E.coli 2 / Supplément / Escherichia coli /
Coliformes / Eaux / Dénombrement / Chromogène /
Bêta-D-glucuronidase / Bêta-D-galactosidase /
Filtration / Milieu.
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