illumina MiSeqDx 1.0 Manuel utilisateur

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Trousse universelle 1.0 MiSeqDx

DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT

Nº de référence DX-103-1001 : deux analyses, jusqu’à 96 échantillons par trousse

Utilisation prévue

La Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0 est un ensemble de réactifs et de consommables utilisé à la fois dans le traitement d’échantillons d’ADN génomique humain provenant de sang total périphérique et dans le séquençage ciblé ultérieur des librairies d’échantillons qui en découlent. Les réactifs spécifiques aux analytes fournis par l’utilisateur sont nécessaires pour la préparation des librairies ciblant des régions génomiques d’intérêt spécifiques. La Trousse universelle MiSeqDx 1.0 est destinée à être utilisée avec l’instrument MiSeqDx.

Principes procéduraux

La plateforme MiSeqDx d’Illumina, composée de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0 et de l’instrument MiSeqDx, est conçue pour le séquençage ciblé d’ADN génomique humain d’après des échantillons de sang total périphérique. À l’aide de réactifs contenus dans la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, l’ADN génomique est traité à travers les étapes de préparation de la librairie, qui amplifient spécifiquement les régions génomiques prévues de chaque échantillon en utilisant les oligonucléotides personnalisés conçus par l’utilisateur, tout en ajoutant les index et les séquences de saisie de Flow Cells pour les produits amplifiés. Les librairies d’échantillons obtenues sont prêtes pour le séquençage sur l’instrument MiSeqDx d’Illumina.

L’utilisation de la Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0 comporte trois principales procédures pour lesquelles tous les réactifs sont fournis à l’exception des oligonucléotides personnalisés. La première procédure est la préparation de la librairie, qui prépare manuellement les échantillons pour le séquençage. La préparation de la librairie comporte quatre

étapes clés : l’hybridation, l’extension-ligation, l’amplification par PCR et la normalisation de librairie. La deuxième procédure consiste à séquencer l’échantillon préparé à l’aide de la chimie SBS (séquençage par synthèse) sur le

MiSeqDx. La troisième procédure utilise le logiciel d’analyse pour analyser les résultats de séquençage et générer des fichiers au format Variant Call Format (VCF) contenant des appels de variants pour chaque échantillon. Les renseignements nécessaires pour configurer et analyser une analyse de séquençage, y compris une liste des échantillons et leurs séquences d’index, sont détaillés dans un fichier de feuille d’échantillons à valeurs séparées par des virgules

(*.csv).

Préparation de la librairie

• Hybridation : hybride un groupe d’oligonucléotides en amont et en aval spécifiques aux régions d’intérêt en

échantillon d’ADN génomique. À la fin de ce processus, une procédure de lavage en trois étapes avec un filtre capable de sélectionner la taille retire les oligonucléotides non liés de l’ADN génomique.

• Extension-ligation : relie les oligonucléotides en amont et en aval hybridés. Une ADN polymérase s’étend de l’oligonucléotide en amont jusqu’à la région ciblée, suivie d’une ligation à l’extrémité 5’ de l’oligonucléotide en aval en utilisant une ADN ligase. Le résultat est la formation de produits contenant des oligonucléotides spécifiques aux régions d’intérêt bordés par les séquences nécessaires pour l’amplification.

• Amplification par PCR : amplifie les produits de l’extension-ligation à l’aide des primers qui ajoutent des séquences d’index pour le multiplexage d’échantillons, tout comme les séquences de saisie de Flow Cells nécessaires à la génération d’amplifiats sur le MiSeqDx. À la fin de ce processus, une procédure de nettoyage de PCR purifie les produits PCR (désignés comme une librairie).

• Normalisation de librairie : normalise la quantité de chaque librairie pour assurer une représentation plus

égale des librairies dans la dernière librairie regroupée. À la fin de ce processus, la librairie regroupée est chargée dans le MiSeqDx pour le séquençage à l’aide de la chimie SBS.

Février 2015

Référence 15039608, rév. B FRA

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Séquençage

La chimie SBS utilise une méthode basée sur des terminateurs réversibles pour détecter les bases à simple nucléotide à mesure qu’elles sont intégrées aux brins d’ADN croissants. Pendant chaque cycle de séquençage, un seul triphosphate de déoxynucléotide (dNTP) marqué par fluorescence est ajouté à la chaîne d’acide nucléique. Le marquage du nucléotide sert de terminateur pour la polymérisation. Ainsi, après chaque incorporation de dNTP, le marqueur fluorescent est imagé pour identifier la base, puis enzymatiquement clivée pour permettre l’incorporation du nucléotide suivant. Étant donné que les quatre dNTP liés à des terminateurs réversibles (A, G, T, C) sont tous présents comme molécules seules et séparées, la compétition naturelle minimise le biais lié à l’incorporation. Les définitions des bases sont effectuées directement à partir des mesures d’intensité de signal pendant chaque cycle de séquençage. Le résultat final est le séquençage base par base.

Analyse

Le logiciel intégré Real-Time Analysis (RTA) exécute les analyses d’images et la définition des bases, et affecte également un score de qualité à chacune des bases de chaque cycle de séquençage. Une fois l’analyse primaire terminée, le logiciel

MiSeq Reporter sur l’instrument MiSeqDx lance une analyse secondaire. MiSeq Reporter traite les définitions de base générées pendant l’analyse primaire et fournit des renseignements sur chaque échantillon en fonction des renseignements indiqués dans la feuille d’échantillons. L’analyse secondaire comprend le démultiplexage, la génération de fichier

FASTQ, l’alignement, la définition de variant et la génération des fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants trouvés dans des positions spécifiques d’un génome de référence.

Limites de la procédure

1 Destiné au diagnostic in vitro.

2 Ce produit présente les limites suivantes :

— Sortie de séquençage > 1 Go

— Lectures > 3 millions

— Longueur de lecture (en analyse à lecture appariée) 2 × 150 bp

— Bases supérieures à Q30 > 75 % (plus de 75 % des bases ont un score de qualité Phred supérieur à 30, indiquant une précision de définition des bases supérieure à 99,9 %)

3 Le système a été validé pour la détection des SNV et des délétions de trois bases maximum. L’évaluation des insertions d’une base a été limitée à trois insertions différentes sur trois chromosomes distincts.

4 Le système rencontre des problèmes de détection des insertions ou délétions d’une base dans les tronçons homopolymères (p. ex. le polyA).

5 Toutes les insertions/délétions sont alignées à gauche dans les régions homopolymériques ou alignées à droite suivant la nomenclature HGVS. Par exemple, le variant c.313delA (avec le contexte de séquence GAATC) est identifié comme une délétion G-ATC, mais la délétion est signalée dans dbSNP en tant que délétion GA-TC.

6 Le test ne peut pas détecter les insertions et les délétions si celles-ci se produisent à un emplacement directement adjacent à un primer et s’il n’y a pas d’amplicon de chevauchement. Pour les régions contenant des amplicons de chevauchement, le test ne peut pas détecter des délétions lorsque la zone de chevauchement est plus petite que la délétion à détecter. Par exemple, si la zone de chevauchement entre deux amplicons adjacents est de deux bases, le test ne peut détecter aucune délétion incluant ces deux bases. Une délétion de base unique au niveau de ces bases peut être détectée.

7 Pour les variants complexes où une délétion et une insertion se produisent sur le même site, le test peut rapporter cela comme deux variants à proximité immédiate l’un de l’autre. La mise en phase des variants n’est pas évaluée et il est impératif d’envisager d’autres solutions possibles pour la séquence détectée. Consultez le

Tableau 1

pour voir un exemple de variant complexe de cette nature.

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Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Tableau 1 Exemple de variant complexe

Contexte de la séquence (référence)

GAA GAA ATT

Séquence observée pour le variant

GAA T – – ATT

Variant attendu

Variant(s) rapporté(s) par le test

Délétion de GAA, insertion de T (les deux changements sur le même chromosome)

SNP (G>T); Délétion de AA

8 Le système MiSeqDx est conçu pour offrir des résultats qualitatifs (c.-à-d. de génotype).

9 Comme avec n’importe quel flux de travail à base d’hybridation, les polymorphismes, mutations, insertions ou délétions sous-jacents dans les régions de liaison d’un oligonucléotide peuvent affecter les allèles sondés et, par conséquent, les appels faits.

10 La couverture minimale recommandée par amplicon nécessaire pour un appel de variants précis (Q(max_gt | poly_site) >= 100) est de 75 ×.

Composants du produit

Le Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0 comprend les composants suivants :

• Trousse universelle MiSeqDx 1.0 (nº de référence DX-103-1001)

Réactifs

Réactifs fournis

La Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0 a été configurée pour deux analyses avec un maximum de 48 échantillons par analyse (jusqu’à 96 échantillons au total). Consultez les tableaux ci-dessous pour une liste complète des réactifs fournis dans cette trousse.

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 1

Tableau 2 Boîte 1A : réactifs de pré-amplification

Composant Quantité

Volume de remplissage

Ingrédients actifs

Tampon d’hybridation 1 tube

4,32 ml

Solution aqueuse tamponnée contenant des sels et du formamide

Mélange extension-ligation

Primers d’index A (A501) - H

(A508)

Primers d’index 1 (A701) - 12

(A712)

Polymérase PCR

1 tube

1 tube par primer

1 tube

4,8 ml

192 µl

128 µl

56 µl

Solution aqueuse tamponnée contenant un mélange exclusif d’ADN polymérases, de ligase ADN et des dNTP

Primers PCR avec des séquences d’indexage et des adaptateurs de séquençage

ADN polymérase exclusive

Mélange maître PCR 1 tube

2,8 ml

Solution aqueuse tamponnée contenant des sels et des dNTP

Stockage

-25 à -15 °C

Tableau 3 Boîte 1B : réactifs de post-amplification

Composant Quantité

Volume de remplissage

Ingrédients actifs

1 tube

4,6 ml

Diluant de normalisation de librairie

Tampon de dilution de librairie

Contrôle interne PhiX

1 tube

4,5 ml

10 µl

Solution aqueuse tamponnée contenant des sels, du 2-mercaptoéthanol et du formamide

Solution aqueuse tamponnée

Solution aqueuse tamponnée contenant l’ADN génomique PhiX

Stockage

-25 à -15 °C

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 2

Tableau 4 Boîte 2 : réactifs de post-amplification

Composant Quantité Contenu

Cartouche de réactifs MiSeqDx 2 cartouches Cartouche à usage unique contenant des réactifs pour la génération d’amplifiats et le séquençage à utiliser avec le MiSeqDx, comprenant du formamide, du 2-mercaptoéthanol et < 2 % de DMSO

Stockage

-25 à -15 °C

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 3

Tableau 5 Boîte 3A : réactifs de pré-amplification

Composant Quantité

Volume de remplissage

Ingrédients actifs

Tampon de lavage rigoureux 1 flacon

24 ml

Tampon de lavage universel 1 tube

4,8 ml

Solution aqueuse tamponnée contenant des sels, du 2-mercaptoéthanol et du formamide

Solution aqueuse tamponnée contenant des sels

Stockage

2 à 8 °C

Tableau 6 Boîte 3B : réactifs de post-amplification

Composant Quantité

Volume de remplissage

Ingrédients actifs

Billes de nettoyage PCR

Lavage de normalisation de librairie

Billes de librairie

Flow Cell MiSeqDx

1 tube

2 tubes

5 ml

4,8 ml

Solution aqueuse tamponnée contenant des billes paramagnétiques en phase solide et du polyéthylène glycol

Solution aqueuse tamponnée contenant des sels, du 2-mercaptoéthanol et du formamide

1 tube

1,2 ml

Solution aqueuse tamponnée contenant des billes paramagnétiques en phase solide

2 conteneurs 1 Flow Cell Substrat en verre avec des oligonucléotides liés par covalence

Stockage

2 à 8 °C

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 4

Tableau 7 Boîte 4 : réactifs de post-amplification

Volume de

Composant Quantité remplissage

Solution SBS (PR2)

MiSeqDx

2 flacons

353,1 ml

Ingrédients actifs

Solution aqueuse tamponnée

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 5

Tableau 8 Boîte 5 : réactifs de pré-amplification

Composant Quantité

Volume de remplissage

Ingrédients actifs

Plaque filtrante 2 plaques

S.O.

Plaque de microtitration en polypropylène avec une membrane en polyéthersulfone modifiée

Tableau 9 Boîte 5 : réactifs de post-amplification

Composant Quantité

Volume de remplissage

Tampon d’élution 1 tube

4,8 ml

Tampon de stockage de librairie

1 tube

3,5 ml

Ingrédients actifs

Solution aqueuse tamponnée

Stockage

2 à 8 °C

Stockage

15 à 30 °C

Stockage

15 à 30 °C

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Réactifs nécessaires, non fournis

Pool d’oligos personnalisé

Les oligonucléotides spécifiques au primer sont conçus pour être développés par l’utilisateur et ne sont pas inclus dans la trousse de préparation de la librairie. La

Figure 1

illustre le principe de conception de l’oligo personnalisé. La conception de l’oligo doit respecter les exigences suivantes :

• Une paire d’oligonucléotides personnalisés doit être conçue pour chaque amplicon : une sonde personnalisée 1

(oligonucléotide spécifique aux loci en amont [ULSO]) et une sonde personnalisée 2 (oligonucléotide spécifique aux loci en aval [DLSO]).

• Les oligos personnalisés doivent entourer la région d’intérêt. Celle-ci peut comporter entre 150 et 250 bp pour permettre un séquençage complet du fragment à l’aide de la trousse 2 × 150.

• Les deux oligonucléotides doivent s’hybrider avec le même brin d’ADN.

• Les oligos personnalisés doivent contenir les adaptateurs propres à Illumina pour permettre l’ajout d’index ainsi que des adaptateurs de séquençage par PCR.

— L’adaptateur 1 (5’- CAACGATCGTCGAAATTCGC-3’) doit être situé à l’extrémité 5’ de la sonde personnalisée 1 (ULSO).

— L’adaptateur 2 (5’- AGATCGGAAGAGCGTCGTGTA-3’) doit être situé à l’extrémité 3’ de la sonde personnalisée 2 (ULSO).

• La sonde personnalisée 2 (DLSO) est phosphorylée à l’extrémité 5’ pour prendre en charge l’étape de ligation après l’extension de la sonde personnalisée 1 (ULSO).

Figure 1 Conception de l’oligo pour la Trousse universelle MiSeqDx 1.0

• Les paramètres de conception de l’oligo suivants sont recommandés :

— Longueur de la sonde comprise entre 22 et 30 nucléotides (région spécifique aux gènes).

— Taille totale de l’amplicon comprise entre 190 et 290 paires de bases, adaptateurs compris.

— La teneur en GC recommandée du primer doit être comprise entre 25 et 70 %.

— Plage de fusion recommandée entre 55 et 70 °C.

— La concentration du primer doit être de 15 nM par oligo dans le pool personnalisé.

— Aucune purification supplémentaire de l’oligo n’est nécessaire à l’issue de la synthèse. Un dessalage est recommandé.

— Les oligos peuvent être dilués dans le tampon TE.

— Le nombre d’amplicons par échantillon doit être compris entre 16 et 384.

— Concevez les primers de manière à laisser des bases supplémentaires entre l’extrémité du primer et la région d’intérêt, pour permettre la détection des insertions et des délétions aux extrémités des régions d’intérêt (voir l’élément

des

Limites de la procédure à la page 2 ).

— Si la totalité d’une région d’intérêt doit être recouverte de plaques, la région de chevauchement de la région cible située entre les sites de liaison pour les sondes adjacentes doit être de 1 pb plus grande que la taille de la délétion à détecter. Par exemple, pour permettre la détection de délétions de 3 pb, la région de chevauchement entre les sondes adjacentes doit être > 4 bp. Les sondes adjacentes doivent être conçues de sorte à alterner les brins afin d’éviter les interférences.

— La couverture minimale recommandée par amplicon requise pour un appel de variants est de 75×.

Le nombre d’échantillons par analyse doit être calculé en fonction de la couverture minimale recommandée. Il dépendra de l’uniformité de la couverture du pool d’oligos personnalisé.

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Un fichier de manifeste doit être créé pour chaque pool d’oligos personnalisé. Le manifeste est un fichier texte contenant des renseignements sur des régions génomiques ciblées. MiSeq Reporter en a besoin pour réaliser l’analyse. Consultez le site Web d’Illumina pour télécharger un modèle de fichier de manifeste.

Réactifs de pré-amplification

• 10 N NaOH (préparez à partir de comprimés ou utilisez une solution standard)

• Tampon TE

• Eau sans DNase/RNase

Réactifs de post-amplification

• 10 N NaOH (préparez à partir de comprimés ou utilisez une solution standard)

• Éthanol 200 pour la biologie moléculaire

• Tampon TE

• Eau sans DNase/RNase

Stockage et manipulation

1 La température ambiante correspond à une température de 15 °C à 30 °C.

2 Les réactifs suivants sont expédiés congelés et sont stables lorsqu’ils sont stockés entre -25 °C et -15 °C jusqu’à la date de péremption indiquée.

— Tampon d’hybridation

— Mélange extension-ligation

— Primers d’index A (A501) - H (A508)

— Primers d’index 1 (A701) - 12 (A712)

— Polymérase PCR

— Mélange maître PCR

— Diluant de normalisation de librairie

— Tampon de dilution de librairie

— Contrôle interne PhiX

— Cartouche de réactifs MiSeqDx

Excepté pour la cartouche de réactifs, les réactifs sont stables pendant un maximum de six cycles de congélation/décongélation ayant lieu avant la date de péremption indiquée.

Ne recongelez pas la cartouche de réactifs après qu’elle a été décongelée. Elle peut être conservée pendant un maximum de six heures entre 2 °C et 8 °C.

3 Les réactifs suivants sont expédiés réfrigérés et sont stables lorsqu’ils sont stockés entre 2 °C et 8 °C jusqu’à la date de péremption indiquée.

— Tampon de lavage rigoureux

— Tampon de lavage universel

— Billes de nettoyage PCR

— Billes de librairie

— Lavage de normalisation de librairie

— Solution SBS (PR2) MiSeqDx

— Flow Cell MiSeqDx

4 Les réactifs suivants sont expédiés à température ambiante et sont stables lorsqu’ils sont stockés à température ambiante jusqu’à la date de péremption indiquée.

— Tampon d’élution

— Plaque filtrante

— Tampon de stockage de librairie

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5 Les changements dans l’apparence physique des réactifs fournis peuvent indiquer la détérioration des matières.

Si des changements dans l’apparence physique se produisent (p. ex. des changements apparents de la couleur des réactifs ou une trace de voile apparente montrant une contamination microbienne), n’utilisez pas les réactifs.

6 Les réactifs du Tampon d’hybridation, du Tampon de lavage rigoureux et du Diluant de normalisation de librairie peuvent former des précipités ou des cristaux visibles. Avant l’utilisation, secouez vigoureusement à l’aide d’un agitateur vortex, puis inspectez visuellement pour vous assurer qu’il n’y ait aucun précipité.

7 Suivez à la lettre les meilleures pratiques suivantes lors de la manipulation des Billes de nettoyage PCR et des

Billes de librairie :

— Les billes ne doivent jamais être congelées.

— Laissez les billes atteindre la température ambiante.

— Immédiatement avant l’utilisation, mélangez vigoureusement à l’aide d’un agitateur vortex jusqu’à obtenir une suspension adéquate et que la couleur apparaisse homogène.

— Mélangez bien l’échantillon une fois les billes ajoutées en pipettant de haut en bas 10 fois. Un agitateur peut être utilisé pour bien mélanger les échantillons.

— Incubez le mélange bille/échantillon à température ambiante pendant la durée totale indiquée.

— Suivez les instructions lorsque vous utilisez un support magnétique. Attendez que la solution soit claire avant d’aspirer. Gardez la plaque sur le support magnétique lorsque vous aspirez doucement le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger les billes séparées.

8 La plaque d’amplification par PCR peut rester sur le thermocycleur toute la nuit, ou bien elle peut être conservée entre 2 °C et 8 °C pendant un maximum de deux jours. Avant le stockage de la plaque entre 2 °C et

8 °C, scellez-la bien.

9 Ne congelez pas les Billes de librairie ou ne les mélangez pas au réactif du Diluant de normalisation de librairie si elles ne sont pas utilisées immédiatement.

10 La plaque de normalisation de librairie terminée peut être conservée entre -25 °C et -15 °C pendant un maximum de trois jours.

11 La librairie d’amplicons regroupés peut être conservée entre -25 °C et -15 °C pendant un maximum de trois jours.

12 Chargez immédiatement le groupe d’amplicons fraîchement dilués dans la cartouche de réactifs. Le stockage du groupe d’amplicons dilués peut entraîner une réduction considérable de la densité des amplifiats.

Équipement et matériel

Équipement et matériels fournis, vendus séparément

1 Instrument MiSeqDx, nº de référence DX-410-1001

2 Trousse de montage de plaque d’index TruSeq, nº de référence FC-130-1005

3 Trousse de montage de plaque d’index TruSeq et de collier, nº de référence FC-130-1007

4 Bouchons de rechange pour l’adaptateur d’index, nº de référence DX-502-1003

Équipement et matériel nécessaires, non fournis

Équipement et matériel de pré-amplification

1 Bloc chauffant : un bloc chauffant pour une plaque à 96 puits est nécessaire. Le bloc chauffant doit être conforme aux spécifications de performance suivantes : vous pouvez utiliser des blocs chauffants avec couvercles chauffés.

— Plage de températures : ambiante +5 °C à 99 °C

— Régulation de température : ±0,1 °C à 37 °C; ±0,4 °C à 60 °C

2 Incubateur d’échantillons : un incubateur (four à hybridation) est nécessaire. L’incubateur doit être conforme aux spécifications de performance suivantes :

— Plage de températures : 10 °C à 100 °C

— Régulation de température : ±0,2 °C

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3 Centrifugeuse de table : une centrifugeuse de table pouvant maintenir une température de 20 °C est nécessaire.

(une centrifugeuse séparée est nécessaire dans la zone de post-amplification). Vous pouvez utiliser n’importe quelle centrifugeuse pour plaques atteignant les vitesses indiquées par le protocole (280 à 2 400 × g).

4 Pipettes de précision : un ensemble de pipettes de précision est nécessaire. (Un ensemble séparé est nécessaire dans la zone de post-amplification). L’utilisation de pipettes de précision est nécessaire pour s’assurer d’une distribution précise des réactifs et des échantillons. Les pipettes monocanal ou multicanaux peuvent être utilisées si elles sont étalonnées régulièrement et sont précises à moins de 5 % du volume indiqué.

5 Consommables : les consommables suivants sont nécessaires.

— Plaques PCR à jupe à 96 puits, 0,2 ml, en polypropylène ou équivalent

— Plaques de stockage à 96 puits, 0,8 ml (plaques MIDI)

— Bassin de solution, sans PVC ni ADNase/ARNase (cuve)

— Opercule adhésif en aluminium

— Joint de plaque PCR approprié

— Pointes de pipette résistantes à l’aérosol

Équipement et matériel de post-amplification

1 Thermocycleur : un thermocycleur est nécessaire. Le thermocycleur doit avoir un couvercle chauffé et respecter les spécifications de performance suivantes :

— Plage de contrôle de la température : 4 °C à 99 °C

— Précision du contrôle : ±0,25 °C de 35 °C à 99 °C

2 Agitateur pour microplaques : un agitateur pour microplaques est nécessaire dans la zone du laboratoire de post-amplification. L’agitateur pour microplaques doit être conforme aux spécifications de performance suivantes :

— Vitesse de mélange maxi. : 3 000 tr/min

— Plage de vitesses de mélange : 200 à 3 000 tr/min

3 Centrifugeuse de table : une centrifugeuse de table pouvant maintenir une température de 20 °C est nécessaire.

(Une centrifugeuse séparée est nécessaire dans la zone de pré-amplification.) Vous pouvez utiliser n’importe quelle centrifugeuse pour plaques atteignant les vitesses indiquées par le protocole (280 à 2 400 × g).

4 Bloc chauffant : un bloc chauffant pour les tubes est nécessaire. Le bloc chauffant doit être conforme aux spécifications de performance suivantes :

— Plage de températures : ambiante +5 °C à 99 °C

— Régulation de température : ±0,1 °C à 37 °C; ±0,4 °C à 60 °C

5 Support magnétique : un support magnétique pour une plaque à 96 puits est nécessaire. Les meilleures performances sont atteintes lorsque les aimants sont du côté du support et non au fond.

6 Pipettes de précision : un ensemble de pipettes de précision est nécessaire. (Un ensemble séparé est nécessaire dans la zone de pré-amplification). L’utilisation de pipettes de précision est nécessaire pour s’assurer d’une distribution précise des réactifs et des échantillons. Les pipettes monocanal ou multicanaux peuvent être utilisées si elles sont étalonnées régulièrement et sont précises à moins de 5 % du volume indiqué.

7 Consommables : les consommables suivants sont nécessaires.

— Plaques PCR à jupe à 96 puits, 0,2 ml, en polypropylène ou équivalent

— Plaques de stockage à 96 puits, 0,8 ml (plaques MIDI)

REMARQUE

Assurez-vous que la plaque à 96 puits s’adapte parfaitement au support magnétique.

— Tubes coniques, 15 ml

— Tubes de microcentrifugeuse Eppendorf (bouchon vissé recommandé)

— Barrettes de huit tubes PCR

— Bassins de solution, sans PVC ni ADNase/ARNase (cuve)

— Opercules adhésifs en aluminium

— Joints de plaque adhésifs

— Pointes de pipette résistantes à l’aérosol

Référence 15039608, rév. B FRA

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Prélèvement, transport et stockage des échantillons

REMARQUE

Manipulez tous les échantillons comme s’ils étaient des agents potentiellement infectieux.

1 Les échantillons de sang total recueillis dans les tubes K

EDTA doivent être utilisés.

2 Les échantillons de sang total peuvent être stockés pendant un maximum de sept jours à température ambiante, jusqu’à 30 jours entre 2 et 8 °C, ou jusqu’à 30 jours s’ils sont congelés entre -15 et -25 °C.

3 Transportez le sang total pendant un maximum de sept jours à température ambiante, 30 jours entre 2 et 8 °C, ou 30 jours si congelé entre -15 et -25 °C. Le transport de sang total doit se conformer aux règlements nationaux, fédéraux, régionaux et locaux sur le transport d’agents étiologiques.

4 Aucun effet négatif sur la performance de la trousse n’a été observé lorsque le sang total a été soumis à six cycles de congélation/décongélation.

5 Aucun effet négatif sur la performance de la trousse n’a été observé sur les échantillons de sang total contenant de la bilirubine, du cholestérol, de l’hémoglobine, des triglycérides ou de l’EDTA.

Avertissements et précautions

ATTENTION

La loi fédérale américaine n’autorise la vente de ce dispositif que sur ordonnance ou par un médecin ou tout autre professionnel de la santé autorisé par la législation de l’État dans lequel il ou elle exerce à utiliser ou ordonner l’utilisation de cet appareil.

1 Certains composants de cette trousse contiennent du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. (Pour plus de renseignements, consultez la section

Réactifs à la page 3

Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

2 Certains composants de cette trousse contiennent du 2-mercaptoéthanol, un agent réducteur. (Pour plus de renseignements, consultez la section

Réactifs à la page 3

.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Utilisez ces composants dans une zone bien aérée et mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina.

3 Manipulez tous les échantillons comme s’ils étaient des agents potentiellement infectieux.

4 Le non-respect des procédures comme décrites peut entraîner des résultats erronés ou une baisse considérable de la qualité des échantillons.

5 Utilisez les précautions de routine en laboratoire. Ne pipettez pas avec la bouche. Ne mangez pas, ne buvez pas et ne fumez pas dans les zones de travail indiquées. Portez des gants jetables et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des échantillons et des réactifs de la trousse. Lavez-vous les mains soigneusement après avoir manipulé les échantillons et les réactifs de la trousse.

6 N’utilisez pas un composant de la trousse au-delà de la date de péremption indiquée sur l’étiquette du carton de la trousse. N’interchangez pas les composants de la trousse venant de lots de trousse différents. Notez que les lots de trousse sont indiqués sur l’étiquette du carton de la trousse.

7 Conservez les composants de la trousse à la température spécifiée dans les zones de préamplification et postamplification indiquées.

8 Des cycles de congélation/décongélation répétés (jusqu’à six) des composants de la Boîte 1 ne compromettront pas l’intégrité de la trousse.

9 Pour empêcher la dégradation des échantillons ou des réactifs, veillez à ce que toutes les vapeurs d’hypochlorite de sodium se dissipent avant de commencer le protocole.

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10 Les pratiques de laboratoire appropriées et la bonne hygiène du laboratoire sont nécessaires pour empêcher les produits PCR de contaminer les réactifs, les instruments et les échantillons d’ADN génomique. La contamination par des produits PCR peut causer des résultats erronés et non fiables.

11 Pour éviter la contamination, veillez à ce que les zones de préamplification et de post-amplification possèdent un équipement réservé (p. ex. pipettes, pointes de pipette, agitateur vortex et centrifugeuse).

12 Évitez la contamination croisée. Utilisez des nouvelles pointes de pipette entre les échantillons et entre les réactifs distribués. Mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette et centrifugez la plaque lorsque cela est indiqué. N’agitez pas les plaques. L’utilisation des pointes résistantes à l’aérosol réduit le risque de rétention d’amplicons et de contamination croisée d’un échantillon à l’autre.

13 Une paire index-échantillon doit correspondre exactement à la feuille d’échantillons. Les inadéquations entre la feuille d’échantillons et le schéma de la plaque entraîneront une perte de l’identification positive des

échantillons et un rapport de résultats incorrect.

14 Préparez toujours une nouvelle solution d’éthanol à 80 % pour les étapes de lavage. L’éthanol peut absorber l’eau présente dans l’air, ce qui affecte les résultats.

15 Veillez à ce que tout l’éthanol soit retiré du bas des puits pendant les étapes de lavage. Des résidus d’éthanol pourraient affecter les résultats.

16 Respectez le temps de séchage indiqué après l’étape du support magnétique pour assurer une évaporation totale. L’éthanol résiduel peut modifier les performances des réactions ultérieures.

17 Ne mélangez pas le pool d’oligos personnalisé et le Tampon d’hybridation lors du stockage. Lorsque combiné, le pool d’oligos personnalisé devient instable, même lorsqu’il est conservé congelé.

18 L’utilisation des thermocycleurs à refroidissement actif (p. ex, le refroidissement thermoélectrique, Peltier) n’est pas recommandée pour l’étape d’hybridation. L’étape de refroidissement passif est essentielle pour une hybridation adéquate.

19 Ajoutez toujours le Polymérase PCR au Mélange maître PCR juste avant l’utilisation. Ne conservez jamais la solution de travail combinée.

20 Durant l’étape de normalisation de la librairie, il est extrêmement important de resuspendre complètement le culot des billes de la librairie. Cette étape est essentielle pour obtenir une densité consistante des amplifiats sur la Flow Cell MiSeqDx.

21 Respectez les temps d’incubation indiqués dans l’étape de normalisation de la librairie. Une incubation inappropriée peut affecter la représentation de la librairie et la densité des amplifiats.

22 En raison du nombre de transferts de plaque et du risque subséquent de contamination, faites preuve d’extrême prudence pour vous assurer que le contenu du puits reste entièrement dans le puits. N’éclaboussez pas le contenu.

23 La recommandation en matière d’entrée d’ADN de 250 ng permet la variation de quantité d’ADN; la performance de la trousse dépend de ce niveau d’entrée.

Notes procédurales

1 Illumina exige qu’un échantillon d’ADN à contrôle positif et un à contrôle négatif (NTC ou contrôle sans modèle) soient inclus dans chaque analyse qui est définie comme une série d’échantillons traités en parallèle.

L’échantillon d’ADN de contrôle positif doit être un échantillon bien caractérisé avec une variation connue dans la région d’intérêt.

2 Avant de commencer le protocole de la Trousse universelle MiSeqDx 1.0, extrayez et quantifiez l’ADN.

3 Toute méthode d’extraction d’ADN validée peut être utilisée.

4 Quantifiez l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Vérifiez que le A260/A280 de l’échantillon d’ADN est > 1,5.

Normalisez l’échantillon d’ADN sur 50 ng/µl. Chaque échantillon nécessite 5 µl d’ADN génomique (250 ng au total).

Débit d’échantillons et représentation d’index

Pour la Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1.0, le débit d’échantillons par analyse MiSeqDx peut être de 8 à

48 échantillons. Les primers d’indexage utilisés pendant l’amplification par PCR doivent être choisis en fonction du débit d’échantillons final souhaité pour assurer la diversité dans la séquence d’indexage.

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REMARQUE

Pour une efficacité maximale du débit, procédez à la préparation de la librairie pour 96 échantillons au plus, puis répartissez les échantillons en deux analyses de séquençage avec un maximum de 48 échantillons par analyse. Créez des feuilles d’échantillons distinctes pour chaque ensemble de 48 échantillons, car le MiSeqDx ne peut séquencer que

48 échantillons à la fois.

MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour séquencer des bases G/T et un voyant DEL rouge pour séquencer des bases

A/C. À chaque cycle, au moins un des deux nucléotides de chaque canal de couleur doit être lu pour assurer l’enregistrement approprié. Il est important de maintenir l’équilibrage des couleurs pour chaque base de la lecture d’index en cours de séquençage, sinon un échec de l’enregistrement pourrait se produire lors du séquençage de la lecture d’index.

Consultez le

Tableau 10

pour choisir des combinaisons de primers d’index pour des analyses de 48 ou 96 échantillons.

Tableau 10 Combinaisons de primers d’index pour des analyses de séquençage avec 48 ou 96 échantillons

Rangées A à H Colonnes 1 à 6 Colonnes 7 à 12

Primer d’index A (A501)

Primer d’index B (A502)

Primer d’index C (A503)

Primer d’index D (A504)

Primer d’index E (A505)

Primer d’index F (A506)

Primer d’index G (A507)

Primer d’index H (A508)

Primer d’index 1 (A701)

Primer d’index 2 (A702)

Primer d’index 3 (A703)

Primer d’index 4 (A704)

Primer d’index 5 (A705)

Primer d’index 10 (A710)

Primer d’index 6 (A706)

Primer d’index 7 (A707)

Primer d’index 8 (A708)

Primer d’index 9 (A709)

Primer d’index 11 (A711)

Primer d’index 12 (A712)

Si le séquençage est inférieur à 48 échantillons dans une analyse de séquençage, sélectionnez les index appropriés sur la base de leurs séquences pour maintenir l’équilibrage des couleurs dans les canaux verts et rouges. Consultez le

Tableau 12

et le

Tableau 13

. Au minimum, les analyses avec 8 à 48 échantillons doivent comprendre des combinaisons de primers d’indexage identifiées dans

Tableau 11

Pour effectuer avec précision des analyses plus petites, au moins huit échantillons doivent être présents. Si six échantillons uniques (à l’exclusion des contrôles positifs et négatifs) ne sont pas disponibles, il convient d’effectuer l’analyse avec les réplicats d’échantillon ou n’importe quel échantillon d’ADN génomique humain. Consultez le

Tableau 11

pour connaître le jeu d’index d’équilibrage des couleurs minimal à utiliser pour les analyses de séquençage

à huit échantillons.

Tableau 11 Combinaisons de primers d’index pour des analyses de séquençage avec huit échantillons

Primer d’index 1 (A701) Primer d’index 2 (A702) Primer d’index 10 (A710)

Primer d’index C (A503)

Primer d’index D (A504)

Primer d’index E (A505)

Échantillon 1

Échantillon 4

Échantillon 7

Échantillon 2

Échantillon 5

Échantillon 8

Échantillon 3

Échantillon 6

Séquences de primers d’index

Tableau 12 Séquences de Primers d’index A (A501) - H (A508)

Primer d’indexage Séquence

Primer d’index A (A501)

Primer d’index B (A502)

Primer d’index C (A503)

Primer d’index D (A504)

TGAACCTT

TGCTAAGT

TGTTCTCT

TAAGACAC

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Primer d’indexage

Primer d’index E (A505)

Primer d’index F (A506)

Primer d’index G (A507)

Primer d’index H (A508)

Séquence

CTAATCGA

CTAGAACA

TAAGTTCC

TAGACCTA

Tableau 13 Séquences de Primers d’index 1 (A701) - 12 (A712)

Primer d’indexage Séquence

Primer d’index 1 (A701)

Primer d’index 2 (A702)

Primer d’index 3 (A703)

Primer d’index 4 (A704)

Primer d’index 5 (A705)

Primer d’index 6 (A706)

Primer d’index 7 (A707)

Primer d’index 8 (A708)

Primer d’index 9 (A709)

Primer d’index 10 (A710)

Primer d’index 11 (A711)

Primer d’index 12 (A712)

ATCACGAC

ACAGTGGT

CAGATCCA

ACAAACGG

ACCCAGCA

AACCCCTC

CCCAACCT

CACCACAC

GAAACCCA

TGTGACCA

AGGGTCAA

AGGAGTGG

Mode d’emploi

Préparation de la feuille d’échantillons MiSeqDx

1 Dans l’écran d’accueil de Illumina Worklist Manager, sélectionnez Create Worklist (Créer la liste de travail).

2 Dans le champ Test Type (Type de test), sélectionnez MiSeqDx universel.

3 Dans le champ Worklist Name (Nom de la liste de travail), saisissez un nom pour la feuille d’échantillons.

— Si l’identifiant du code à barres de la cartouche de réactifs alphanumérique est utilisé pour le nom de la feuille d’échantillons, le MiSeq Operating Software trouve automatiquement la feuille d’échantillons.

— Si vous utilisez un autre nom pour la feuille d’échantillons, le bouton Browse (Parcourir) situé dans le

MiSeq Operating Software peut être utilisé afin de trouver la feuille d’échantillons appropriée.

4 [Facultatif] Entrez une description pour identifier l’analyse.

5 Assurez-vous que la date correspond à la date de début de l’analyse.

6 Sélectionnez Next (Suivant).

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Entrer des renseignements sur l’échantillon

1 Dans l’onglet Table (Tableau) ou l’onglet Plate (Plaque), saisissez les renseignements suivants pour chaque puits contenant un échantillon : a Identifiant de l’échantillon : saisissez un seul identifiant d’échantillon.

b Index 1 et Index 2 : spécifiez l’adaptateur d’index qui sera utilisé pour chaque lecture d’index.

c Manifest (Manifeste) : précisez le nom du fichier de manifeste qui contient les renseignements sur les

échantillons dans ce puits en particulier.

Pour plus de renseignements sur le fichier de manifeste, consultez la section

Pool d’oligos personnalisé à la page 5

2 [Facultatif] Pour enregistrer des renseignements plus détaillés sur les échantillons, saisissez un nom et une description.

3 [Facultatif] Pour identifier les contrôles sur la plaque, sélectionnez Negative (Négatif) ou Positive (Positif) dans le menu déroulant Control (Contrôle).

4 Accédez à l’onglet Plate Graphic (Graphique de la plaque) et utilisez les options Copy to Clipboard (Copier vers le bloc-notes) ou Print (Imprimer) pour capturer une image de la plaque d’échantillon.

5 Sélectionnez Finish (Terminer).

Hybridation du pool d’oligonucléotides

Préparation

1 Ramenez le pool d’oligos personnalisé, le Tampon d’hybridation, les échantillons d’ADN génomique et l’échantillon de contrôle positif à température ambiante.

2 Mélangez vigoureusement le pool d’oligos personnalisé et le Tampon d’hybridation pour vous assurer que tous les précipités ont été complètement dissous, puis centrifugez brièvement les tubes pour recueillir le liquide.

3 Réglez un bloc chauffant de 96 puits à 95 °C.

4 Préchauffez un incubateur à 37 °C.

5 Créez la plaque d’échantillon en fonction du graphique de la plaque imprimé à partir de Illumina Worklist

Manager.

Procédure

1 Préparez une nouvelle plaque PCR de 96 puits (ci-après dénommée la plaque HYB).

2 Ajoutez 5 µl d’échantillon ou de contrôle à 50 ng/µl (250 ng total) dans les puits appropriés dans la plaque

HYB. Suivez la disposition de la plaque générée pour une sélection appropriée des puits.

3 Ajoutez 5 µl de pool d’oligos personnalisé à tous les puits contenant l’ADN génomique.

4 Ajoutez 40 µl de Tampon d’hybridation à chaque échantillon dans la plaque HYB. Pipettez doucement vers le haut et le bas 3 à 5 fois pour mélanger.

5 Scellez la plaque HYB et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.

6 Placez la plaque HYB dans le bloc préchauffé à 95 °C et incubez pendant 1 minute.

7 Réduisez le bloc chauffant à 40 °C et continuez à incuber jusqu’à ce que le bloc chauffant atteigne 40 °C

(environ 80 minutes).

Le refroidissement progressif est très important pour une bonne hybridation; par conséquent, les thermocycleurs PCR avec refroidissement actif (p. ex. Peltier avec refroidissement thermoélectrique) ne sont pas recommandés pour ce processus.

POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ

Après que le bloc chauffant a atteint 40 °C, la plaque HYB est stable lorsqu’elle est maintenue à 40 °C pendant

2 heures.

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Retrait des oligonucléotides non liés

Préparation

1 Ramenez le Mélange extension-ligation, le Tampon de lavage rigoureux et le Tampon de lavage universel à température ambiante, puis mélangez brièvement.

2 Assemblez l’unité d’assemblage de la plaque filtrante (ci-après désignée comme FPU) en ordre de haut en bas : couvercle, plaque filtrante, collier d’adaptateur et plaque MIDI.

3 Lavez au préalable la membrane de la plaque filtrante comme suit : a Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage rigoureux à chaque puits.

b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes.

Procédure

1 Retirez la plaque HYB du bloc chauffant et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.

2 Transférez le volume total (environ 55 µl) de chaque échantillon aux puits correspondants de la plaque filtrante.

3 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes.

4 Lavez la plaque filtrante comme suit : a Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage rigoureux à chaque puits d’échantillon.

b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes.

5 Répétez le lavage comme décrit à l’étape précédente.

REMARQUE

Si le tampon de lavage n’est pas complètement évacué, centrifugez encore à 2 400 × g à 20 °C jusqu’à la disparition complète du liquide (5 à 10 minutes supplémentaires).

6 Jetez tout liquide circulant (contenant du formamide), puis réassemblez la FPU.

7 Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage universel à chaque puits d’échantillon.

8 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 10 minutes.

REMARQUE

Veillez à ce que tout liquide soit vidé après la centrifugation. Répétez la centrifugation si nécessaire.

Extension-ligation des oligonucléotides liés

Procédure

1 Ajoutez 45 µl de Mélange extension-ligation à chaque puits d’échantillon de la plaque filtrante.

2 Scellez la plaque filtrante avec une feuille d’aluminium adhésive, puis posez le couvercle.

3 Incubez la plaque FPU dans l’incubateur préchauffé à 37 °C pendant 45 minutes.

Amplification PCR

Préparation

1 Préparez une nouvelle solution 0,05 N NaOH.

2 Déterminez les primers d’index à utiliser selon le graphique de plaque imprimé à partir de Illumina Worklist

Manager.

3 Ramenez le Mélange maître PCR et les primers d’index appropriés à température ambiante. Mélangez chaque tube décongelé, puis centrifugez brièvement les tubes.

4 Préparez une nouvelle plaque PCR à 96 puits (ci-après dénommée la plaque AMP).

5 Ajoutez des primers d’index à la plaque AMP comme suit : a Ajoutez 4 µl des primers d’index sélectionnés [A (A501) – H (A508)] au puits approprié dans une colonne de la plaque AMP.

b Mettez au rebut les bouchons blancs d’origine et utilisez des bouchons blancs neufs.

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c Ajoutez 4 µl des primers d’index sélectionnés [1 (A701) – 12 (A712)] à la rangée appropriée de la plaque

AMP. Les extrémités doivent être changées après chaque rangée pour éviter la contamination croisée de

l’index.

d Mettez au rebut les bouchons orange d’origine et utilisez des bouchons orange neufs.

6 Préparez la solution de travail PCR Mélange maître PCR/Polymérase PCR comme suit : a Pour 96 échantillons, ajoutez 56 µl de Polymérase PCR à 2,8 ml de Mélange maître PCR.

b Retournez 20 fois la solution de travail PCR préparée pour la mélanger.

La solution de travail PCR est stable à température ambiante pendant 10 minutes.

Procédure

1 Retirez le FPU de l’incubateur, puis enlevez l’opercule en aluminium.

2 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 2 minutes.

3 Ajoutez 25 µl de 0,05 N NaOH à chaque puits d’échantillon sur la plaque filtrante. Pipettez la solution NaOH de haut en bas cinq à six fois.

4 Recouvrez et incubez la plaque filtrante à température ambiante pendant 5 minutes.

5 Pendant que la plaque filtrante est en incubation, transférez 22 µl de la solution de travail PCR à chaque puits de la plaque AMP contenant des primers d’index.

6 Transférez les échantillons élués du filtre à la plaque AMP comme suit : a Pipettez les échantillons de la première colonne de la plaque filtrante de haut en bas cinq à six fois.

b Transférez 20 µl de la plaque filtrante à la colonne correspondante de la plaque AMP.

c Pipettez doucement de haut en bas cinq à six fois pour combiner soigneusement l’ADN à la solution de travail PCR.

d Transférez les autres colonnes de la plaque filtrante à la plaque AMP en procédant de la même manière.

Les extrémités doivent être changées après chaque colonne pour éviter la contamination croisée de l’index et de l’échantillon.

7 Scellez la plaque AMP et fixez-la avec un rouleau en caoutchouc.

8 Centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.

9 Transférez la plaque AMP vers la zone de post-amplification.

10 Réalisez la PCR en utilisant le programme suivant sur un thermocycleur :

— 95 °C pendant 3 minutes

— 25 cycles de :

— 95 °C pendant 30 secondes

— 62 °C pendant 30 secondes

— 72 °C pendant 60 secondes

— 72 °C pendant 5 minutes

— Maintenez à 10 °C

POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ

Si vous ne procédez pas immédiatement au nettoyage PCR, la plaque AMP peut rester sur le thermocycleur durant la nuit ou peut être stockée entre 2 °C et 8 °C jusqu’à 48 heures.

Nettoyage PCR

Préparation

1 Ramenez les Billes de nettoyage PCR à température ambiante.

2 Préparez une nouvelle solution d’éthanol à 80 % à partir de l’éthanol absolu.

Procédure

1 Centrifugez la plaque AMP à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.

2 Préparez une nouvelle plaque MIDI (ci-après désignée comme la plaque CLP).

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3 Retournez les Billes de nettoyage PCR 10 fois. Mélangez vigoureusement à l’aide d’un agitateur vortex, puis retournez 10 fois de plus. Inspectez visuellement la solution pour vous assurer que les billes sont resuspendues.

4 Ajoutez 45 µl de Billes de nettoyage PCR dans chaque puits de la plaque CLP.

5 Transférez la totalité du produit PCR de la plaque AMP à la plaque CLP.

6 Scellez la plaque CLP et agitez-la sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 2 minutes.

7 Incubez à température ambiante sans secouer pendant 10 minutes.

8 Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit

évacué.

9 Avec la plaque CLP sur le support magnétique, retirez soigneusement et jetez le surnageant.

10 Avec la plaque CLP sur le support magnétique, lavez les billes comme suit : a Ajoutez 200 µl d’éthanol à 80 % fraîchement préparé dans chaque puits d’échantillon.

b Placez la plaque sur le support magnétique pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que le surnageant soit

éliminé.

c Retirez le surnageant et mettez-le au rebut.

11 Répétez le lavage comme décrit à l’étape précédente.

12 Utilisez une pipette multicanaux P20 réglée sur 20 µl pour retirer l’excès d’éthanol.

13 Retirez la plaque CLP du support magnétique et séchez à l’air libre pendant 10 minutes.

14 Ajoutez 30 µl de Tampon d’élution à chaque échantillon, puis mélangez brièvement.

15 Scellez la plaque CLP et agitez-la sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 2 minutes. Après l’avoir secouée, vérifiez si les échantillons ont été resuspendus. Dans le cas contraire, répétez cette étape.

16 Incubez à température ambiante pendant 2 minutes.

17 Placez la plaque CLP sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué.

18 Préparez une nouvelle plaque MIDI (ci-après désignée comme la plaque LNP).

19 Transférez 20 µl de surnageant de la plaque CLP à la plaque LNP.

20 [Facultatif] Transférez les 10 µl restants du surnageant de la plaque CLP à la nouvelle plaque et étiquetez la plaque avec un nom et une date d’analyse. Conservez cette plaque entre -25 °C et -15 °C jusqu’à la fin de l’analyse de séquençage et de l’analyse de données. Les produits PCR nettoyés peuvent être utilisés pour des efforts de dépannage en cas de pannes d’échantillon.

POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ

Si vous arrêtez à ce point, scellez la plaque LNP et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. La plaque est stable pendant une durée maximale de 3 heures entre 2 °C et 8 °C.

Normalisation de librairie

Préparation

1 Préparez une nouvelle solution 0,1 N NaOH.

2 Ramenez le Diluant de normalisation de librairie, les Billes de librairie et le Lavage de normalisation de librairie à température ambiante.

3 Mélangez le Diluant de normalisation de librairie vigoureusement et assurez-vous que tous les précipités ont

été dissous.

4 Mélangez les Billes de librairie vigoureusement pendant une minute avec inversion intermittente jusqu’à ce que les billes soient remises en suspension et qu’aucun culot ne se trouve au fond du tube lorsque celui-ci est retourné.

Procédure

1 Mélangez le Diluant de normalisation de librairie et les Billes de librairie dans un tube conique de 15 ml tout juste rempli comme suit :

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REMARQUE

En cas de traitement de < 24 échantillons, utilisez un nouveau tube de 1,5 ml.

a Pour 96 échantillons, ajoutez 4,4 ml de Diluant de normalisation de librairie.

b Pipettez les Billes de librairie de haut en bas 10 fois et remettez en suspension.

REMARQUE

Il est extrêmement important de remettre en suspension complètement le culot de billes de la librairie au fond du tube. L’utilisation d’un P1000 permet de s’assurer que les billes sont remises en suspension de manière homogène et qu’il n’y a aucune masse de billes au fond du tube. Cela est essentiel pour atteindre la densité régulière des amplifiats sur la Flow Cell.

c Pour 96 échantillons, pipettez 800 µl de Billes de librairie dans le tube contenant le Diluant de normalisation de librairie.

d Mélangez en retournant le tube 15 à 20 fois.

2 Ajoutez 45 µl de la solution de travail Diluant de normalisation de librairie/Billes de librairie combinée à chaque puits de la plaque LNP contenant des librairies.

3 Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 30 minutes.

4 Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit

évacué.

5 La plaque LNP sur un support magnétique, retirez avec précaution le surnageant et mettez-le au rebut.

6 Retirez la plaque LNP du support magnétique et lavez les billes avec le Lavage de normalisation de librairie comme suit : a Ajoutez 45 µl de Lavage de normalisation de librairie à chaque puits d’échantillon.

b Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 5 minutes.

c Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué.

d Retirez le surnageant et mettez-le au rebut.

7 Répétez la procédure de Lavage de normalisation de librairie comme décrit à l’étape précédente.

8 Utilisez une pipette multicanaux P20 réglée à 20 µl pour retirer tout excès du Lavage de normalisation de librairie.

9 Retirez la plaque LNP du support magnétique et ajoutez 30 µl de la solution 0,1 N NaOH à chaque puits.

10 Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 5 minutes.

11 Pendant l’élution de 5 minutes, préparez une nouvelle plaque PCR à 96 puits (ci-après dénommée la plaque

SGP).

12 Ajoutez 30 µl de Tampon de stockage de librairie à chaque puits à utiliser dans la plaque SGP.

13 Après l’élution de 5 minutes, assurez-vous que tous les échantillons de la plaque LNP sont complètement resuspendus. Si les échantillons ne sont pas complètement remis en suspension, pipettez doucement ces

échantillons de haut en bas ou tapotez doucement la plaque sur la paillasse pour resuspendre les billes, puis secouez pendant encore 5 minutes.

14 Placez la plaque LNP sur le support magnétique pendant au moins 2 minutes.

15 Transférez le surnageant de la plaque LNP à la plaque SGP. Pipettez de haut en bas cinq fois pour mélanger.

16 Scellez la plaque SGP et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute.

POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ

Si vous ne procédez pas immédiatement au groupement des librairies et au séquençage ultérieur sur le MiSeqDx, stockez la plaque SGP à une température comprise entre -25 et -15 °C pendant trois jours au maximum.

Groupement de librairies

Préparer le groupement de librairies

1 Réglez sur 96 °C un bloc chauffant adapté aux tubes de centrifugeuse de 1,5 ml.

2 Dans un seau à glace, préparez un bain d’eau glacée. Faites refroidir le Tampon de dilution de librairie dans le bain d’eau glacée.

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3 Commencez à décongeler la cartouche de réactifs du MiSeqDx.

Préparer une nouvelle dilution de NaOH

ATTENTION

L’utilisation de NaOH nouvellement dilué est essentielle pour dénaturer complètement les échantillons pour la génération d’amplifiats sur le MiSeqDx.

1 Combinez les volumes suivants dans un tube de microcentrifugeuse :

— eau sans DNase ni RNase (900 µl)

— stock de 1,0 N NaOH (100 µl)

2 Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger.

Dénaturer et diluer le Contrôle interne PhiX

1 Combinez les volumes suivants pour diluer la librairie Contrôle interne PhiX de 2 nM :

— librairie Contrôle interne PhiX de 10 nM (2 µl)

— Tampon 1X TE (8 µl)

2 Combinez les volumes suivants pour obtenir une librairie Contrôle interne PhiX de 1 nM :

— librairie Contrôle interne PhiX de 2 nM (10 µl)

— 0,1 N de NaOH (10 µl)

3 Mélangez brièvement la solution de la librairie Contrôle interne PhiX de 1 nM.

4 Centrifugez la solution du modèle à 280 × g à 20 °C pendant 1 minute.

5 Incubez à température ambiante durant 4,5 minutes pour dénaturer la librairie Contrôle interne PhiX en brins uniques.

6 Ajoutez le volume suivant de Tampon de dilution de librairie réfrigéré au préalable au tube contenant la librairie de Contrôle interne PhiX dénaturé pour obtenir une librairie Contrôle interne PhiX de 20 pM.

— Librairie Contrôle interne PhiX dénaturée (20 µl)

— Tampon de dilution de librairie préalablement réfrigéré (980 µl)

Préparer la cartouche de réactifs

1 Décongelez la Cartouche de réactifs MiSeqDx dans un bain d’eau contenant assez d’eau déionisée à température ambiante pour submerger la base de la cartouche de réactifs jusqu’à la ligne de délimitation de l’eau imprimée sur la cartouche de réactifs. Le niveau de l’eau ne doit pas dépasser la ligne de délimitation de l’eau maximale.

2 Laissez la cartouche de réactifs décongeler dans le bain dʼeau à température ambiante pendant environ une heure ou jusquʼà décongélation.

3 Retirez la cartouche du bain d’eau et tapotez-la doucement contre la paillasse pour retirer l’eau de la base de la cartouche. Séchez la base de la cartouche. Assurez-vous que lʼeau n’a pas éclaboussé la partie supérieure de la cartouche de réactifs.

Inspecter la cartouche de réactifs

1 Retournez la cartouche de réactifs 10 fois pour mélanger les réactifs décongelés, puis vérifiez visuellement que toutes les positions sont décongelées.

REMARQUE

Il est essentiel que les réactifs contenus dans la cartouche soient parfaitement décongelés et mélangés afin de garantir un séquençage correct.

2 Inspectez visuellement les réactifs des positions 1, 2 et 4 pour vérifier quʼils sont complètement mélangés et quʼils ne contiennent pas de précipités.

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3 Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair dans les réactifs.

REMARQUE

Les tubes des dispositifs dʼaspiration MiSeqDx descendant au fond de chaque réservoir pour aspirer les réactifs, il est important quʼaucune bulle dʼair ne reste dans les réservoirs.

4 Placez la cartouche de réactifs sur la glace ou réservez-la à une température comprise entre 2 et 8 °C (jusqu’à

6 heures) jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer lʼanalyse. Pour obtenir de meilleurs résultats, chargez directement l’échantillon et configurez lʼanalyse.

Préparer des échantillons pour le séquençage

1 Ramenez le Tampon de dilution de librairie à température ambiante. Mélangez le Tampon de dilution de librairie et assurez-vous que tous les précipités sont complètement dissous.

2 Si la plaque SGP a été conservée congelée, décongelez la plaque SGP à température ambiante.

3 Centrifugez la plaque SGP à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute.

4 Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube PAL).

5 Déterminez les échantillons à regrouper pour le séquençage. Un maximum de 48 échantillons peut être regroupé pour le séquençage.

6 Si la plaque SGP a été conservée congelée, mélangez chaque librairie à séquencer en pipettant de haut en bas trois à cinq fois.

7 Transférez 5 µl de chaque librairie à séquencer de la plaque SGP, colonne par colonne, à une barrette de huit tubes PCR. Scellez la plaque SGP avec un joint adhésif de plaque et réservez.

REMARQUE

Après utilisation, conservez la plaque SGP scellée à une température de -25 °C à -15 °C. La plaque SGP scellée est stable pendant un maximum de trois jours.

8 Combinez et transférez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL. Mélangez le tube PAL soigneusement.

9 Préparez un nouveau tube Eppendorf (ci-après désigné comme le tube DAL).

10 Ajoutez 585 µl de Tampon de dilution de librairie au tube DAL.

11 Ajoutez 6 µl de Contrôle interne PhiX de 20 pM au tube DAL. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total.

12 Transférez 9 µl du PAL dans le tube DAL contenant le Tampon de dilution de librairie. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total.

13 Mélangez le tube DAL sous agitateur vortex à vitesse maximale.

14 Centrifugez le tube DAL à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute.

15 Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant à 96 °C pendant 2 minutes.

16 Après l’incubation, retournez le tube DAL une à deux fois pour mélanger, puis placez-le immédiatement dans un bain d’eau glacée.

17 Gardez le tube DAL dans un bain d’eau glacée pendant 5 minutes.

Charger des librairies d’échantillons sur la cartouche

1 Utilisez une pointe de pipette séparée, propre et vide de 1 ml pour percer l’opercule en aluminium scellant le réservoir sur la cartouche de réactifs étiquetée Load Samples (Charger les échantillons).

2 Transférez à l’aide de la pipette 600 µl des librairies d’échantillons du DAL dans le réservoir Load Samples

(Charger les échantillons). Prenez soin d’éviter de toucher l’opercule en aluminium lors de la distribution de l’échantillon.

Vérifiez s’il y a des bulles d’air dans le réservoir après le chargement de l’échantillon. Si des bulles d’air sont présentes, tapotez légèrement la cartouche sur la paillasse pour les libérer.

3 Passez directement à la configuration de l’analyse depuis l’interface MiSeq Operating Software.

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Procédures de contrôle qualité

Les bonnes pratiques de laboratoire exigent qu’un échantillon d’ADN de contrôle positif et qu’un échantillon de contrôle négatif (sans modèle) soient inclus dans chaque analyse. L’échantillon d’ADN de contrôle positif doit être un

échantillon bien caractérisé avec des variants connus dans la région d’intérêt.

• Si un contrôle sans modèle génère un débit d’appel > 10 %, alors une contamination dans le contrôle sans modèle s’est produite. Le test est considéré comme un échec et l’ensemble du protocole doit être répété, et ce, à partir de la préparation de la librairie.

• L'échantillon de contrôle positif doit générer le résultat attendu. Si le contrôle positif génère un résultat différent de celui attendu, alors il y a peut-être eu une erreur dans le suivi de l’échantillon ou un enregistrement incorrect des primers d’index. L’ensemble du protocole doit être répété, et ce, à partir de la préparation de la librairie.

Caractéristiques de performance

Précision

Deux études distinctes ont été menées pour évaluer la précision de la plateforme MiSeqDx.

Étude 1

Cette étude a utilisé un test représentatif conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et contenant des exons potentiellement pertinents d’un point de vue clinique. Les 13 échantillons uniques utilisés dans cette étude proviennent de deux parents et 11 enfants qui ont été fréquemment séquencés par plusieurs laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Il y a six échantillons de sujets féminins et sept échantillons de sujets masculins. La précision a été déterminée pour les variants mononucléotides (SNV) en comparant les données de l’étude à une base de données de référence bien caractérisée. La séquence de la base de données de référence a été obtenue à partir de la combinaison de plusieurs méthodes de séquençage, de données accessibles au public et de renseignements sur l’hérédité. Le tableau suivant permettant d’évaluer la précision du système a été établi à partir des données de la première analyse au cours de l’étude. Le test n’a pas été répété pour cette étude.

Les résultats de cette étude sont présentés ci-dessous.

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9 8

Tableau 14 Données de précision de niveau amplicon de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

1 1 132 13 15 132

121

114

129

131

110

131

117

128

133

119

127

135

122

130

117

Poly C (5),

63 % en GC

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (5),

Poly C (5)

Poly T (5)

Poly A (14)

Poly A (5)

Poly A (5),

Poly T (5)

121

114

129

131

110

130-131

117

128

133

119

127

135

122

130

117

Nombre d’aucunappel

130

117

128

133

119

127

135

122

Nombre d’appels corrects par échantillon

132

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

121

114

129

131

110

130-131

117

100

99,54

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

136

131

123

117

119

123

134

132

120

129

133

135

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (5)

Poly T (5),

SNV

Poly A (5)

Poly A (6),

Poly T (5),

Région homologue sur un chromosome différent

Poly T (5)

Poly C (7),

66 % en GC

Poly C (5),

69 % en GC

SNV

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

123

117

119

120

129

133

135

123

134

132

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

136

131

Nombre d’aucunappel

Nombre d’appels corrects par échantillon

136

131

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

123

117

119

120

129

133

135

123

134

132

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

30 4 121

125

134

118

122

131

133

128

131

129

133

112

133

135

122

117

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (6)

Poly A (5),

Poly T (5),

SNV

Poly T (5),

SNV

Poly A (5),

SNV

Poly T (5)

Poly A (5)

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

121

Nombre d’aucunappel

125

134

118

122

131

133

128

131

129

133

112

133

135

122

117

125

134

118

122

131

133

128

131

129

112

133

135

122

117

Nombre d’appels corrects par échantillon

121

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

133

100

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46 9

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

120

119

118

112

126

132

131

119

120

115

112

123

133

112

129

124

117

128

Contenu génomique de l’amplicon

Poly A (5)

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (6)

Poly A (5)

CT(5)

SNV

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

120

119

118

112

126

132

131

119

120

115

112

123

133

112

129

125

117

128

Nombre d’aucunappel

Nombre d’appels incorrects

Nombre d’appels corrects par échantillon

120

119

118

112

126

132

131

119

120

115

112

123

133

112

129

125

117

128

% d’appels corrects 7

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

135

131

121

132

75 7

123

125

133

120

135

126

134

122

127

116

135

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (6)

63 % en GC

Poly A (6),

Poly T (8)

60 % en GC

Poly A (5),

59 % en GC

Poly C (5),

63 % en GC

59 % en GC;

SNV

Poly A (5),

Poly T (5)

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

135

131

121

132

Nombre d’aucunappel

134

122

127

123

125

133

120

135

126

116

135

133

120

135

126

123

125

133

Nombre d’appels corrects par échantillon

135

131

121

132

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

134

122

127

116

135

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

118

136

131

119

95 10

122

123

127

129

130

116

119

121

117

114

129

Contenu génomique de l’amplicon

67 % en GC

58 % en GC

Poly G (6),

61 % en GC

Poly T (5)

Poly A (6)

60 % en GC

57 % en GC

Poly T (5)

Région homologue sur un chromosome différent

Poly A (14)

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

122

123

127

129

130

116

119

121

117

114

130

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

118

136

131

119

Nombre d’aucunappel

122

123

127

129

130

116

119

Nombre d’appels corrects par échantillon

118

136

131

119

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

121

117

114

129 (sur 130)

100

99,23

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

96 9 114

122

127

133

138

139

116

133

138

136

118

128

120

139

Contenu génomique de l’amplicon

Région homologue sur un chromosome différent

SNV

Poly A (5),

Poly C (5)

64 % en GC

Poly A (5),

57 % en GC

Poly C (5),

67 % en GC

70 % en GC

62 % en GC

60 % en GC

58 % en GC;

SNV

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

122

127

138

136

118

128

120

139

133

138

139

116

133

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

114

Nombre d’aucunappel

133

138

139

116

133

118

128

120

139

Nombre d’appels corrects par échantillon

114

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

122

127

138

136

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

113

114

115

110

111

112

129

122

124

118

123

121

116

117

118

119

120

121

122

123

135

119

125

131

117

116

129

Contenu génomique de l’amplicon

57 % en GC

Poly T (5)

26 % en GC

Poly T (5);

Région homologue sur un chromosome différent

CA (4)

Poly A (6);

Région homologue sur un chromosome différent

Poly C (5);

SNV

58 % en GC

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

135

119

125

131

117

116

129

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

129

122

124

118

123

121

Nombre d’aucunappel

135

119

125

131

117

116

129

Nombre d’appels corrects par échantillon

129

122

124

118

123

121

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

127

128

129

130

124

125

126

131

132

133

134

129

121

123

127

117

113

136

132

115

117

135

136

137

138

139

134

131

133

137

131

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (10)

Poly T (5)

Poly A (5)

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (6)

Poly T (5)

Poly T (8);

19 % en GC

Poly A (5);

Poly T (5)

Poly A (5)

26 % en GC;

SNV

Poly T (8);

SNV

Poly A (5)

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

129

121

123

127

117

113

136

132

115

117

Nombre d’aucunappel

134

131

133

137

131

Nombre d’appels corrects par échantillon

129

121

123

127

117

113

136

132

115

117

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

134

131

133

137

131

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

152

153

154

155

156

157

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

147

148

149

150

151

143

144

145

146

140

141

142

116

133

117

124

123

136

124

122

131

128

133

115

125

121

123

114

119

Contenu génomique de l’amplicon

Poly A (5)

59 % en GC

Poly C (5)

SNV

Poly T (6)

Poly T (5);

26 % en GC

Poly A (5)

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

116

133

117

124

123

136

124

122

131

128

133

Nombre d’aucunappel

115

125

121

123

114

119

115

125

121

123

114

119

Nombre d’appels corrects par échantillon

116

133

117

124

123

136

124

122

131

128

133

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

166

167

168

169

170

171

172

173

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

161

162

163

164

158

159

160

165

123

119

135

122

121

116

123

116

118

129

131

127

118

138

Contenu génomique de l’amplicon

58 % en GC

Poly C (5)

61 % en GC

Poly C (6);

60 % en GC;

SNV

62 % en GC

Poly C (5);

65 % en GC

Poly G (6);

67 % en GC;

SNV

61 % en GC

Poly C (5)

61 % en GC

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

123

119

135

122

121

116

Nombre d’aucunappel

123

116

118

129

131

127

118

138

123

116

118

129

131

127

118

138

Nombre d’appels corrects par échantillon

123

119

135

122

121

116

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

184

185

186

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

177

178

179

180

174

175

176

181

182

183

134

129

133

118

131

112

124

114

118

122

139

131

141

Contenu génomique de l’amplicon

58 % en GC

Poly A (6)

60 % en GC

Poly G (6);

66 % en GC

64 % en GC

67 % en GC

59 % en GC;

Région homologue sur un chromosome différent

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

139

131

141

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

134

129

133

118

131

112

124

114

118

122

Nombre d’aucunappel

139

131

141

Nombre d’appels corrects par échantillon

134

129

133

118

131

112

124

114

118

122

Nombre d’appels incorrects

% d’appels corrects 7

100

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

188

189

190

191

192

193

Amplicon Chromosome

Taille du fragment analysé

187 19 121

194

195

138

123

138

117

136

122

119

Contenu génomique de l’amplicon

Poly C (5);

72 % en GC;

Région homologue sur un chromosome différent

58 % en GC

64 % en GC

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (5);

Poly C (5)

62 % en GC;

SNV

66 % en GC

Nombre d’échantillons uniques

Nombre total d’échantillons analysés

138

123

138

117

136

122

119

Nombre d’appels par échantillon ayant été effectués

121

Nombre d’aucunappel

Nombre d’appels corrects par échantillon

121

138

123

138

117

136

122

Nombre d’appels incorrects

100

% d’appels corrects 7

100

119 0 100

1 S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible.

Le nombre total d’échantillons répertoriés est de 15, car deux des 13 échantillons uniques analysés ont été analysés en deux réplicats indépendants.

Le nombre d’appels par échantillon ayant été effectués est le nombre de bases ayant une qualité suffisante pour être définis par le système.

4 Le nombre d’aucun-appels est le nombre de bases dans un amplicon entraînant aucun appel dans l’analyse.

5 Le nombre d’appels corrects par échantillon est le nombre de bases dans l’amplicon qui ont été définies et ayant des résultats correspondant à la séquence de référence du génome

6 humain version 19 et la référence composite bien caractérisée.

Le nombre d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects pour le SNV ou l’indel dans cet amplicon; des détails supplémentaires sur les appels incorrects sont présentés dans

7 les notes de bas de page ci-dessous.

Le % d’appels corrects correspond au taux d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur les renseignements de référence composite bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence de l’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons contiennent un indel et d’autres non, par exemple, l’amplicon 9. Le % d’appels corrects pour les échantillons avec un résultat incorrect est présenté dans le tableau.

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L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Toutefois, les renseignements de référence composite bien caractérisée pour sept des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces sept échantillons, cette suppression d’une paire de bases représente un faux négatif

9 dans l’étude de précision de séquençage MiSeqDx.

L’amplicon 46 a une insertion de bases qui est rapportée dans neuf échantillons dans la base de données de référence bien caractérisée et est correctement détectée dans tous les

échantillons analysés.

L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de référence composite bien caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion de paire de bases représente un faux négatif dans l’étude de précision de séquençage MiSeqDx.

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NA12877

NA12878

NA12879

NA12880

NA12881

NA12882

NA12883

NA12884

NA12885

NA12886

NA12887

NA12888

NA12893

Le tableau suivant contient les données de l’Étude 1 présentées avec la concordance positive et négative en pour cent, où les résultats des variants sont comparés aux renseignements de référence composite bien caractérisée pour le calcul de la concordance positive en pour cent (CPP). Étant donné que les renseignements de référence composite fournissent uniquement des résultats pour les variants mononucléotides et les insertions/suppressions, les résultats des bases sans variants sont comparés à la séquence de référence du génome humain version 19 pour le calcul de la concordance négative en pour cent (CNP). Toutes les bases sans variants avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence de référence. Tous les SNV avaient un taux de concordance de 100 % avec la séquence de référence. Les variants qui ont

été manqués étaient des insertions d’une base ou des suppressions d’une base dans les régions d’homopolymères.

Tableau 15 Concordance des résultats des définitions des bases de la plateforme MiSeqDx avec les données de référence pour

13 échantillons bien caractérisés

Échantillon

Nbre d’amplicons

% de couverture d’amplicons 1

Variants attendus par échantillon 2

Variants correctement appelés

Variants

3 manqués

Bases sans variants appelées correctement

CPP 4

(%)

CNP 5 (%)

195

100

24417

24415

24416

24412

24417

24415

24419

24412

24415

24418

24417

24416

24417

89,47

90,91

94,74

95,83

90,00

90,91

93,75

95,83

95,24

89,47

95,00

90,00

100

1 Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité.

Les variants prévus par échantillon comprennent les SNV et les indels.

Pour les variants manqués, veuillez consulter le premier tableau de l’étude 1 et les notes de bas de page 8 à 10.

4 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 × TP/(TP + FN), où les vrais positifs (TP) sont le nombre d’appels de variants positifs aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence et l’allèle mutant appelé est concordant avec la séquence de référence (colonne nommée « Variants appelés correctement ») et les faux négatifs (FN) sont le nombre d’appels de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont présents les variants selon la séquence de référence (colonne nommée

« Variants manqués »).

Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 × TN/(FP + TN) où les faux positifs (FP) sont le nombre d’appels de variants positifs aux coordonnées génomiques où sont absents les variants selon la séquence de référence, ou si l’allèle mutant appelé est discordant avec la séquence de référence (non référencé dans le tableau; aucun appel de variants faux positifs n’a été effectué dans cette étude) et les vrais négatifs (TN) sont le nombre d’appels de variants négatifs aux coordonnées génomiques où sont absents les variants selon la séquence de référence (colonne nommée « Bases sans variants appelées correctement »).

Étude 2

Les résultats de séquençage pour le panel d’amplicons ci-dessus ont été comparés à un génotype d’une grande fiabilité

établi pour NA12878 par le National Institutes of Standards and Technology (NIST, Institut national des normes et de la

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technologie) (v.2.15

1 ). Sur les 195 amplicons, 184 amplicons étaient compris dans les appels de référence d’une grande fiabilité dans la séquence du NIST et ont été comparés. Les définitions des bases sans variants ont été comparées à la séquence du génome humain de référence version 19.

Tableau 16 Comparaison des résultats de séquençage de la plateforme MiSeqDx pour l’échantillon NA12878 avec la base de données du NIST

Échantillon

Nbre d’amplicons

% de couverture d’amplicons 2

Variants attendus

Variants correctement appelés

Variants manqués

Bases sans variants appelées correctement

CPP 3

(%)

CNP 4

(%)

NA12878 184 100 17 16 1 5 23066 94,12 100

1 Zook, JM et coll. Integrating sequencing datasets to form highly confident SNP and indel genotype calls for a whole human genome.

2 arXiv:1307.4661 [q-bio.GN].

Le pourcentage de couverture d’amplicons est le nombre de bases dans les amplicons séquencées avec fiabilité.

3 Concordance positive en pour cent (CPP) = 100 × TP/(TP + FN).

Concordance négative en pour cent (CNP) = 100 × TN/(FP + TN).

Le variant manqué est la suppression d’une paire de bases dans l’amplicon 9 d’une analyse homopolymère de 14 A non appelés par le système MiSeqDx présente dans la séquence NIST. Notez que la séquence NIST n’inclut pas l’insertion d’une paire de bases dans l’autre homopolymère de A qui était présent dans l’autre base de données de référence utilisée ci-dessus dans l’étude 1.

Les données qui ressortent de ces études de précision confirment que la plateforme MiSeqDx peut séquencer avec précision les éléments suivants.

• Teneur en GC ≥ 19 % (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés ayant un taux de 19 % de teneur en GC appelé correctement)

• Teneur en GC ≤ 72 % (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés ayant un taux de 72 % de teneur en GC appelé correctement)

• Longueurs de PolyA ≤ 7 (la répétition PolyA de sept nucléotides a été appelée correctement dans 270 des

270 amplicons séquencés contenant PolyA = 7)

• Longueurs de PolyT ≤ 8 (la répétition PolyT de huit nucléotides a été appelée correctement dans 270 des

270 amplicons séquencés contenant PolyT = 8)

• Longueurs de PolyG ≤ 6 (la répétition PolyG de six nucléotides a été appelée correctement dans 405 des

405 amplicons séquencés contenant PolyG = 6)

• Longueurs de PolyC ≤ 7 (la répétition PolyC de sept nucléotides a été appelée correctement dans 135 des

135 amplicons séquencés contenant PolyC = 7)

• Longueurs de répétition de dinucléotides ≤ 5 × (toutes les bases dans 135 des 135 amplicons séquencés avec une répétition de dinucléotides de 5 × ont été appelées correctement)

• Longueurs de répétition de trinucléotides ≤ 4 × (toutes les bases dans 810 des 810 amplicons séquencés avec une répétition de trinucléotides de 4 × ont été appelées correctement)

• Insertions d’une base et suppression de trois bases ou moins

— Deux des trois insertions d’une base testées ont été appelées correctement. Des appels corrects ont été effectués pour deux insertions d’une base dans des régions non homopolymères dans 82 amplicons. Une insertion d’une base n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur le chromosome 2 dans 135 amplicons.

— Trois des quatre suppressions d’une base ont été appelées correctement. Tous les appels corrects ont été effectués dans des régions non homopolymères dans quatre amplicons. Une suppression d’une base n’a pas été appelée dans une analyse d’homopolymères de 14 A sur le chromosome 9 dans 63 amplicons.

— La suppression de deux bases a été appelée correctement dans un échantillon.

— Les suppressions de trois bases ont été appelées correctement dans 21 échantillons.

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Reproductibilité

La reproductibilité de la plateforme MiSeqDx a été déterminée à l’aide de deux tests représentatifs.

Étude 1

Un test représentatif a été conçu pour étudier divers gènes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes différents et contenant des exons potentiellement pertinents sur le plan clinique. L’étude a permis d’examiner 13 échantillons au cours de neuf analyses à l’aide de trois instruments MiSeqDx différents avec le concours de trois opérateurs distincts

(

Tableau 17 ). Un lot unique de réactifs de préparation de la librairie et deux lots de consommables pour le séquençage

ont été utilisés. Les 13 échantillons provenaient de deux parents et 11 enfants qui avaient été fréquemment séquencés par plusieurs laboratoires et selon plusieurs méthodes de séquençage. Deux échantillons ont été analysés en double exemplaire, donc chaque analyse a généré des résultats pour 15 échantillons.

Pour l’évaluation de la reproductibilité d’un lot à l’autre, 94 échantillons et deux contrôles sans modèle ont été testés dans l’ensemble des trois lots. Chaque lot a été scindé en deux analyses de 48 échantillons pour tester tous les réactifs et les combinaisons de primers d’index possibles. Toutes les analyses de séquençage ont été réalisées par un seul opérateur sur un seul instrument MiSeqDx pour éviter toute variation éventuelle due à l’opérateur ou à l’instrument

(

Tableau 18

Des appels corrects ont été déterminés pour les variants mononucléotides (SNV) en comparant les données de l’étude à des renseignements de référence bien caractérisée. Il n’y a eu aucun échec d’analyse ou répétition d’analyse pour l’étude de reproductibilité. Les tableaux suivants contiennent les résultats des études destinées à évaluer la reproductibilité du système.

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Tableau 17 Résultats de la reproductibilité d’instrument-à-instrument de l’étude 1 pour la plateforme MiSeqDx (au niveau de l’amplicon)

MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

1 1 132 135 0 0 100 23 6 0 99,61 7 39 6

114

129

131

110

131

117

121

128

133

119

127

135

122

130

Poly C (5);

63 % en GC

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (5);

Poly C (5)

Poly T (5)

Poly A (14)

Poly A (5)

Poly A (5);

Poly T (5)

135

27 8

100

99,54

100

27 8

100

99,54

100

27 8

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

99,34 7

100

99,54

100

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

130

117

136

131

123

117

119

120

129

133

135

123

134

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (5)

Poly T (5);

SNV

Poly A (5)

Poly A (6);

Poly T (5);

Région homologue sur un chromosome différent

Poly T (5)

Poly C (7);

66 % en GC

Poly C (5);

69 % en GC

SNV

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

100

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

132

121

125

134

118

122

131

133

128

131

129

133

112

133

135 -

Poly T (6)

Poly A (5);

Poly T (5);

SNV

Poly T (5);

SNV

Poly A (5);

SNV

Poly T (5)

Poly A (5)

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

135

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

131

119

120

119

112

129

126

132

118

112

120

117

128

123

133

122

117

124

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

Poly A (5)

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (6)

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

100

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

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Trousse universelle MiSeqDx 1.0

135

131

121

132

120

115

112

133

120

135

126

134

122

7 127

7 123

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

Poly A (5)

CT(5)

SNV

Poly T (6)

63 % en GC

Poly A (6);

Poly T (8)

60 % en GC

Poly A (5);

59 % en GC

Poly C (5);

63 % en GC

59 % en GC;

SNV

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

100

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

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Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

125

133

116

135

118

136

131

119

122

123

127

129

130

116

119

Contenu génomique de l’amplicon

Poly A (5);

Poly T (5)

67 % en GC

58 % en GC

Poly G (6);

61 % en GC

Poly T (5)

Poly A (6)

60 % en GC

57 % en GC

Poly T (5)

Région homologue sur un chromosome différent

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

135

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

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Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

100

101

102

103

104

121

117

114

129

114

122

127

133

138

139

116

133

138

Contenu génomique de l’amplicon

Région homologue sur un chromosome différent

Poly A (14)

Région homologue sur un chromosome différent;

SNV

Poly A (5);

Poly C (5)

64 % en GC

Poly A (5);

57 % en GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

135

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

99.22

100

99.22

100

99.22

100

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Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

136

118

128

120

139

118

123

121

129

122

124

135

Contenu génomique de l’amplicon

Poly C (5);

67 % en GC

70 % en GC

62 % en GC

60 % en GC

58 % en GC;

SNV

57 % en GC

Poly T (5)

26 % en GC

Poly T (5);

Région homologue sur un chromosome différent

CA (4)

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

135 0

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100 0

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100 0 0

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

Référence 15039608, rév. B FRA

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Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

117

118

126

127

128

129

130

131

122

123

124

125

119

120

121

135

119

125

131

117

116

129

117

113

129

121

123

127

136

Contenu génomique de l’amplicon

58 % en GC

Poly T (10)

Poly T (5)

Poly A (5)

Poly T (5)

Poly A (6)

Poly T (6)

Poly A (6);

Région homologue sur un chromosome différent

Poly C (5);

SNV

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

135 0

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100 0

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100 0 0

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

135

136

137

132

133

134

138

139

140

141

142

143

144

145

146

132

115

117

11 134

131

133

11 137

131

128

133

136

124

122

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

Poly T (5)

Poly T (8);

19 % en GC

Poly A (5);

Poly T (5)

Poly A (5)

SNV;

26 % en GC

Poly T (8);

SNV

Poly A (5)

59 % en GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

100

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

158

159

160

161

162

163

152

153

154

155

156

157

147

148

149

150

151

116

133

117

124

123

122

121

123

119

115

125

121

123

114

119

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

Poly C (5)

SNV

Poly T (6)

Poly T (5);

26 % en GC

Poly A (5)

58 % en GC

Poly C (5)

61 % en GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

100

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

164

165

171

172

173

174

175

176

177

178

166

167

168

169

170

135

116

123

116

118

129

131

127

118

138

131

112

124

134

129

Poly C (6);

60 % en GC;

SNV

62 % en GC

Poly C (5);

65 % en GC

Poly G (6);

67 % en GC;

SNV

61 % en GC

Poly C (5)

61 % en GC

58 % en GC

Poly A (6)

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

135

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

184

185

186

179

180

181

182

183

187

188

189

190

133

118

114

118

122

139

131

141

121

138

123

138

Contenu génomique de l’amplicon

60 % en GC

Poly G (6);

66 % en GC

64 % en GC

67 % en GC

59 % en GC;

Région homologue sur un chromosome différent

Poly C (5);

72 % en GC;

Région homologue sur un chromosome différent

58 % en GC

64 % en GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

100

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

191

192

193

Amplicon Chr.

Taille du fragment analysé 1

Contenu génomique de l’amplicon

194

195

117

136

122

22 122

22 119

Poly T (5)

Poly A (7)

Poly A (5);

Poly C (5)

62 % en GC;

SNV

66 % en GC

135

MiSeqDx 1

Nombre d’analyses d’échantillons 2

Nombre total d’aucunappels 3

Nombre total d’appels incorrects 4

MiSeqDx 2

100

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

MiSeqDx 3

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

Nombre total d’aucunappels 3

100

Nombre total d’appels incorrects 4

% d’appels corrects 5

100

135 0 0 100 0 0 100 0 0 100

S’entend par « fragment analysé » la taille de la région génomique séquencée dans les bases, sans prendre en compte les primers spécifiques à la cible.

Le nombre d’échantillons est calculé à partir de neuf analyses de 15 échantillons (11 échantillons analysés une fois et deux échantillons analysés deux fois).

Le nombre total d’aucun-appels est le nombre total d’aucun-appels obtenu pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx spécifié.

Le nombre total d’appels incorrects est le nombre total d’appels incorrects obtenus pour l’ensemble des 45 analyses analysant l’amplicon spécifique à l’aide d’un instrument MiSeqDx

5 spécifié.

Le % d’appels corrects correspond au débit d’appels corrects pour toutes les bases dans l’amplicon, où l’appel correct pour le SNV ou l’indel est basé sur la base de données de référence bien caractérisée et l’appel correct pour les bases dans le reste de la séquence d’amplicon est basé sur la comparaison de la séquence de référence du génome humain version 19. Cette colonne peut afficher plus d’un résultat prévu pour un amplicon donné si certains échantillons doivent avoir un indel et d’autres non, par exemple, l’amplicon 9.

6 L’amplicon 1 possédait un certain nombre de bases dont le génotype ne pouvait pas être appelé : 12 bases dans une analyse sur neuf dans NA12881; une base dans deux analyses sur neuf et trois bases dans une analyse sur neuf dans NA12886; 20 bases dans une analyse sur neuf et 26 bases dans une analyse sur neuf dans NA12888. Cela est dû à la faible couverture dans les bases sans aucun appel dans ces analyses, où la profondeur moyenne de séquençage était de 33,2, avec un minimum de 21 et un maximum de 52.

7 Lorsque le nombre d’aucun-appels n’est pas inclus dans le calcul, le taux d’appels corrects est de 100 %.

8 L’amplicon 9 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les renseignements de référence bien caractérisée pour sept des 13 échantillons ont 13 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces sept échantillons, cette suppression d’une paire de bases s’appelle un faux négatif et est appelée

9 comme faux négatif de façon reproductible dans les neuf analyses.

L’amplicon 95 a une analyse d’homopolymères de 14 A selon la séquence de référence du génome humain version 19. Cependant, les séquences de renseignements de référence bien caractérisée pour 13 des 13 échantillons ont 15 A dans cette analyse d’homopolymères. Dans ces 13 échantillons, cette insertion d’une paire de bases n’est pas appelée de façon reproductible à 100 % (c.-à-d. qu’il s’agit d’un faux négatif).

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Les résultats de l’étude 1 de reproductibilité pour chaque échantillon sont présentés pour l’ensemble des neuf analyses en une seule colonne. Les résultats affichés portent uniquement sur les variants à simple nucléotide et les résultats des insertions/délétions par rapport à la séquence de la base de données de référence pour les trois analyses réalisées sur trois instruments. Cette analyse a montré que les résultats des variants étaient reproductibles dans neuf analyses pour ces

échantillons.

Tableau 18 Résumé des résultats de reproductibilité de la plateforme MiSeqDx pour 13 échantillons bien caractérisés

Variants mononucléotides (SNV)

Nº d’ADN

Identifiant de l’échantillon d’ADN

Nombre d’analyses par échantillon

Nombre de SNV

Nombre de bases appelées correctement

Nombre de faux positifs 1

Nombre de faux négatifs 2

Nombre d’indels

NA12877 3

NA12878 3

NA12879

NA12880

NA12881

NA12882

NA12883

NA12884

NA12885

NA12886

NA12887

NA12888

NA12893

Insertions/délétions (indels)

Nombre de bases appelées correctement

Nombre de faux positifs 1

Nombre de faux négatifs 2

1 Faux positif = variant appelé par l’analyse de séquençage MiSeqDx, mais ne figurant pas dans la base de données de référence.

Faux négatif = variant figurant dans la base de données de référence, mais non appelé au cours de l’analyse de séquençage MiSeqDx.

Les échantillons NA12877 et NA12878 ont été analysés deux fois. Les échantillons répliqués ont généré des résultats identiques.

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Étude 2

Une étude de reproductibilité de site à site a été effectuée avec un test représentatif, le test de la fibrose kystique à 139 variants Illumina MiSeqDx, incluant un sous-ensemble de variations du gène CFTR pertinentes d’un point de vue clinique analysées avec le logiciel MiSeq Reporter à l’aide de la plateforme de flux de travail de séquençage d’ADN ciblé MiSeqDx. L’étude en aveugle a été réalisée sur trois sites d’essais et a nécessité deux opérateurs sur chaque site. Deux panels bien caractérisés de 46 échantillons chacun ont été analysés par chacun des opérateurs sur chaque site pour un total de 810 appels par site. Les panels contenaient un mélange d’ADN génomique issu des lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR, ainsi que du sang déleucocyté enrichi de lignées cellulaires ayant des variants connus dans le gène CFTR. Les échantillons de sang ont été fournis pour permettre l’incorporation des étapes d’extraction utilisées dans la préparation d’ADNg qui sert d’entrée primaire pour le flux de travail du test. Le débit de passage des échantillons, défini comme le nombre d’échantillons passant les indicateurs de contrôle qualité lors de la première tentative, était de 99,88 %. Tous les résultats des tests sont basés sur un test initial.

Tableau 19 Résumé des résultats de l’étude de reproductibilité réalisée avec un test représentatif de la fibrose kystique à 139 variants MiSeqDx.

Panel

Nº d’échantillon

Génotype de l’échantillon

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Nbre d’appels incorrects

Concordance positive (%)

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

Nbre d’aucunappels

9 3

S549N (HET)

1812-1 G>A (HET)

Q493X/F508del (HET)

F508del/2184delA

(HET)

Y122X/R1158X (HET)

F508del/2183AA>G

(HET)

R75X (HET)

I507del/F508del (HET)

F508del/W1282X

(HET)

810

804

798

797

798

804

798

804

798

665

798

804

798

797

804

798

804

798

2 3

135

100

94,44

100

97,22

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100

94,44

100

99,96

100

94,44

100

99,92

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Panel

Nº d’échantillon

Génotype de l’échantillon

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Site 1 Site 2

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

Nbre d’appels incorrects

Nbre d’aucunappels

Concordance positive (%)

810 12 11 12 798 797 798 2 3 0 97,22

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

99,96 99,92 F508del/3272-26A>G

(HET)

F508del/3849+10kbC>T

(HET)

621+1G>T/3120+1G>A

(HET)

E60X/F508del (HET)

M1101K (HET)

M1101K (HOM)

F508del (HOM) I506V,

I507V,

F508C absents

F508del/3659delC

(HET)

R117H/F508del (HET) (TG)10

(T)9/

(TG)12

(T)5

621+1G>T/711+1G>T

(HET)

G85E/621+1G>T (HET)

A455E/F508del (HET)

810

828

810

816

810

798

804

822

798

804

822

798

804

822

798

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Panel

Nº d’échantillon

Génotype de l’échantillon

F508del/R560T (HET)

F508del/Y1092X (C>A)

(HET)

N1303K (HET)

G542X (HOM)

G542X (HET)

G551D/R553X (HET)

3849+10kbC>T (HOM)

F508del (HET)

1717-1G>A (HET)

R1162X (HET)

R347P/G551D (HET)

R334W (HET)

G85E (HET)

I336K (HET)

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Site 1 Site 2

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

Nbre d’appels incorrects

Nbre d’aucunappels

Concordance positive (%)

810

798

100

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100

810

804

798

804

810

804

798

804

810

804

810

804

798

804

810

804

798

804

810

804

810

804

798

804

810

804

798

804

810

804

810

100

S.O.

100

S.O.

100

S.O.

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Panel

Nº d’échantillon

Génotype de l’échantillon

F508del/3849+10kbC>T

(HET)

621+1G>T/3120+1G>A

(HET)

F508del/3659delC

(HET)

R117H/F508del (HET) (TG)10

(T)9/

(TG)12

(T)5

G85E/621+1G>T (HET)

A455E/F508del (HET)

N1303K (HET)

G551D/R553X (HET)

2789+5G>A (HOM)

CFTR dele2, 3/F508del

(HET)

F508del/1898+1G>A

(HET)

F508del/2143delT

(HET)

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Site 1 Site 2

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

Nbre d’appels incorrects

Nbre d’aucunappels

Concordance positive (%)

810 12 12 12 798 798 798 0 0 100

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100 100

810

816

810

798

804

798

804

798

810

798

804

798

804

798

810

798

804

798

804

798

810

798

100

S.O.

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Panel

Nº d’échantillon

B 68

Génotype de l’échantillon

3876delA (HET)

3905insT (HET)

394delTT (HET)

F508del (HET)

L206W (HET)

G330X (HET)

R347H (HET)

1078delT (HET)

G178R/F508del (HET)

S549R (c.1647T>G)

(HET)

S549N (HET)

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Site 1 Site 2

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

Nbre d’appels incorrects

Nbre d’aucunappels

Concordance positive (%)

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

810

804

798

810

804

810

804

810

804

810

804

798

810

804

810

804

810

804

810

804

798

810

804

810

804

810

804

S.O.

100

S.O.

100

S.O.

100

S.O.

100

810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Panel

Nº d’échantillon

75 2

Génotype de l’échantillon

W846X (HET)

E92X/F508del (HET)

621+1G>T/1154insTC

(HET)

G542X (HET)

F508del (HET)

621+1G>T/A455E

(HET)

1812-1 G>A (HET)

F508del/R553X (HET)

F508del/G551D (HET)

R347P/F508del (HET)

R117H/F508del (HET) (TG)10

(T)9/

(TG)12

(T)5

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Site 1 Site 2

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

Nbre d’appels incorrects

Nbre d’aucunappels

Concordance positive (%)

810

804

810

798

804

810

798

804

810

798

797

1 4

100

S.O.

100

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100

99,96

100

99,96

810

816

804

798

804

810

798

804

670

804

798

804

810

798

804

798

804

810

798

135 2

100

94,44

100

S.O.

100

94,44

100

94,44

100

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Panel

Nº d’échantillon

Total

Génotype de l’échantillon

I507del (HET)

2789+5G>A (HOM)

CFTR dele2, 3/F508del

(HET)

F508del/1898+1G>A

(HET)

F508del/2143delT

(HET)

3905insT (HET)

394delTT (HET)

F508del (HET)

Variants

Nombre total d’appels par site

Appels concordants positifs (variants)

Site 1 Site 2

Appels concordants négatifs (de type sauvage)

Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

Nbre d’appels incorrects

Nbre d’aucunappels

Concordance positive (%)

810

804

798

804

797

804

798

1 4

100

Concordance négative (%)

Concordance globale (%)

100

99,96

100

99,96

810

74 556

2 209

798

810

798

804

221 182

798

810

798

804

798

810

798

804

273

100

S.O.

100

99,77

100

99,88

100

99,88

L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant N1303K pour un réplicat, n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.

Un réplicat des échantillons 5 et 75 avait un débit d’appel de 0 %. Le complément d’enquête indique que des échantillons peuvent ne pas avoir été ajoutés à la plaque d’échantillons avant

4 la préparation de la librairie, car les volumes d’échantillon restants dans les tubes ne correspondaient à aucun volume ayant été supprimé.

Des preuves indiquent que les échantillons 9 et 10 ont été vraisemblablement échangés par l’opérateur avant la préparation de la librairie.

L’emplacement de type sauvage, correspondant au variant M1V pour un réplicat de chacun des deux échantillons n’a entraîné aucun appel à cause d’une couverture insuffisante.

Référence 15039608, rév. B FRA

Février 2015

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Extraction d’ADN

Trois différentes méthodes d’extraction, à savoir l’extraction à base de billes magnétiques, la précipitation dans l’alcool et la filtration sur colonne de silice, ont été évaluées à l’aide de sang total K

EDTA anticoagulé. Quatorze échantillons de sang unique ont été utilisés dans l’étude, représentant une plage de génotypes d’un seul gène représentatif. Les trois méthodes d’extraction de l’ADN ont été testées indépendamment par deux opérateurs différents qui ont chacun effectué trois analyses par la méthode d’extraction. Chaque extraction a été réalisée par chaque opérateur à des jours différents.

La concentration d’ADN et le rapport A260/A280 des échantillons d’ADNg extrait ont été déterminés par spectrophotométrie. La taille totale des échantillons pour chaque méthode d’extraction dans cette étude était de 168

(14 échantillons × 2 opérateurs/méthode d’extraction × 3 analyses/opérateur × 2 réplicats/échantillon d’ADNg extrait).

Méthode d’extraction

Précipitation dans l’alcool

Filtration sur colonne de silice

Extraction à base de billes magnétiques

Nombre d’échantillons testés

168

Débit d’appel

100 %

Précision

100 %

Débit au premier passage de l’échantillon

100 %

1 Précision : la concordance en pour cent avec une méthode d’essai de référence (séquençage bidirectionnel de Sanger) calculée pour les

2 positions de base qui reçoivent une définition des bases.

Débit au premier passage de l’échantillon : le nombre d’échantillons respectant le débit d’appel spécifié la première fois qu’ils sont traités (c’est-à-dire, sans qu’il soit nécessaire de procéder à une nouvelle analyse ou un traitement supplémentaire) en pourcentage du nombre total d’analyses d’échantillons au cours d’une seule expérience de séquençage MiSeqDx.

Entrée d’ADN

La plage d’entrée d’ADN pour la plateforme MiSeqDx a été évaluée en effectuant une étude de dilution en série à l’aide de 14 échantillons d’ADN représentatifs contenant 16 variants du gène unique. Chaque échantillon a été testé en double exemplaire sur neuf niveaux d’entrée d’ADN allant de 1 250 ng à 1 ng (1 250 ng, 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng,

25 ng, 10 ng, 5 ng et 1 ng). Pour la détermination de la précision, des génotypes de l’échantillon ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel par la méthode de Sanger. Les limites supérieure et inférieure identifiées pour une entrée d’ADN sont respectivement de 1 250 ng et 25 ng, car elles présentaient un débit au premier passage ≥ 95 % sans aucun appel incorrect (précision et débit d’appel de 100 %).

Les entrées d’ADN de 1 250 ng, 250 ng et 100 ng ont fait l’objet d’autres tests avec quatre échantillons d’ADN représentatifs et 20 réplicats par niveau d’entrée d’ADN pour chaque échantillon (n = 4 × 20 = 80 échantillons), tandis que la limite inférieure de 25 ng a été testée avec 14 échantillons, 20 réplicats pour chaque échantillon

(n = 14 × 20 = 280 échantillons). Le débit au premier passage de l’échantillon et le taux de précision était de 100 % à tous les niveaux d’entrée d’ADN et les débits d’appel de l’échantillon étaient > 99 %.

Substances interférentes

Pour évaluer l’impact des substances interférentes sur la plateforme MiSeqDx, un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases a été évalué en présence et en l’absence d’interférences potentielles. Huit échantillons de sang total représentant huit génotypes uniques ont été utilisés dans l’étude. Quatre substances interférentes endogènes

(bilirubine, cholestérol, hémoglobine et triglycérides) ont été testées en les intégrant dans les échantillons de sang total avant l’extraction d’ADN. Pour évaluer l’interférence résultant du prélèvement sanguin (petit volume), de l’EDTA a été intégré dans des échantillons de sang à deux concentrations. Les limites de concentration pour chaque substance sont indiquées dans le tableau ci-dessous. En outre, afin d’évaluer les interférences résultant de la préparation des

échantillons, on a ajouté 15 % de tampon de lavage à huit ADN génomiques purifiés. Un débit d’appel de 100 % a été atteint pour tous les échantillons testés en plus des 100 % de reproductibilité dans les typages génotypiques entre les

échantillons en présence et en l’absence de substances interférentes.

Février 2015

Référence 15039608, rév. B FRA

Trousse universelle MiSeqDx 1.0

Substance de test

Bilirubine

Cholestérol

Hémoglobine

Triglycéride

EDTA

Nombre total de réplicats

Concentration analysée dans le sang

(limite supérieure)

684 µmol/l

13 mmol/l

2 g/l

37 mmol/l

7 mg/ml

Concentration analysée dans le sang

(limite inférieure)

137 µmol/l

2,6 mmol/l

0,4 g/l

7,4 mmol/l

2,8 mg/ml

Débit d’appel

100 %

Indexage de l’échantillon

Des primers d’indexage de l’échantillon sont utilisés dans la trousse pour attribuer un code à barres unique à chaque

échantillon d’ADN, permettant de grouper plusieurs échantillons en une seule analyse de séquençage.

Un total de 96 index d’échantillons a été analysé à l’aide d’un test représentatif conçu pour étudier un seul gène couvrant 11 529 bases grâce à huit échantillons d’ADN unique pour vérifier la capacité du test à faire systématiquement un appel de génotypage pour un échantillon donné à travers des combinaisons différentes de primers d’indexage.

Chaque échantillon a été analysé avec 12 combinaisons différentes de primers d’indexage. Quarante-huit (48) combinaisons d’index ont été testées en une seule analyse de séquençage. Les résultats des échantillons ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel de Sanger pour l’ensemble des positions/variants. La reproductibilité et la précision ont été de 100 % pour toutes les combinaisons de primers d’indexage/échantillon.

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Trousse universelle 1.0 MiSeqDx

Nº de référence DX-103-1001 : deux analyses, jusqu’à 96 échantillons par trousse

Utilisation prévue

Principes procéduraux

Préparation de la librairie

Séquençage

Analyse

Limites de la procédure

Composants du produit

Réactifs

Réactifs fournis

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 1

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 2

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 3

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 4

Trousse universelle MiSeqDx 1.0, boîte 5

Réactifs nécessaires, non fournis

Pool d’oligos personnalisé

Réactifs de pré-amplification

Réactifs de post-amplification

Stockage et manipulation

Équipement et matériel

Équipement et matériels fournis, vendus séparément

Équipement et matériel nécessaires, non fournis

Équipement et matériel de pré-amplification

Équipement et matériel de post-amplification

Prélèvement, transport et stockage des échantillons

Avertissements et précautions

Notes procédurales

Débit d’échantillons et représentation d’index

Séquences de primers d’index

Mode d’emploi

Préparation de la feuille d’échantillons MiSeqDx

Entrer des renseignements sur l’échantillon

Hybridation du pool d’oligonucléotides

Préparation

Procédure

Retrait des oligonucléotides non liés

Préparation

Procédure

Extension-ligation des oligonucléotides liés

Procédure

Amplification PCR

Préparation

Procédure

Nettoyage PCR

Préparation

Procédure

Normalisation de librairie

Préparation

Procédure

Groupement de librairies

Préparer le groupement de librairies

Préparer une nouvelle dilution de NaOH

Dénaturer et diluer le Contrôle interne PhiX

Préparer la cartouche de réactifs

Inspecter la cartouche de réactifs

Préparer des échantillons pour le séquençage

Charger des librairies d’échantillons sur la cartouche

Procédures de contrôle qualité

Caractéristiques de performance

Précision

Étude 1

Étude 2

Reproductibilité

Étude 1

Étude 2

Extraction d’ADN

Entrée d’ADN

Substances interférentes

Indexage de l’échantillon

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Coordonnées

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