Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDxMD DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT Nº de référence DX-102-1001 : six analyses, jusqu’à 48 échantillons par trousse Utilisation prévue Le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina est un système destiné au diagnostic par séquençage in vitro qui reséquence des régions de codage de protéine et des limites intron/exon du gène régulateur de la perméabilité transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) dans l’ADN génomique isolé à partir d’échantillons de sang total périphérique humain collecté dans le K2EDTA. Le test détecte les variants à simple nucléotide et les petits indels au sein de la région séquencée, et fournit également des rapports sur deux mutations introniques profondes ainsi que deux grandes délétions. Le test est destiné à être utilisé sur l’instrument MiSeqDx d’Illumina. Le test est destiné à être utilisé pour faciliter le diagnostic des personnes soupçonnées d’avoir la fibrose kystique (FK). Ce test est plus approprié lorsque le patient présente une fibrose kystique atypique ou non classique ou lorsque d’autres panels de mutation n’ont pas permis d’identifier les deux mutations étiologiques. Les résultats de ce test doivent être interprétés par un généticien moléculaire clinicien diplômé ou équivalent et doivent être utilisés avec les autres renseignements cliniques et de laboratoire disponibles, y compris les symptômes cliniques, d’autres tests de diagnostic et les antécédents familiaux. Ce test n’est pas indiqué pour être utilisé à des fins de diagnostic autonome, pour les tests de diagnostic fœtal, les tests pré-implantatoires, le dépistage du porteur du gène, le dépistage néonatal ou le dépistage de population. Résumé et explication du test Description clinique La fibrose kystique (FK) est l’un des troubles génétiques les plus courants du monde occidental et le trouble autosomique récessif mortel le plus répandu au sein de la population blanche non hispanique1-5. La FK influe sur la viscosité des sécrétions de mucus et affecte l’épithélium des voies respiratoires, le pancréas, l’intestin, le système hépatobiliaire, l’appareil génital masculin et les glandes sudoripares, entraînant une maladie complexe touchant différents organes2-4; les poumons sont le premier système organique associé à la morbidité et à la mortalité6. Dans de nombreux cas, un trouble nutritionnel laisse présager une progression de l’atteinte des poumons liée à la FK. Un point clé des efforts d’intervention actuels est le diagnostic précoce par le biais d’un dépistage néonatal5. L’individu a ainsi accès aux soins dès son plus jeune âge et l’évolution de la maladie peut être mieux contrôlée2,5. Même si le sexe influe sur les chances de survie (l’espérance de vie médiane étant plus élevée chez les hommes que chez les femmes), l’espérance de vie médiane globale est de 38,3 années aux États-Unis6. Variants CFTR et incidence Le gène régulateur de la perméabilité transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), identifié en 1989, est situé sur le bras long du chromosome 7 et contient 27 exons codants répartis sur 230 kb2. Un ARNm de 6,5 kb produit par un allèle normal code le CFTR, une protéine intrinsèque de l’amino-acide 1 490 qui fonctionne comme un canal chlorure régulé dans les cellules épithéliales de nombreux organes2,3. Plus de 1 900 variants du CFTR sont actuellement décrits, la majorité étant des mutations ponctuelles7. Le variant CFTR le plus courant est l’allèle F508del3, qui représente presque 70 % de tous les variants CFTR1. Cependant, d’autres variants CFTR courants se traduisent souvent par un phénotype de fibrose kystique ou des troubles liés au CFTR1-3. Les estimations de l’incidence et de la prévalence de la fibrose kystique sont respectivement d’une naissance sur 2 000 à 4 000 et d’environ 30 000 individus aux États-Unis2. Toutes les ethnies sont touchées, à des fréquences variables : Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA |1 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 1 sur 3 000 Caucasiens; 1 sur 9 200 Hispano-Américains; 1 sur 10 900 Amérindiens; 1 sur 15 000 Afro-Américains et un sur 31 000 Asio-Américains2,4. Cependant, retracer l’ethnie des individus atteints devient de plus en plus compliqué8. Les estimations actuelles de la fréquence d’un porteur de mutation du gène CFTR par groupe ethnique aux États-Unis, basées sur une cohorte de 364 890 individus faisant l’objet d’un test de dépistage et sans antécédents familiaux de fibrose kystique sont fournies dans le Tableau 1. Tableau 1 Fréquence générale des porteurs de la mutation de la fibrose kystique au sein de différents groupes ethniques aux États-Unis9 Groupe ethnique Fréquence des porteurs observée Afro-Américains 1 sur 84 Juifs ashkénazes 1 sur 29 Asiatiques 1 sur 242 Caucasiens 1 sur 28 Hispaniques 1 sur 59 Juifs 1 sur 32 Moyen-Orientaux 1 sur 91 Amérindiens 1 sur 70 Sud-asiatiques 1 sur 118 Autre groupe ethnique 1 sur 111 Ethnicité > 1 1 sur 34 En partie afro-américains 1 sur 56 En partie caucasiens 1 sur 32 En partie hispaniques 1 sur 51 Non indiqué 1 sur 37 Tous les individus 1 sur 38 Conception du test Toutes les régions de codage de protéine dans le gène CFTR, dont 10 nt de séquence intronique adjacente, sont détectées pour tous les exons à l’exception de trois (exons 7, 10 et 20). Pour l’exon 7 et l’exon 10, seuls 5 nt de séquence intronique adjacente sont inclus à l’extrémité 5’ de l’exon pour éviter des indels homopolymériques proches. Pour l’exon 20, 30 nt de séquence intronique adjacente sont inclus à l’extrémité 5’ de l’exon pour activer la détection de la mutation 3272-26A > G. En outre, le test détecte également ~100 nt de séquence adjacente au 5’ UTR et 3’ UTR, deux mutations introniques profondes (1811 + 1,6kbA > G, 3 489 + 10kbC > T), deux grandes délétions (CFTRdele2, 3, CFTRdele22, 23) et la région PolyTG/Poly. La couverture complète du test est indiquée dans les positions des coordonnées génomiques énumérées dans le Tableau 2. REMARQUE : Il existe des limites à la détection de délétions au niveau des emplacements génomiques spécifiques au sein des régions séquencées de ce test (voir la section Limites de la procédure à la page 5). Tableau 2 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Couverture des coordonnées génomiques 2 Début des coordonnées Fin des coordonnées génomiques génomiques hg19 (chr7) hg19 (chr7) CFTR_Exon 1 117120041 117120211 171 CFTR_Exon 2 117144297 117144427 131 CFTR_Exon 3 117149078 117149206 129 | Référence 15038344 rév. C FRA Longueur (paire de bases) Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Début des coordonnées Fin des coordonnées génomiques génomiques hg19 (chr7) hg19 (chr7) CFTR_Exon 4 117170943 117171178 236 CFTR_Exon 5 117174320 117174429 110 CFTR_Exon 6 117175292 117175475 184 CFTR_Exon 7^ 117176597 117176737 141 CFTR_Exon 8 117180144 117180410 267 CFTR_Exon 9 117182060 117182172 113 CFTR_Exon 10^ 117188690 117188887 198 CFTR_Exon 11 117199508 117199719 212 CFTR_Exon 12 117227783 117227897 115 CFTR_Intron 12* 117229516 117229526 11 CFTR_Exon 13 117230397 117230503 107 CFTR_Exon 14 117231978 117232721 744 CFTR_Exon 15 117234974 117235122 149 CFTR_Exon 16 117242870 117242927 58 CFTR_Exon 17 117243576 117243846 271 CFTR_Exon 18 117246718 117246817 100 CFTR_Exon 19 117250563 117250733 171 CFTR_Exon 20 # 117251605 117251872 268 CFTR_Exon 21 117254657 117254777 121 CFTR_Exon 22 117267566 117267834 269 CFTR_Intron 22* 117280010 117280020 11 CFTR_Exon 23 117282482 117282657 176 CFTR_Exon 24 117292886 117292995 110 CFTR_Exon 25 117304732 117304924 193 CFTR_Exon 26 117305503 117305628 126 CFTR_Exon 27 117306952 117307262 311 Nombre total de bases Mars 2015 Longueur (paire de bases) 5 203** Référence 15038344 rév. C FRA |3 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx ^ Pour l’exon 7 et l’exon 10, seuls 5 nt de séquence intronique adjacente sont inclus en amont de l’exon pour éviter les tronçons homopolymériques dans ces régions. Dans le cas de l’exon 10, il s’agit de la région PolyT/Poly TG dans l’intron 9. Cette région est traitée spécifiquement et séparément. * Pour les mutations introniques profondes, 5 nucléotides adjacents de chaque côté des SNV sont également inclus. # Pour l’exon 20, 30 nt de séquence intronique adjacente sont inclus à l’extrémité 5’ de l’exon pour activer la détection de la mutation 3272-26A > G. ** En comptant les deux grandes délétions et les régions PolyTG/PolyT, le total des positions/régions est de 5 206. Principes procéduraux Le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina implique deux procédures principales. La première procédure, appelée préparation de la librairie, consiste à préparer les échantillons à séquencer. La préparation de la librairie comporte quatre étapes clés : l’hybridation, l’extension-ligation, l’amplification par PCR et la normalisation de librairie. La deuxième procédure permet de séquencer l’échantillon préparé en utilisant la chimie SBS (séquençage par synthèse) sur le MiSeqDx. Préparation de la librairie A B C D 4 Hybridation : la première étape, l’hybridation, hybride un groupe d’oligonucléotides en amont et en aval spécifiques au Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx en échantillon d’ADN génomique. À la fin de ce processus, une procédure de lavage en trois étapes avec un filtre capable de sélectionner la taille retire les oligonucléotides non liés de l’ADN génomique. Extension-ligation : la deuxième étape, l’extension-ligation, connecte les oligonucléotides en amont et en aval hybridés. Une ADN polymérase s’étend de l’oligonucléotide en amont jusqu’à la région ciblée, suivie d’une ligation à l’extrémité 5’ de l’oligonucléotide en aval en utilisant une ADN ligase. Le résultat est la formation de produits contenant des oligonucléotides spécifiques à la FK bordés de séquences nécessaires pour l’amplification. Amplification par PCR : la troisième étape, l’amplification par PCR, amplifie les produits de l’extension-ligation à l’aide des primers qui ajoutent les séquences d’indexage pour le multiplexage des échantillons, tout comme les adaptateurs courants nécessaires à la génération d’amplifiats sur le MiSeqDx. À la fin de ce processus, une procédure de nettoyage de PCR purifie les produits PCR (désignés comme une librairie). Normalisation de librairie : la dernière étape, la normalisation de librairie, normalise la quantité de chaque librairie pour assurer une représentation plus égale dans la dernière librairie regroupée. À la fin de ce processus, la librairie regroupée est chargée dans le MiSeqDx pour le séquençage à l’aide de la chimie SBS. | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Séquençage La chimie SBS utilise une méthode basée sur des terminateurs réversibles pour détecter les bases à simple nucléotide à mesure qu’elles sont intégrées aux brins d’ADN croissants. Pendant chaque cycle de séquençage, un seul triphosphate de déoxynucléotide (dNTP) marqué par fluorescence est ajouté à la chaîne d’acide nucléique. Le marquage du nucléotide sert de terminateur pour la polymérisation. Ainsi, après chaque incorporation de dNTP, le marqueur fluorescent est imagé pour identifier la base, puis enzymatiquement clivée pour permettre l’incorporation du nucléotide suivant. Étant donné que les quatre dNTP liés à des terminateurs réversibles (A, G, T, C) sont tous présents comme molécules seules et séparées, la compétition naturelle minimise le biais lié à l’incorporation. Les définitions des bases sont effectuées directement à partir des mesures d’intensité de signal pendant chaque cycle de séquençage. Le résultat est le séquençage base par base. Analyse des données MiSeq Reporter traite les définitions des bases générées pendant l’analyse primaire et fournit des renseignements sur chaque échantillon, en fonction des renseignements spécifiés sur la feuille d’échantillons, appelée analyse secondaire. L’analyse secondaire comprend le démultiplexage, la génération de fichiers FASTQ, l’alignement, l’appel des variants et la génération de fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants CFTR à des positions spécifiques dans le génome de référence. • Démultiplexage : si la feuille d’échantillons répertorie plusieurs échantillons et que l’analyse présente des lectures d’index, alors le démultiplexage est la première étape dans l’analyse secondaire. Le démultiplexage sépare les données d’échantillons regroupés basées sur les index de séquence unique qui ont été ajoutés au cours de l’étape d’amplification par PCR. • Génération de fichiers FASTQ : après le démultiplexage, MiSeq Reporter génère des fichiers intermédiaires au format FASTQ, qui est un format texte utilisé pour représenter des séquences. Les fichiers FASTQ contiennent les lectures pour chaque échantillon ainsi que les scores de qualité, à l’exclusion des lectures provenant de tout amplifiat qui n’est pas passé par le filtre. • Alignement : l’alignement compare les séquences par rapport à la référence pour identifier une relation entre les séquences et attribue un score en fonction des régions de similarité. Les lectures alignées sont écrites dans des fichiers au format BAM. MiSeq Reporter utilise un algorithme de Smith-Waterman par bande, qui effectue des alignements de séquence locaux pour identifier des régions similaires entre deux séquences. • Appel des variants : cette étape enregistre des variants mononucléotides (SNV), des insertions et des délétions (indels), et autres variants structurels dans un fichier texte standardisé et analysable appelé MiSeqDxCFClinicalSequencingAssay.txt. Pour plus de renseignements, consultez la section Fichier de rapport d’analyse dans le Guide de l’utilisateur de MiSeq Reporter (nº 15038356). Limites de la procédure 1 2 Le test séquence les régions suivantes dans le gène CFTR : a Les régions de codage de protéine du gène CFTR à travers 27 exons b Entre 5 et 10 bases de séquence intronique adjacente c Une centaine de nucléotides de séquence intronique des régions non traduites 5’ et 3’ d Deux mutations profondes introniques (1 811 + 1,6 kbA>G, 3 489 + 10 kbC>T) e La séquence PolyTG/PolyT située dans l’intron 9 f Un total de 5 206 positions/régions des possibles 188 702 paires de bases du gène. Destiné au diagnostic in vitro. Les résultats obtenus à l’aide du Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina doivent être utilisés et interprétés dans le contexte d’une évaluation clinique complète. Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA |5 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 3 4 5 Le test est conçu pour séquencer les régions de codage de protéine et les limites intron/exon du gène CFTR et n’inclut pas toutes les régions introniques et les grandes délétions. Ainsi, un résultat global de « type sauvage » ne garantit pas que les autres mutations/variants du régulateur de perméabilité transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) ne sont pas présents dans les échantillons analysés. — Le test est conçu pour détecter deux grandes délétions spécifiques : CFTRdele2,3 et CFTRdele22,23. Le test ne peut pas détecter ou générer de rapport sur d’autres délétions importantes. Ce test est uniquement validé pour les insertions et délétions, jusqu’à et y compris une taille de 3 bp. Toutes les insertions/délétions sont alignées à gauche dans les régions homopolymériques ou alignées à droite suivant la nomenclature HGVS. Par exemple, le variant c.313delA (avec le contexte de séquence GAATC) est identifié comme une délétion G-ATC, mais la délétion est signalée dans dbSNP en tant que délétion GA-TC. Les seules exceptions sont les 135 variants de la fibrose kystique répertoriés dans le CFTR2 comme responsables de la maladie (d’après la version de base de données du 04/10/2012). Tous les indels dans les régions homopolymériques au sein de cette série de variants sont rapportés comme correspondant au rapport de variants attendu selon le CFTR210. Le test est limité dans la détection des délétions à des emplacements génomiques spécifiques au sein des régions séquencées. Les coordonnées génomiques dont le test ne peut pas rapporter les délétions sont répertoriées dans le Tableau 3. Le test ne peut pas détecter les délétions dont la ou les bases se situent dans la colonne des limites. Tableau 3 Coordonnées génomiques où les délétions ne peuvent pas être détectées 6 Région de gène CFTR Coordonnées génomiques hg19 (chr7) CFTR_Exon1 117120041; 117120211 CFTR_Exon3 117149091 CFTR_Exon4 117170953-117170954*; 117171082 CFTR_Exon5 117174362 CFTR_Exon6 117175417 CFTR_Exon7 117176621 CFTR_Exon8 117180176-117180177* CFTR_Exon9 117182126 CFTR_Exon10 117188771 CFTR_Exon11 117199544-117199545*; 117199697 CFTR_Exon12 117227802 CFTR_Exon14 117232106-117232107*; 117232466-117232467*; 117232609 CFTR_Exon17 117243705; 117243843 CFTR_Exon18 117246751 CFTR_Exon19 117250688 CFTR_Exon20 117251788 CFTR_Exon22 117267721 CFTR_Exon23 117282597 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Région de gène CFTR Coordonnées génomiques hg19 (chr7) CFTR_Exon24 117292953 CFTR_Exon25 117304740-117304741*; 117304869 CFTR_Exon26 117305518 CFTR_Exon27 117307178 * Seules les délétions incluant les deux bases répertoriées ici ne peuvent pas être détectées. Par exemple, dans Exon8, seules les délétions ≥ 2 bp incluant des bases au niveau des coordonnées génomiques 117180176 et 117180177 ne peuvent pas être détectées. Une délétion de base unique à 117180176 ou 117180177 ne peut pas être détectée. a b Si les coordonnées concernées répertoriées dans le Tableau 3 sont la base située la plus à gauche d’une région homopolymérique, une délétion à n’importe quelle autre position au sein du tronçon homopolymérique ne pourra pas être détectée, parce qu’elle ne pourra pas se distinguer d’une délétion au niveau des coordonnées concernées. Le test ne peut pas détecter un total de cinq variants répertoriés dans la base de données clinique ClinVar (version de la base de données consultée en décembre 2014). Ces cinq variants spécifiques figurent dans le Tableau 4. La limite de ce test n’a aucune incidence sur les variants répertoriés dans la base de données sur la fibrose kystique, CFTR2 (version de la base de données en date du 04/10/2012). Tableau 4 Variants connus non détectés par le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx^ Référence du Identifiant Région de gène Emplacement génomique Nom d’ADNc Nom de protéine variant ClinVar CFTR (chr 7) (HGVS) (HGVS) 1 RCV000046424 CFTR_Exon3 117149091 c.168delA p.Glu56Aspfs rs397508269 2 RCV000046687 CFTR_Exon17 117243703-117243704* c.2775_2776delTT p.Leu926Alafs rs397508433 3 RCV000046688 CFTR_Exon17 117243705 c.2777delT p.Leu926Cysfs rs397508434 4 RCV000046782 CFTR_Exon19 117250690* c.3106delA p.Thr1036Profs rs397508497 5 RCV000046857 CFTR_Exon20 117251789* c.3294delG p.Trp1098Cysfs rs397508534 Identifiant rs ^ Aucune donnée de fréquence n’était disponible pour les variants. * Dans ces cas, les coordonnées concernées tombent dans une région homopolymérique. 6 7 8 Les variants identifiés par le biais de ce test varient en fréquence parmi les différentes populations. Il n’est pas possible de valider toutes les combinaisons de variants qui peuvent être détectées dans le gène CFTR à l’aide de ce test. Il est recommandé que des variants nouveaux et rares soient confirmés par l’utilisateur à l’aide d’une méthode de référence validée. Comme avec n’importe quel test à base d’hybridation, les polymorphismes, mutations, insertions ou délétions sous-jacentes dans les régions de liaison d’un oligonucléotide peuvent affecter les allèles sondés et, par conséquent, les appels faits. Pour les variants complexes où une délétion et une insertion se produisent sur le même site, le test peut rapporter cela comme deux variants à proximité immédiate l’un de l’autre. La mise en phase des variants n’est pas évaluée et il est impératif d’envisager d’autres solutions possibles pour la séquence détectée. Consultez le Tableau 5 pour voir un exemple de variant complexe de cette nature. Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA |7 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Tableau 5 Exemple de variant complexe 9 Contexte de la séquence (référence) GAAGAAATT Séquence observée pour le variant GAAT – – ATT Variant attendu Délétion de GAA, insertion de T (les deux changements sur le même chromosome) Variant(s) rapporté(s) par le test SNP (G>T); Délétion de AA Si deux variants ou plus sont identifiés pour un échantillon, il est recommandé que l’utilisateur vérifie le résultat en répétant l’échantillon à l’aide du Système de l’instrument avec un nouvel extrait d’ADNg pour écarter une contamination croisée de l’échantillon. REMARQUE Une mise en phase de l’haplotype doit être envisagée lorsque deux variants ou plus sont détectés. Ce test ne peut pas déterminer s’il existe des variants en cis/trans par rapport à d’autres variants. 10 Le test ne permet pas de déterminer si l’orientation du variant PolyTG/PolyT est en cis/trans par rapport à d’autres variants. Pour les patients présentant un variant R117H, des tests supplémentaires doivent être effectués pour déterminer si un variant PolyTG/PolyT, pouvant affecter le phénotype clinique (p. ex., 12-13(TG) ou 5T), présente une orientation cis/trans. PolyTG/PolyT sont des régions homopolymériques difficiles à séquencer en raison du glissement de la polymérase. 11 Ce test s’exécute uniquement dans un format 8-plex. Si six échantillons cliniques ne sont pas disponibles, à l’exclusion des contrôles positifs et négatifs, vous pouvez alors inclure d’autres échantillons d’ADN génomique humain pour compléter l’analyse. Composants du produit La plateforme MiSeqDx d’Illumina comprend les composants suivants : • Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx (nº de référence DX-102-1001) • Instrument MiSeqDx (nº de référence DX-410-1001) Réactifs Réactifs fournis Les réactifs pour le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina (catalogue nº DX-102-1001) sont fournis par Illumina. Cette trousse a été configurée pour six analyses avec un maximum de huit échantillons par analyse (jusqu’à 48 échantillons au total). Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx, boîte 1 Tableau 6 Boîte 1A : réactifs de pré-amplification Composant Quantité Tests de séquençage clinique 1 tube Volume de remplissage 600 µl de la fibrose kystique : pool Ingrédients actifs Stockage Solution aqueuse tamponnée contenant des oligonucléotides ciblant le -25 °C à -15 °C gène CFTR d’oligos Tampon d’hybridation 1 tube Mélange extension-ligation 1 tube 4,32 ml 4,8 ml Solution aqueuse tamponnée contenant des sels et du formamide -25 °C à -15 °C Solution aqueuse tamponnée contenant un mélange exclusif d’ADN -25 °C à -15 °C polymérases, de ligase ADN et des dNTP 8 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Volume de Composant Quantité Primers d’index C (A503), D 1 tube par (A504) et E (A505) primer Primers d’index 1 (A701), 2 1 tube par (A702) et 10 (A710) primer Polymérase PCR 1 tube 56 µl ADN polymérase exclusive -25 °C à -15 °C Mélange maître PCR 1 tube 2,8 ml Solution aqueuse tamponnée contenant des sels et des dNTP -25 °C à -15 °C remplissage 192 µl Ingrédients actifs Stockage Primers PCR avec des séquences d’indexage et des adaptateurs de -25 °C à -15 °C séquençage Primers PCR avec des séquences d’indexage et des adaptateurs de 128 µl -25 °C à -15 °C séquençage Tableau 7 Boîte 1B : réactifs de post-amplification Volume de Composant Quantité Ingrédients actifs Diluant de normalisation de 1 tube 4,6 ml 1 tube 4,5 ml Solution aqueuse tamponnée -25 °C à -15 °C 1 tube 10 µl Solution aqueuse tamponnée contenant l’ADN génomique PhiX -25 °C à -15 °C remplissage Solution aqueuse tamponnée contenant des sels, du 2-mercaptoéthanol et -25 °C à -15 °C librairie Tampon de dilution de Stockage du formamide librairie Contrôle interne PhiX Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx, boîte 2 Tableau 8 Boîte 2 : réactifs de post-amplification Composant Quantité Contenu Stockage Cartouche de réactifs 6 cartouches Cartouche à usage unique contenant des réactifs pour la génération -25 °C à -15 °C MiSeqDx : test de séquençage d’amplifiats et le séquençage à utiliser avec le MiSeqDx, comprenant du clinique de la fibrose kystique formamide, du 2-mercaptoéthanol et < 2 % de DMSO Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx, boîte 3 Tableau 9 Boîte 3A : réactifs de pré-amplification Volume de Composant Quantité Tampon de lavage rigoureux 1 flacon 24 ml Tampon de lavage universel 1 tube 4,8 ml remplissage Ingrédients actifs Stockage Solution aqueuse tamponnée contenant des sels, du 2-mercaptoéthanol et 2 °C à 8 °C du formamide Solution aqueuse tamponnée contenant des sels 2 °C à 8 °C Tableau 10 Boîte 3B : réactifs de post-amplification Composant Quantité Billes de nettoyage PCR 1 tube Volume de remplissage 5 ml Ingrédients actifs Stockage Solution aqueuse tamponnée contenant des billes paramagnétiques en 2 °C à 8 °C phase solide et du polyéthylène glycol Lavage de normalisation de 2 tubes 4,8 ml librairie Billes de librairie Solution aqueuse tamponnée contenant des sels, du 2-mercaptoéthanol 2 °C à 8 °C et du formamide 1 tube 1,2 ml Solution aqueuse tamponnée contenant des billes paramagnétiques en 2 °C à 8 °C phase solide Flow Cell MiSeqDx : test de 6 conteneurs 1 Flow Cell Substrat en verre avec des oligonucléotides liés par covalence 2 °C à 8 °C séquençage clinique de la fibrose kystique Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA |9 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx, boîte 4 Tableau 11 Boîte 4 : réactifs de post-amplification Composant Quantité Solution SBS MiSeqDx (PR2) 6 flacons Volume de remplissage 353,1 ml Ingrédients actifs Stockage Solution aqueuse tamponnée 2 °C à 8 °C : test de séquençage clinique de la fibrose kystique Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx, boîte 5 Tableau 12 Boîte 5 : réactifs de pré-amplification Composant Quantité Plaque filtrante 6 plaques Volume de remplissage S.O. Ingrédients actifs Stockage Plaque de microtitration en polypropylène avec une membrane en 15 °C à 30 °C polyéthersulfone modifiée Tableau 13 Boîte 5 : réactifs de post-amplification Composant Quantité Volume de remplissage Ingrédients actifs Stockage Tampon d’élution 1 tube 4,8 ml Solution aqueuse tamponnée 15 °C à 30 °C Tampon de stockage de 1 tube 3,5 ml Solution aqueuse tamponnée 15 °C à 30 °C librairie Réactifs nécessaires, non fournis Réactifs de pré-amplification • 10 N NaOH (préparez à partir de comprimés ou utilisez une solution standard) • Tampon TE • Eau sans DNase/RNase Réactifs de post-amplification • • • • 10 N NaOH (préparez à partir de comprimés ou utilisez une solution standard) Éthanol 200 pour la biologie moléculaire Tampon TE Eau sans DNase/RNase Stockage et manipulation 1 2 10 La température ambiante correspond à une température de 15 °C à 30 °C. Les réactifs suivants sont expédiés congelés et sont stables lorsqu’ils sont stockés entre -25 °C et -15 °C jusqu’à la date de péremption indiquée. — Tests de séquençage clinique de la fibrose kystique : pool d’oligos — Tampon d’hybridation — Mélange extension-ligation — Primers d’index C (A503), D (A504) et E (A505) — Primers d’index 1 (A701), 2 (A702) et 10 (A710) — Polymérase PCR — Mélange maître PCR — Diluant de normalisation de librairie — Tampon de dilution de librairie | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx — Contrôle interne PhiX — Cartouche de réactifs MiSeqDx : test de séquençage clinique de la fibrose kystique Excepté pour la cartouche de réactifs, les réactifs sont stables pendant un maximum de six cycles de congélation/décongélation qui peuvent se produire avant la date de péremption indiquée. Ne recongelez pas la cartouche de réactifs après qu’elle a été décongelée. Elle peut être conservée pendant un maximum de 6 heures entre 2 °C et 8 °C. 3 Les réactifs suivants sont expédiés réfrigérés et sont stables lorsqu’ils sont stockés entre 2 °C et 8 °C jusqu’à la date de péremption indiquée. — Tampon de lavage rigoureux — Tampon de lavage universel — Billes de nettoyage PCR — Billes de librairie — Lavage de normalisation de librairie — Solution SBS MiSeqDx (PR2) : test de séquençage clinique de la fibrose kystique — Flow Cell MiSeqDx : test de séquençage clinique de la fibrose kystique 4 Les réactifs suivants sont expédiés à température ambiante et sont stables lorsqu’ils sont stockés à température ambiante jusqu’à la date de péremption indiquée. — Tampon d’élution — Plaque filtrante — Tampon de stockage de librairie 5 Les changements dans l’apparence physique des réactifs fournis peuvent indiquer la détérioration des matières. Si des changements dans l’apparence physique se produisent (p. ex. des changements apparents de la couleur des réactifs ou une trace de voile apparente montrant une contamination microbienne), n’utilisez pas les réactifs. 6 Les réactifs du Tampon d’hybridation, du Tampon de lavage rigoureux et du Diluant de normalisation de librairie peuvent former des précipités ou des cristaux visibles. Avant l’utilisation, secouez vigoureusement à l’aide d’un agitateur vortex, puis inspectez visuellement pour vous assurer qu’il n’y ait aucun précipité. 7 Suivez à la lettre les meilleures pratiques suivantes lors de la manipulation des Billes de nettoyage PCR et des Billes de librairie : — Les billes ne doivent jamais être congelées. — Laissez les billes atteindre la température ambiante. — Immédiatement avant l’utilisation, mélangez vigoureusement à l’aide d’un agitateur vortex jusqu’à obtenir une suspension adéquate et que la couleur apparaisse homogène. — Mélangez bien l’échantillon après que les billes ont été ajoutées en pipettant de haut en bas 10 fois. Un agitateur peut être utilisé pour bien mélanger les échantillons. — Incubez le mélange bille/échantillon à température ambiante pendant la durée totale indiquée. — Suivez les instructions lorsque vous utilisez un support magnétique. Attendez que la solution soit claire avant d’aspirer. Gardez la plaque sur le support magnétique lorsque vous aspirez doucement le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger les billes séparées. 8 La plaque d’amplification PCR peut rester sur le thermocycleur toute la nuit, ou elle peut être conservée entre 2 °C et 8 °C pendant un maximum de deux jours. Avant le stockage de la plaque entre 2 °C et 8 °C, scellez-la bien. 9 Ne congelez pas les Billes de librairie ou ne les mélangez pas au réactif du Diluant de normalisation de librairie si elles ne sont pas utilisées immédiatement. 10 La plaque de normalisation de librairie terminée peut être conservée entre -25 °C et -15 °C pendant un maximum de trois jours. 11 La librairie d’amplicons regroupés peut être conservée entre -25 °C et -15 °C pendant un maximum de trois jours. Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 11 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 12 Chargez immédiatement le groupe d’amplicons fraîchement dilués dans la cartouche de réactifs. Le stockage du groupe d’amplicons dilués peut entraîner une réduction considérable de la densité des amplifiats. Équipement et matériel Équipement et matériels fournis, vendus séparément 1 2 3 4 Instrument MiSeqDx, nº de référence DX-410-1001 Trousse de montage de plaque d’index TruSeq, nº de référence FC-130-1005 Trousse de montage de plaque d’index TruSeq et de collier, nº de référence FC-130-1007 Bouchons de rechange pour l’adaptateur d’index, nº de référence DX-502-1003 Équipement et matériel nécessaires, non fournis Équipement et matériel de pré-amplification 1 2 3 4 5 Bloc chauffant : un bloc chauffant pour une plaque à 96 puits est nécessaire. Le bloc chauffant doit être conforme aux spécifications de performance suivantes : vous pouvez utiliser des blocs chauffants avec couvercles chauffés. — Plage de températures : ambiante +5 °C à 99 °C — Régulation de température : ±0,1 °C à 37 °C; ±0,4 °C à 60 °C Incubateur d’échantillons : un incubateur (four à hybridation) est nécessaire. L’incubateur doit être conforme aux spécifications de performance suivantes : — Plage de températures : 10 °C à 100 °C — Régulation de température : ±0,2 °C Centrifugeuse de table : une centrifugeuse de table pouvant maintenir une température de 20 °C est nécessaire. (une centrifugeuse séparée est nécessaire dans la zone de post-amplification). Vous pouvez utiliser n’importe quelle centrifugeuse pour plaques atteignant les vitesses indiquées par le protocole (280 à 2 400 × g). Pipettes de précision : un ensemble de pipettes de précision est nécessaire. (Un ensemble séparé est nécessaire dans la zone de post-amplification). L’utilisation de pipettes de précision est nécessaire pour s’assurer d’une distribution précise des réactifs et des échantillons. Les pipettes monocanal ou multicanaux peuvent être utilisées si elles sont étalonnées régulièrement et sont précises à moins de 5 % du volume indiqué. Consommables : les consommables suivants sont nécessaires. — Plaques PCR à jupe à 96 puits, 0,2 ml, en polypropylène ou équivalent — Plaques de stockage à 96 puits, 0,8 ml (plaques MIDI) — Bassin de solution, sans PVC ni ADNase/ARNase (cuve) — Opercule adhésif en aluminium — Joint de plaque PCR approprié — Pointes de pipette résistantes à l’aérosol Équipement et matériel de post-amplification 1 2 12 Thermocycleur : un thermocycleur est nécessaire. Le thermocycleur doit avoir un couvercle chauffé et respecter les spécifications de performance suivantes : — Plage de contrôle de la température : 4 °C à 99 °C — Précision du contrôle : ±0,25 °C de 35 °C à 99 °C Agitateur pour microplaques : un agitateur pour microplaques est nécessaire dans la zone du laboratoire de post-amplification. L’agitateur pour microplaques doit être conforme aux spécifications de performance suivantes : — Vitesse de mélange maxi. : 3 000 tr/min — Plage de vitesses de mélange : 200 à 3 000 tr/min | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 3 4 5 6 7 Centrifugeuse de table : une centrifugeuse de table pouvant maintenir une température de 20 °C est nécessaire. (Une centrifugeuse séparée est nécessaire dans la zone de pré-amplification.) Vous pouvez utiliser n’importe quelle centrifugeuse pour plaques atteignant les vitesses indiquées par le protocole (280 à 2 400 × g). Bloc chauffant : un bloc chauffant pour les tubes est nécessaire. Le bloc chauffant doit être conforme aux spécifications de performance suivantes : — Plage de températures : ambiante +5 °C à 99 °C — Régulation de température : ±0,1 °C à 37 °C; ±0,4 °C à 60 °C Support magnétique : un support magnétique pour une plaque à 96 puits est nécessaire. Les meilleures performances sont atteintes lorsque les aimants sont du côté du support et non au fond. Pipettes de précision : un ensemble de pipettes de précision est nécessaire. (Un ensemble séparé est nécessaire dans la zone de pré-amplification). L’utilisation de pipettes de précision est nécessaire pour s’assurer d’une distribution précise des réactifs et des échantillons. Les pipettes monocanal ou multicanaux peuvent être utilisées si elles sont étalonnées régulièrement et sont précises à moins de 5 % du volume indiqué. Consommables : les consommables suivants sont nécessaires. — Plaques PCR à jupe à 96 puits, 0,2 ml, en polypropylène ou équivalent — Plaques de stockage à 96 puits, 0,8 ml (plaques MIDI) REMARQUE Assurez-vous que la plaque à 96 puits s’adapte parfaitement au support magnétique. — — — — — — — Tubes coniques, 15 ml Tubes de microcentrifugeuse Eppendorf (bouchon vissé recommandé) Barrettes de huit tubes PCR Bassins de solution, sans PVC ni ADNase/ARNase (cuve) Opercules adhésifs en aluminium Joints de plaque adhésifs Pointes de pipette résistantes à l’aérosol Prélèvement, transport et stockage des échantillons REMARQUE Manipulez tous les échantillons comme s’ils étaient des agents potentiellement infectieux. 1 2 3 4 5 Les échantillons de sang total recueillis dans les tubes K2EDTA doivent être utilisés. Les échantillons de sang total peuvent être stockés pendant un maximum de sept jours à température ambiante, jusqu’à 30 jours entre 2 °C et 8 °C, ou jusqu’à 30 jours entre -25 °C et -15 °C. Transportez le sang total pendant un maximum de sept jours à température ambiante, 30 jours entre 2 °C et 8 °C, ou 30 jours si congelé entre -25 °C et -15 °C. Le transport de sang total doit se conformer aux règlements nationaux, fédéraux, régionaux et locaux sur le transport d’agents étiologiques. Aucun effet négatif sur les performances du test n’a été observé lorsque l’ADN génomique a été soumis à six cycles de congélation/décongélation. Aucun effet négatif sur les performances du test n’a été observé sur les échantillons de sang total contenant un taux élevé de bilirubine, de cholestérol, de triglycéride, d’ETDA ou d’hémoglobine. Avertissements et précautions ATTENTION La loi fédérale américaine n’autorise la vente de ce dispositif que sur ordonnance ou par un médecin ou tout autre professionnel de la santé autorisé par la législation de l’État dans lequel il ou elle exerce à utiliser ou ordonner l’utilisation de cet appareil. 1 Certains composants de ce test contiennent du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. (Pour plus de renseignements, consultez la section Réactifs à la page 8.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 13 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 14 Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Certains composants de ce test contiennent du 2-mercaptoéthanol, un agent réducteur. (Pour plus de renseignements, consultez la section Réactifs à la page 8.) Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Utilisez ces composants dans une zone bien aérée et mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales locales applicables. Pour plus de renseignements, communiquez avec l’assistance technique d’Illumina. Manipulez tous les échantillons comme s’ils étaient des agents potentiellement infectieux. Le non-respect des procédures comme décrites peut entraîner des résultats erronés ou une baisse considérable de la qualité des échantillons. Utilisez les précautions de routine en laboratoire. Ne pipettez pas avec la bouche. Ne mangez pas, ne buvez pas et ne fumez pas dans les zones de travail indiquées. Portez des gants jetables et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des échantillons et des réactifs du test. Lavez-vous les mains soigneusement après avoir manipulé les échantillons et les réactifs du test. N’utilisez aucun composant du test au-delà de la date de péremption indiquée sur l’étiquette du carton du test. N’interchangez pas les composants du test venant de lots de test différents. Notez que les lots de test sont indiqués sur l’étiquette du carton du test. Conservez les composants du test à la température spécifiée dans les zones de préamplification et de postamplification indiquées. Des cycles de congélation/décongélation répétés (jusqu’à six) des composants de la boîte 1 ne compromettront pas l’intégrité du test. Pour empêcher la dégradation des échantillons ou des réactifs, veillez à ce que toutes les vapeurs d’hypochlorite de sodium se dissipent avant de commencer le protocole. Les pratiques de laboratoire appropriées et la bonne hygiène du laboratoire sont nécessaires pour empêcher les produits PCR de contaminer les réactifs, les instruments et les échantillons d’ADN génomique. La contamination par des produits PCR peut causer des résultats erronés et non fiables. Pour éviter la contamination, veillez à ce que les zones de préamplification et de post-amplification possèdent un équipement réservé (p. ex. pipettes, pointes de pipette, agitateur vortex et centrifugeuse). Évitez la contamination croisée. Utilisez des nouvelles pointes de pipette entre les échantillons et entre les réactifs distribués. Mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette et centrifugez la plaque lorsque cela est indiqué. N’agitez pas les plaques. L’utilisation des pointes résistantes à l’aérosol réduit le risque de rétention d’amplicons et de contamination croisée d’un échantillon à l’autre. Une paire index-échantillon doit correspondre exactement à la feuille d’échantillons. Les inadéquations entre la feuille d’échantillons et le schéma de la plaque entraîneront une perte de l’identification positive des échantillons et un rapport de résultats incorrect. Préparez toujours une nouvelle solution d’éthanol à 80 % pour les étapes de lavage. L’éthanol peut absorber l’eau présente dans l’air, ce qui affecte les résultats. Veillez à ce que tout l’éthanol soit retiré du bas des puits pendant les étapes de lavage. Des résidus d’éthanol pourraient affecter les résultats. Respectez le temps de séchage indiqué après l’étape du support magnétique pour assurer une évaporation totale. L’éthanol résiduel peut modifier les performances des réactions ultérieures. Ne mélangez pas le Tests de séquençage clinique de la fibrose kystique : pool d’oligos et le Tampon d’hybridation lors du stockage. Lorsque combiné, le Tests de séquençage clinique de la fibrose kystique : pool d’oligos devient instable, même lorsqu’il est conservé congelé. L’utilisation des thermocycleurs à refroidissement actif (p. ex, le refroidissement thermoélectrique, Peltier) n’est pas recommandée pour l’étape d’hybridation. L’étape de refroidissement passif est essentielle pour une hybridation adéquate. Ajoutez toujours le Polymérase PCR au Mélange maître PCR juste avant l’utilisation. Ne conservez jamais la solution de travail combinée. | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 20 Durant l’étape de normalisation de la librairie, il est extrêmement important de resuspendre complètement le culot des billes de la librairie. Cette étape est essentielle pour obtenir une densité consistante des amplifiats sur la Flow Cell MiSeqDx. 21 Respectez les temps d’incubation indiqués dans l’étape de normalisation de la librairie. Une incubation inappropriée peut affecter la représentation de la librairie et la densité des amplifiats. 22 En raison du nombre de transferts de plaque et du risque subséquent de contamination, faites preuve d’extrême prudence pour vous assurer que le contenu du puits reste entièrement dans le puits. N’éclaboussez pas le contenu. 23 La recommandation de 250 ng en matière d’entrée d’ADN permet de varier la quantité d’ADN; les performances des tests dépendent de ce niveau d’entrée. Notes procédurales 1 2 3 4 Illumina exige qu’un échantillon d’ADN à contrôle positif et un à contrôle négatif (NTC ou contrôle sans modèle) soient inclus dans chaque analyse qui est définie comme une série d’échantillons traités en parallèle. L’échantillon d’ADN de contrôle positif doit être un échantillon correctement caractérisé présentant un ou plusieurs variants CFTR connus. Illumina recommande l’utilisation d’un contrôle de type sauvage. Le contrôle de type sauvage doit être exécuté comme un échantillon et ne doit pas remplacer le contrôle positif ou négatif. Avant de commencer le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx, extrayez et quantifiez l’ADN. Toute méthode d’extraction d’ADN validée peut être utilisée. Quantifiez l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Vérifiez que le rapport A260/A280 de l’échantillon d’ADN est > 1,5. Normalisez l’échantillon d’ADN sur 50 ng/µl. Chaque échantillon nécessite 5 µl d’ADN génomique (250 ng au total). Débit d’échantillons et représentation d’index Pour le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina, le débit d’échantillons par une analyse MiSeqDx est de huit échantillons. Les primers d’indexage utilisés pendant l’amplification par PCR doivent être choisis en fonction du débit d’échantillons final souhaité pour assurer la diversité dans la séquence d’indexage. MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour séquencer des bases G/T et un voyant DEL rouge pour séquencer des bases A/C. À chaque cycle, au moins un des deux nucléotides de chaque canal de couleur doit être lu pour assurer l’enregistrement approprié. Il est important de maintenir l’équilibrage des couleurs pour chaque base de la lecture d’index en cours de séquençage, sinon un échec de l’enregistrement pourrait se produire lors du séquençage de la lecture d’index. Utilisez le jeu d’index d’équilibrage des couleurs minimal suivant pour les analyses de séquençage de huit échantillons : Tableau 14 Combinaisons de primers d’index pour des analyses de séquençage avec huit échantillons Primer d’index 1 (A701) Primer d’index 2 (A702) Primer d’index 10 (A710) Primer d’index C (A503) Échantillon 1 Échantillon 2 Échantillon 3 Primer d’index D (A504) Échantillon 4 Échantillon 5 Échantillon 6 Primer d’index E (A505) Échantillon 7 Échantillon 8 -- Si six échantillons uniques (à l’exclusion des contrôles positifs et négatifs) ne sont pas disponibles, il convient d’effectuer l’analyse avec les répliques de n’importe quel échantillon d’ADN génomique humain. Mode d’emploi Préparation de la feuille d’échantillons MiSeqDx 1 2 Dans l’écran d’accueil d’Illumina Worklist Manager, sélectionnez Create Worklist (Créer la liste de travail). Dans le champ Test Type (Type de test), sélectionnez Test de séquençage clinique de la fibrose kystique (CF). Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 15 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 3 4 5 6 Dans le champ Worklist Name (Nom de la liste de travail), saisissez un nom pour la feuille d’échantillons. — Si l’identifiant du code à barres de la cartouche de réactifs alphanumérique est utilisé pour le nom de la feuille d’échantillons, le MiSeq Operating Software (MOS) trouve automatiquement la feuille d’échantillons. — Si vous utilisez un autre nom pour la feuille d’échantillons, le bouton Browse (Parcourir) situé dans le MiSeq Operating Software (MOS) peut être utilisé afin de trouver la feuille d’échantillons appropriée. [Facultatif] Entrez une description pour identifier l’analyse. Assurez-vous que la date correspond à la date de début de l’analyse. Sélectionnez Next (Suivant). Entrer des renseignements sur l’échantillon 1 2 3 4 5 Dans l’onglet Table (Tableau) ou l’onglet Plate (Plaque), saisissez les renseignements suivants pour chaque puits d’échantillon : a Identifiant de l’échantillon : saisissez un seul identifiant d’échantillon. b Index 1 et Index 2 : spécifiez l’adaptateur d’index qui sera utilisé pour chaque lecture d’index. [Facultatif] Pour enregistrer des renseignements plus détaillés sur les échantillons, saisissez un nom et une description. [Facultatif] Pour identifier les contrôles sur la plaque, sélectionnez Negative (Négatif) ou Positive (Positif) dans le menu déroulant Control (Contrôle). Accédez à l’onglet Plate Graphic (Graphique de la plaque) et utilisez les options Copy to Clipboard (Copier vers le bloc-notes) ou Print (Imprimer) pour capturer une image de la plaque d’échantillon. Sélectionnez Finish (Terminer). Lorsque vous enregistrez une feuille d’échantillons, le logiciel crée automatiquement un fichier .csv et un fichier .png de l’onglet Plate Graphic (Graphique de la plaque) et les enregistre au même emplacement pour être utilisés avec la configuration de l’expérience. Hybridation du pool d’oligonucléotides Préparation 1 2 3 4 5 Ramenez le Tests de séquençage clinique de la fibrose kystique : pool d’oligos, le Tampon d’hybridation, les échantillons d’ADN génomique et l’échantillon de contrôle positif à température ambiante. Mélangez vigoureusement le Tests de séquençage clinique de la fibrose kystique : pool d’oligos et le Tampon d’hybridation pour vous assurer que tous les précipités ont été complètement dissous, puis centrifugez brièvement les tubes pour recueillir le liquide. Réglez un bloc chauffant de 96 puits à 95 °C. Préchauffez un incubateur à 37 °C. Créez la plaque d’échantillon en fonction du graphique de la plaque imprimé à partir de Illumina Worklist Manager. Procédure 1 2 3 4 5 6 16 Préparez une nouvelle plaque PCR de 96 puits (ci-après dénommée la plaque HYB). Ajoutez 5 µl d’échantillon ou de contrôle à 50 ng/µl (250 ng total) dans les puits appropriés dans la plaque HYB. Suivez la disposition de la plaque générée pour une sélection appropriée des puits. Ajoutez 5 µl de Tests de séquençage clinique de la fibrose kystique : pool d’oligos à tous les puits contenant l’ADN génomique. Ajoutez 40 µl de Tampon d’hybridation à chaque échantillon dans la plaque HYB. Pipettez doucement vers le haut et le bas 3 à 5 fois pour mélanger. Scellez la plaque HYB et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. Placez la plaque HYB dans le bloc préchauffé à 95 °C et incubez pendant 1 minute. | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 7 Réduisez le bloc chauffant à 40 °C et continuez à incuber jusqu’à ce que le bloc chauffant atteigne 40 °C (environ 80 minutes). Le refroidissement progressif est très important pour une bonne hybridation; par conséquent, les thermocycleurs PCR avec refroidissement actif (p. ex. Peltier avec refroidissement thermoélectrique) ne sont pas recommandés pour ce processus. POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ Après que le bloc chauffant a atteint 40 °C, la plaque HYB est stable lorsqu’elle est maintenue à 40 °C pendant 2 heures. Retrait des oligonucléotides non liés Préparation 1 2 3 Ramenez le Mélange extension-ligation, le Tampon de lavage rigoureux et le Tampon de lavage universel à température ambiante, puis mélangez brièvement. Assemblez l’unité d’assemblage de la plaque filtrante (ci-après désignée comme FPU) en ordre de haut en bas : couvercle, plaque filtrante, collier d’adaptateur et plaque MIDI. Lavez au préalable la membrane de la plaque filtrante comme suit : a Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage rigoureux à chaque puits. b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes. Procédure 1 2 3 4 5 Retirez la plaque HYB du bloc chauffant et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. Transférez le volume total (environ 55 µl) de chaque échantillon aux puits correspondants de la plaque filtrante. Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes. Lavez la plaque filtrante comme suit : a Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage rigoureux à chaque puits d’échantillon. b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 5 minutes. Répétez le lavage comme décrit à l’étape précédente. REMARQUE Si le tampon de lavage n’est pas complètement évacué, centrifugez encore à 2 400 × g à 20 °C jusqu’à la disparition complète du liquide (5 à 10 minutes supplémentaires). 6 7 8 Jetez tout liquide circulant (contenant du formamide), puis réassemblez la FPU. Ajoutez 45 µl de Tampon de lavage universel à chaque puits d’échantillon. Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 10 minutes. REMARQUE Veillez à ce que tout liquide soit vidé après la centrifugation. Répétez la centrifugation si nécessaire. Extension-ligation des oligonucléotides liés Procédure 1 2 3 Ajoutez 45 µl de Mélange extension-ligation à chaque puits d’échantillon de la plaque filtrante. Scellez la plaque filtrante avec une feuille d’aluminium adhésive, puis posez le couvercle. Incubez la plaque FPU dans l’incubateur préchauffé à 37 °C pendant 45 minutes. Amplification PCR Préparation 1 2 Préparez une nouvelle solution 0,05 N NaOH. Déterminez les primers d’index à utiliser selon le graphique de plaque imprimé à partir de Illumina Worklist Manager. Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 17 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 3 4 5 6 Ramenez le Mélange maître PCR et les primers d’index appropriés à température ambiante. Mélangez chaque tube décongelé, puis centrifugez brièvement les tubes. Préparez une nouvelle plaque PCR à 96 puits (ci-après dénommée la plaque AMP). Ajoutez des primers d’index à la plaque AMP en fonction de la feuille d’échantillons comme suit : a Ajoutez 4 µl des primers d’index C (A503), D (A504) et E (A505) aux puits appropriés dans une colonne de la plaque AMP. b Mettez au rebut les bouchons blancs d’origine et utilisez des bouchons blancs neufs. c Ajoutez 4 µl des primers d’index sélectionnés 1 (A701), 2 (A702) et 10 (A710) aux puits appropriés dans une rangée de la plaque AMP. Les extrémités doivent être changées après chaque rangée pour éviter la contamination croisée de l’index. d Mettez au rebut les bouchons orange d’origine et utilisez des bouchons orange neufs. Préparez la solution de travail PCR Mélange maître PCR/Polymérase PCR comme suit : a Ajoutez 5,6 µl de Polymérase PCR à 280 µl de Mélange maître PCR. b Retournez 20 fois la solution de travail PCR préparée pour la mélanger. Procédure 1 2 3 Retirez le FPU de l’incubateur, puis enlevez l’opercule en aluminium. Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez à 2 400 × g à 20 °C pendant 2 minutes. Ajoutez 25 µl de 0,05 N NaOH à chaque puits d’échantillon sur la plaque filtrante. Pipettez la solution NaOH de haut en bas cinq à six fois. 4 Recouvrez et incubez la plaque filtrante à température ambiante pendant 5 minutes. 5 Pendant que la plaque filtrante est en incubation, transférez 22 µl de la solution de travail PCR à chaque puits de la plaque AMP contenant des primers d’index. 6 Transférez les échantillons élués du filtre à la plaque AMP comme suit : a Pipettez les échantillons de la première colonne de la plaque filtrante de haut en bas cinq à six fois. b Transférez 20 µl de la plaque filtrante à la colonne correspondante de la plaque AMP. c Pipettez doucement de haut en bas cinq à six fois pour combiner soigneusement l’ADN à la solution de travail PCR. d Transférez les autres colonnes de la plaque filtrante à la plaque AMP en procédant de la même manière. Les extrémités doivent être changées après chaque colonne pour éviter la contamination croisée de l’index et de l’échantillon. 7 Scellez la plaque AMP et fixez-la avec un rouleau en caoutchouc. 8 Centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. 9 Transférez la plaque AMP vers la zone de post-amplification. 10 Réalisez la PCR en utilisant le programme suivant sur un thermocycleur : — 95 °C pendant 3 minutes — 25 cycles de : — 95 °C pendant 30 secondes — 62 °C pendant 30 secondes — 72 °C pendant 60 secondes — 72 °C pendant 5 minutes — Maintenez à 10 °C POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ Si vous ne procédez pas immédiatement au nettoyage PCR, la plaque AMP peut rester sur le thermocycleur durant la nuit ou peut être stockée entre 2 °C et 8 °C jusqu’à 48 heures. Nettoyage PCR Préparation 1 18 Ramenez les Billes de nettoyage PCR à température ambiante. | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 2 Préparez une nouvelle solution d’éthanol à 80 % à partir de l’éthanol absolu. Procédure 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Centrifugez la plaque AMP à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. Préparez une nouvelle plaque MIDI (ci-après désignée comme la plaque CLP). Retournez les Billes de nettoyage PCR 10 fois. Mélangez vigoureusement à l’aide d’un agitateur vortex, puis retournez 10 fois de plus. Inspectez visuellement la solution pour vous assurer que les billes sont resuspendues. Ajoutez 45 µl de Billes de nettoyage PCR dans chaque puits de la plaque CLP. Transférez la totalité du produit PCR de la plaque AMP à la plaque CLP. Scellez la plaque CLP et agitez-la sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 2 minutes. Incubez à température ambiante sans secouer pendant 10 minutes. Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué. Avec la plaque CLP sur le support magnétique, retirez soigneusement et jetez le surnageant. Avec la plaque CLP sur le support magnétique, lavez les billes comme suit : a Ajoutez 200 µl d’éthanol à 80 % fraîchement préparé dans chaque puits d’échantillon. b Placez la plaque sur le support magnétique pendant 30 secondes ou jusqu’à ce que le surnageant soit éliminé. c Retirez le surnageant et mettez-le au rebut. Répétez le lavage comme décrit à l’étape précédente. Utilisez une pipette multicanaux P20 réglée sur 20 µl pour retirer l’excès d’éthanol. Retirez la plaque CLP du support magnétique et séchez à l’air libre pendant 10 minutes. Ajoutez 30 µl de Tampon d’élution à chaque échantillon, puis mélangez brièvement. Scellez la plaque CLP et agitez-la sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 2 minutes. Après l’avoir secouée, vérifiez si les échantillons ont été resuspendus. Dans le cas contraire, répétez cette étape. Incubez à température ambiante pendant 2 minutes. Placez la plaque CLP sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué. Préparez une nouvelle plaque MIDI (ci-après désignée comme la plaque LNP). Transférez 20 µl de surnageant de la plaque CLP à la plaque LNP. [Facultatif] Transférez les 10 µl restants du surnageant de la plaque CLP à la nouvelle plaque et étiquetez la plaque avec un nom et une date d’analyse. Conservez cette plaque entre -25 °C et -15 °C jusqu’à la fin de l’analyse de séquençage et de l’analyse de données. Les produits PCR nettoyés peuvent être utilisés pour des efforts de dépannage en cas de pannes d’échantillon. POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ Si vous arrêtez à ce point, scellez la plaque LNP et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. La plaque est stable pendant une durée maximale de 3 heures entre 2 °C et 8 °C. Normalisation de librairie Préparation 1 2 3 4 Préparez une nouvelle solution 0,1 N NaOH. Ramenez le Diluant de normalisation de librairie, les Billes de librairie et le Lavage de normalisation de librairie à température ambiante. Mélangez le Diluant de normalisation de librairie vigoureusement et assurez-vous que tous les précipités ont été dissous. Mélangez les Billes de librairie vigoureusement pendant une minute avec inversion intermittente jusqu’à ce que les billes soient remises en suspension et qu’aucun culot ne se trouve au fond du tube lorsque celui-ci est retourné. Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 19 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Procédure 1 Mélangez le Diluant de normalisation de librairie et les Billes de librairie dans un tube de 1,5 ml tout juste rempli comme suit : a Ajoutez 394 µl de Diluant de normalisation de librairie. b Pipettez les Billes de librairie de haut en bas 10 fois et remettez en suspension. REMARQUE Il est extrêmement important de remettre en suspension complètement le culot de billes de la librairie au fond du tube. L’utilisation d’un P1000 permet de s’assurer que les billes sont remises en suspension de manière homogène et qu’il n’y a aucune masse de billes au fond du tube. Cela est essentiel pour atteindre la densité régulière des amplifiats sur la Flow Cell. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 c Pipettez 72 µl de Billes de librairie dans le tube contenant le Diluant de normalisation de librairie. d Mélangez en retournant le tube 15 à 20 fois. Ajoutez 45 µl de la solution de travail Diluant de normalisation de librairie/Billes de librairie combinée à chaque puits de la plaque LNP contenant des librairies. Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 30 minutes. Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué. La plaque LNP sur un support magnétique, retirez avec précaution le surnageant et mettez-le au rebut. Retirez la plaque LNP du support magnétique et lavez les billes avec le Lavage de normalisation de librairie comme suit : a Ajoutez 45 µl de Lavage de normalisation de librairie à chaque puits d’échantillon. b Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 5 minutes. c Placez la plaque sur un support magnétique pendant au moins 2 minutes ou jusqu’à ce que le surnageant soit évacué. d Retirez le surnageant et mettez-le au rebut. Répétez la procédure de lavage de normalisation de librairie comme décrit à l’étape précédente. Utilisez une pipette multicanaux P20 réglée à 20 µl pour retirer tout excès du Lavage de normalisation de librairie. Retirez la plaque LNP du support magnétique et ajoutez 30 µl de la solution 0,1 N NaOH à chaque puits. Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques à 1 800 tr/min pendant 5 minutes. Pendant l’élution de 5 minutes, préparez une nouvelle plaque PCR à 96 puits (ci-après dénommée la plaque SGP). Ajoutez 30 µl de Tampon de stockage de librairie à chaque puits à utiliser dans la plaque SGP. Après l’élution de 5 minutes, assurez-vous que tous les échantillons de la plaque LNP sont complètement remis en suspension. Si les échantillons ne sont pas complètement remis en suspension, pipettez doucement ces échantillons de haut en bas ou tapotez doucement la plaque sur la paillasse pour resuspendre les billes, puis secouez pendant encore 5 minutes. Placez la plaque LNP sur le support magnétique pendant au moins 2 minutes. Transférez le surnageant de la plaque LNP à la plaque SGP. Pipettez de haut en bas cinq fois pour mélanger. Scellez la plaque SGP et centrifugez à 1 000 × g à 20 °C pendant 1 minute. POINT D’ARRÊT DE SÉCURITÉ Si vous ne procédez pas immédiatement au groupement des librairies et au séquençage ultérieur sur le MiSeqDx, stockez la plaque SGP à une température comprise entre -25 et -15 °C pendant trois jours au maximum. Groupement de librairies Préparer le groupement de librairies 1 2 20 Réglez sur 96 °C un bloc chauffant adapté aux tubes de centrifugeuse de 1,5 ml. Dans un seau à glace, préparez un bain d’eau glacée. Faites refroidir le Tampon de dilution de librairie dans le bain d’eau glacée. | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 3 Commencez à décongeler la cartouche de réactifs du MiSeqDx. Préparer une nouvelle dilution de NaOH ATTENTION L’utilisation de NaOH nouvellement dilué est essentielle pour dénaturer complètement les échantillons pour la génération d’amplifiats sur le MiSeqDx. 1 2 Combinez les volumes suivants dans un tube de microcentrifugeuse : — eau sans DNase/RNase (900 µl) — stock de 1,0 N NaOH (100 µl) Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger. Dénaturer et diluer le Contrôle interne PhiX 1 2 3 4 5 6 Combinez les volumes suivants pour diluer la librairie Contrôle interne PhiX de 2 nM : — librairie Contrôle interne PhiX de 10 nM (2 µl) — tampon 1X TE (8 µl) Combinez les volumes suivants pour obtenir une librairie Contrôle interne PhiX de 1 nM : — librairie Contrôle interne PhiX de 2 nM (10 µl) — 0,1 N de NaOH (10 µl) Mélangez brièvement la solution de la librairie Contrôle interne PhiX de 1 nM. Centrifugez la solution du modèle à 280 × g à 20 °C pendant 1 minute. Incubez à température ambiante durant 4,5 minutes pour dénaturer la librairie Contrôle interne PhiX en brins uniques. Combinez les volumes suivants dans un nouveau tube pour microcentrifugeuse afin d’obtenir une librairie Contrôle interne PhiX de 20 pM : — Librairie Contrôle interne PhiX dénaturée (2 µl) — Tampon de dilution de librairie préalablement réfrigéré (98 µl) REMARQUE Vous pouvez conserver la librairie Contrôle interne PhiX dénaturée de 20 pM jusqu’à trois semaines entre -25 °C et -15 °C comme aliquotes à usage unique. Après trois semaines, le nombre d’amplifiats tend à diminuer. 7 Jetez la librairie Contrôle interne PhiX dénaturée de 1 nM restante de 18 µl. Préparer la cartouche de réactifs 1 2 3 Décongelez la Cartouche de réactifs MiSeqDx : test de séquençage clinique de la fibrose kystique dans un bain d’eau contenant assez d’eau déionisée à température ambiante pour submerger la base de la cartouche de réactifs jusqu’à la ligne de délimitation de l’eau imprimée sur la cartouche de réactifs. Le niveau de l’eau ne doit pas dépasser la ligne de délimitation de l’eau maximale. Laissez la cartouche de réactifs décongeler dans le bain dʼeau à température ambiante pendant environ une heure ou jusquʼà décongélation. Retirez la cartouche du bain d’eau et tapotez-la doucement contre la paillasse pour retirer l’eau de la base de la cartouche. Séchez la base de la cartouche. Assurez-vous que lʼeau n’a pas éclaboussé la partie supérieure de la cartouche de réactifs. Inspecter la cartouche de réactifs 1 Retournez la cartouche de réactifs 10 fois pour mélanger les réactifs décongelés, puis vérifiez visuellement que toutes les positions sont décongelées. REMARQUE Il est essentiel que les réactifs contenus dans la cartouche soient parfaitement décongelés et mélangés afin de garantir un séquençage correct. Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 21 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 2 3 Inspectez visuellement les réactifs des positions 1, 2 et 4 pour vérifier quʼils sont complètement mélangés et quʼils ne contiennent pas de précipités. Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour réduire les bulles dʼair dans les réactifs. REMARQUE Les tubes des dispositifs dʼaspiration MiSeqDx descendant au fond de chaque réservoir pour aspirer les réactifs, il est important quʼaucune bulle dʼair ne reste dans les réservoirs. 4 Placez la cartouche de réactifs sur la glace ou réservez-la à une température comprise entre 2 et 8 °C (jusqu’à 6 heures) jusqu’à ce que vous soyez prêt à configurer lʼanalyse. Pour obtenir de meilleurs résultats, chargez directement l’échantillon et configurez lʼanalyse. Préparer des échantillons pour le séquençage 1 2 3 4 5 6 Ramenez le Tampon de dilution de librairie à température ambiante. Mélangez le Tampon de dilution de librairie et assurez-vous que tous les précipités sont complètement dissous. Si la plaque SGP a été conservée congelée, décongelez la plaque SGP à température ambiante. Centrifugez la plaque SGP à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute. Mettez en route un tube Eppendorf frais (ci-après désigné comme le tube PAL). Si la plaque SGP a été conservée congelée, mélangez chaque librairie à séquencer en pipettant de haut en bas trois à cinq fois. Transférez 5 µl de chaque librairie à séquencer de la plaque SGP à la barrette de huit tubes PCR. Scellez la plaque SGP avec un joint adhésif de plaque et réservez. REMARQUE Après utilisation, conservez la plaque SGP scellée à une température de -25 °C à -15 °C. La plaque SGP scellée est stable pendant un maximum de trois jours. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Combinez et transférez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL. Mélangez complètement le tube PAL à l’aide d’un agitateur vortex. Mettez en route un tube Eppendorf frais (ci-après désigné comme le tube DAL). Ajoutez 585 µl de Tampon de dilution de librairie au tube DAL. Ajoutez 6 µl de Contrôle interne PhiX de 20 pM au tube DAL. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total. Transférez 9 µl du PAL dans le tube DAL contenant le Tampon de dilution de librairie. Pipettez de haut en bas trois à cinq fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total. Mélangez le tube DAL sous agitateur vortex à vitesse maximale. Centrifugez le tube DAL à 1 000 × g à 20 °C pendant une minute. Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant à 96 °C pendant 2 minutes. Après l’incubation, retournez le tube DAL une à deux fois pour mélanger, puis placez-le immédiatement dans un bain d’eau glacée. Gardez le tube DAL dans un bain d’eau glacée pendant 5 minutes. Charger des librairies d’échantillons sur la cartouche 1 2 3 22 Utilisez une pointe de pipette séparée, propre et vide de 1 ml pour percer l’opercule en aluminium scellant le réservoir sur la cartouche de réactifs étiquetée Load Samples (Charger les échantillons). Transférez à l’aide de la pipette 600 µl des librairies d’échantillons du DAL dans le réservoir Load Samples (Charger les échantillons). Prenez soin d’éviter de toucher l’opercule en aluminium lors de la distribution de l’échantillon. Vérifiez s’il y a des bulles d’air dans le réservoir après le chargement de l’échantillon. Si des bulles d’air sont présentes, tapotez légèrement la cartouche sur la paillasse pour les libérer. Passez directement à la configuration de l’analyse depuis l’interface MiSeq Operating Software (MOS). | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Interprétation de résultats Le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina est conçu pour séquencer toutes les régions de codage de protéine dans le gène CFTR à travers les 27 exons, entre 5 et 30 bases de séquence intronique adjacente, ~100 nt de séquence adjacente au 5’ UTR et 3’ UTR et deux mutations introniques profondes (1 811 + 1,6 kbA > G, 3 489 + 10 kbC > T). Les régions exactes séquencées sont répertoriées dans le Tableau 2. En outre, le test présente également des rapports sur le variant PolyTG/PolyT et deux grandes délétions (CFTRdele2, 3, CFTRdele22, 23). 1 2 3 4 Le rapport des tests répertorie les noms d’échantillons et le génotype pour chaque variant détecté pour un échantillon. — Les coordonnées génomiques, le nom d’ADNc selon la Human Genome Variation Society (HGVS) et le nom de protéine (si disponible) sont signalés pour chaque variant. — Le type de variant est identifié comme variant à simple nucléotide (SNV), variant de délétion/insertion (DIV), variant de PolyTG/PolyT (PolyTGPolyT) ou grande délétion (DEL). — Le typage génotypique (qu’il soit hétérozygote ou homozygote) peut être déduit des renseignements de base « de référence », qui fournissent la séquence de référence à ces coordonnées génomiques, et de la description de « résultat » qui donne les deux allèles sur la position génomique dans l’échantillon. Par exemple, si la référence est « G » et le résultat est « A/G », cela indique une modification G > A à ces coordonnées génomiques et que le génotype est hétérozygote pour l’allèle du variant. De même, si la référence est « G » et le résultat est « T/T », cela indique une modification G > T à ces coordonnées génomiques et que le génotype est homozygote pour l’allèle du variant. — La profondeur de séquençage à la position du variant est fournie dans le champ « Depth » (Profondeur) et la fréquence allélique dans la section « Frequency » (Fréquence). Le rapport des tests fournit des renseignements relatifs au débit d’appel d’échantillon pour chaque échantillon. Le débit d’appel est calculé comme suit : nombre de positions/régions de variants qui correspondent à un seuil de valeur de confiance prédéfinie divisé par nombre total de positions/régions interrogées. — La coordonnée génomique pour toute position ou région dont la valeur de confiance est inférieure au seuil est répertoriée séparément dans la section « Coordinates not called » (Coordonnées non appelées). Les utilisateurs doivent évaluer les positions non appelées par rapport aux renseignements sur les variants pertinents, afin d’identifier des variants qui peuvent être manqués et leurs fréquences de population correspondantes pour déterminer s’il est nécessaire de répéter l’échantillon. Un résultat d’échantillon est considéré comme étant valide uniquement si le débit d’appel est de ≥ 99 %. Si le débit d’appel est inférieur à 99 %, la performance est rapportée comme « Fail » (Échec), et l’échantillon doit être répété. Il est recommandé de soumettre les variants qui ne sont pas validés dans l’étude de précision (voir la section Précision à la page 25) à une vérification par l’utilisateur au moyen d’une méthode de référence validée avant de rapporter les premiers résultats de patient avec ces variants. REMARQUE Une mise en phase de l’haplotype doit être envisagée lorsque deux variants ou plus sont détectés. 5 Toutes les interprétations des variants doivent être effectuées par un généticien moléculaire clinique diplômé ou équivalent, conformément aux directives et procédures locales11. Les références d’interprétation possibles incluent, mais sans s’y limiter : la base de données CFTR212,13, l’article de Sosnay10, les directives de l’ACMG en 200414 et l’avis du comité ACOG en 20118. Pour plus de renseignements sur la méthode de calcul et de présentation des résultats, ou pour obtenir une description du contenu du rapport de fichier texte, consultez le Guide de l’utilisateur de MiSeq Reporter (nº 15038356). Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 23 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 6 Le généticien a la possibilité d’utiliser le logiciel MiSeq Reporter pour entrer une valeur d’interprétation pour chaque variant signalé sur un échantillon à l’aide d’un menu déroulant. Les choix de valeur d’interprétation sont les suivants : provoquant la fibrose kystique, mutation aux conséquences cliniques variables, mutation d’une importance inconnue ou ne provoquant pas la fibrose kystique. La valeur entrée doit être annexée au fichier de résultats et affichée dans la colonne d’interprétation sur le rapport de test de séquençage clinique. Procédures de contrôle qualité Les bonnes pratiques de laboratoire exigent que le matériel de contrôle soit évalué pour détecter d’éventuelles différences dans le traitement du sang et les procédures techniques dans le laboratoire de l’utilisateur qui pourraient entraîner une variabilité significative dans les résultats. 1 2 3 4 5 24 Contrôles positifs : un échantillon de contrôle positif d’ADN est requis pour chaque analyse. L’échantillon de contrôle positif d’ADN doit être un échantillon bien caractérisé présentant au moins un variant CFTR connu15. Illumina recommande d’alterner les contrôles positifs conformes aux normes techniques et directives 2008 de l’ACMG (American College of Medical Genetics) pour les tests de mutation de la FK16 et aux normes de laboratoire clinique 2013 de l’ACMG pour le séquençage de nouvelle génération17. Un échantillon de contrôle positif doit générer un génotype attendu. Si le contrôle positif génère un génotype différent de celui attendu, alors il y a peut-être eu une erreur dans le suivi de l’échantillon ou un enregistrement incorrect des primers d’indexage. Le test entier doit être refait, en commençant par la préparation de librairie. Contrôle négatif (sans modèle ni ADN) : l’utilisation d’un contrôle négatif (sans modèle ni ADN) est requise pour chaque analyse, de façon à détecter les cas possibles de contamination. Le débit d’appel pour le contrôle négatif doit être inférieur à 10 %. Si un contrôle négatif génère un débit d’appel > 10 %, cela signifie qu’une contamination a peut-être eu lieu durant le traitement du test. Le test est considéré comme un échec et le test entier doit être refait, en commençant par la préparation de librairie. Contrôle de type sauvage : l’échantillon de contrôle d’ADN de type sauvage est recommandé à chaque analyse. L’échantillon de contrôle de type sauvage doit être un échantillon correctement caractérisé ne contenant pas de variants CFTR. L’échantillon de contrôle de type sauvage doit générer le génotype attendu. Si le contrôle de type sauvage génère un génotype différent de celui attendu, alors il y a peut-être eu une erreur dans le suivi de l’échantillon ou un enregistrement incorrect des primers d’indexage. Le test entier doit être refait, en commençant par la préparation de librairie. Avant la première utilisation de ce produit dans le laboratoire de l’utilisateur, les performances du test doivent être vérifiées en testant un nombre d’échantillons positifs et négatifs possédant des caractéristiques de performances connues. Toutes les exigences de contrôle qualité doivent être suivies dans le respect des réglementations locales, régionales et/ou fédérales ou des exigences d’accréditation. | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Caractéristiques de performance Précision La précision du Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina a été évaluée en évaluant 500 échantillons représentant un large éventail de variants CFTR provenant de quatre sources distinctes. La source principale de données de précision était une étude de précision clinique menée en utilisant un panel de 366 échantillons. La majorité (n = 355) des échantillons comprenaient des échantillons d’ADN cliniques archivés et anonymisés isolés à partir de sang humain, les 11 échantillons restants ont été obtenus à partir d’échantillons de lignée cellulaire disponible sur le marché. Les données provenant de cette étude ont été complétées par les données de précision de 68 échantillons de lignée cellulaire dans l’étude de reproductibilité, 14 échantillons cliniques de l’étude analytique d’évaluation de la méthode d’extraction et 52 échantillons de plasmide synthétique. Les plasmides synthétiques ont été conçus pour inclure le contexte génomique des variants rares, et contenaient partout entre un et dix variants dans la même structure. Ils ont été linéarisés, dilués en des nombres de copies équivalents d’ADN génomique, puis mélangés avec des échantillons d’ADN génomique humain présentant un génotype de type sauvage avec des nombres de copies équivalents pour imiter un échantillon hétérozygote. Pour le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx, un total de 5 206 positions ont été comparés aux méthodes de référence que sont le séquençage bidirectionnel Sanger et le test PCR. Les résultats de génotypage pour les petits sites InDel et SNV, région PolyTG/PolyT comprise, ont été comparés à une analyse de séquençage bidirectionnelle Sanger. Deux tests validés basés sur la PCR ont été utilisés comme méthode de référence pour les deux grandes délétions du panel. Chaque test duplex PCR a utilisé deux ensembles de primers pour faire la distinction entre les génotypes de type sauvage, hétérozygotes et homozygotes. L’un des ensembles de primer a été conçu pour border les points de rupture de délétion, tandis que l’autre a amplifié une région interne de la délétion. Les deux produits ont été détectés par une séparation de taille sur un gel d’agarose. Les tests PCR ont été validés en utilisant un panel de 28 échantillons au total (22 échantillons pour chaque délétion) composé d’échantillons d’ADN génomique dérivés de sang et de lignée cellulaire et de plasmides synthétiques, qui englobait les génotypes TS, HET et HOM pour chaque grande délétion. Les tests PCR ont été confirmés avec une spécificité et une reproductibilité à 100 % pour tous les échantillons testés, par le biais d’une évaluation de produits PCR sur un gel d’agarose. La précision des tests PCR a été confirmée au moyen d’un séquençage Sanger et avec une valeur de 100 % pour tous les échantillons. La précision a été déterminée pour chaque génotype à l’aide de trois mesures statistiques. Une concordance positive (CP) a été calculée pour chaque génotype de variant en divisant le nombre d’échantillons ayant des appels de variant concordants par le nombre total d’échantillons ayant ce variant tel qu’indiqué par les méthodes de référence. Une concordance négative (CN) a été calculée à travers toutes les positions de type sauvage (TS) en divisant le nombre de positions de TS concordantes par le nombre total de positions TS tel qu’indiqué par les méthodes de référence. La concordance globale (CG) a été calculée à travers toutes les positions signalées en divisant le nombre de TS concordants et des positions de variantes par le nombre total de positions signalées tel que déterminé par les méthodes de référence. Le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx présentait une CP au niveau du génotype de 99,66 %, variants PolyTG/PolyT compris (100 % en excluant les variants PolyTG/PolyT). La CN pour toutes les positions TS était > 99,99 %, et la CG pour toutes les positions rapportées était > 99,99 %. 25 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Tableau 15 Précision globale du Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive 117120141 c.-8G>C^ SNV Exon1 25 3 0 0 0 100 117120145 c.-4G>C^ SNV Exon1 3 2 0 0 0 100 M1V c.1A>G SNV Exon1 0 0 1 0 0 100 CFTR c.54-5940_ Del Intron1 4 1 0 0 0 100 dele2, 3 273+10250 del21kb R31C c.91C>T SNV Exon2 3 1 0 0 0 100 Q39X c.115C>T SNV Exon2 0 0 1 0 0 100 E60X c.178G>T SNV Exon3 6 1 0 0 0 100 P67L c.200C>T SNV Exon3 1 0 1 0 0 100 R74W c.220C>T SNV Exon3 0 2 0 0 0 100 R74Q c.221G>A SNV Exon3 2 0 0 0 0 100 R75X c.223C>T SNV Exon3 3 1 0 0 0 100 R75Q c.224G>A SNV Exon3 20 1 0 0 0 100 G85E c.254G>A SNV Exon3 6 2 0 0 0 100 394delTT c.262_263 DIV Exon3 3 1 0 0 0 100 delTT 26 405+1G>A c.273+1G>A SNV Intron3 0 0 1 0 0 100 406-1G>A c.274-1G>A SNV Exon4 4 0 0 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive E92K c.274G>A SNV Exon4 0 0 1 0 0 100 E92X c.274G>T SNV Exon4 0 1 1 0 0 100 Q98X c.292C>T SNV Exon4 0 0 2 0 0 100 444delA c.312delA DIV Exon4 0 2 0 0 0 100 457TAT>G c.325_327 DIV Exon4 0 0 1 0 0 100 delTAT insG 27 D110H c.328G>C SNV Exon4 1 0 1 0 0 100 R117C c.349C>T SNV Exon4 4 0 0 0 0 100 R117H c.350G>A SNV Exon4 17 2 0 0 0 100 Y122X c.366T>A SNV Exon4 0 1 0 0 0 100 F143LfsX10 c.425delT DIV Exon4 0 1 0 0 0 100 574delA c.442delA DIV Exon4 0 0 2 0 0 100 Q151K c.451C>A SNV Exon4 1 0 0 0 0 100 621+1G>T c.489+1G>T SNV Intron4 7 5 0 0 0 100 621+3A>G c.489+3A>G SNV Intron4 1 0 0 0 0 100 663delT c.531delT DIV Exon5 1 0 1 0 0 100 G178R c.532G>A SNV Exon5 1 1 0 0 0 100 711+1G>T c.579+1G>T SNV Intron5 3 1 0 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive 711+3A>G c.579+3A>G SNV Intron5 0 0 1 0 0 100 711+5 G>A c.579+5G>A SNV Intron5 0 0 1 0 0 100 712-1 G>T c.580-1G>T SNV Exon6 0 0 1 0 0 100 H199Y c.595C>T SNV Exon6 0 0 1 0 0 100 P205S c.613C>T SNV Exon6 1 0 1 0 0** 100 L206W c.617T>G SNV Exon6 8 1 0 0 0 100 A209S c.625G>T SNV Exon6 0 1 0 0 0 100 Q220X c.658C>T SNV Exon6 0 0 1 0 0 100 L227R c.680T>G SNV Exon6 0 0 1 0 0 100 852del22 c.720_741 DIV Exon6 0 0 1 0 0 100 delAGGG AGAATG ATGATG AAGTAC 28 E279D c.837A>T SNV Exon7 1 0 0 0 0 100 R297Q c.890G>A SNV Exon8 2 0 0 0 0 100 1078delT c.948delT DIV Exon8 1 1 0 0 0 100 L320V c.958T>G SNV Exon8 1 0 0 0 0 100 G330X c.988G>T SNV Exon8 1 1 0 0 0 100 R334W c.1000C>T SNV Exon8 6 1 0 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive I336K c.1007T>A SNV Exon8 0 1 0 0 0 100 T338I c.1013C>T SNV Exon8 0 0 1 0 0 100 1154insTC c.1022_10 DIV Exon8 0 1 0 0 0 100 23insTC S341P c.1021T>C SNV Exon8 0 0 1 0 0 100 R347H c.1040G>A SNV Exon8 6 1 1 0 0 100 R347P c.1040G>C SNV Exon8 3 2 0 0 0 100 R352Q c.1055G>A SNV Exon8 5 0 0 0 0 100 Q359K/ c.[1075C>A SNV Exon8 0 0 1 0 0 100 T360K ;1079C>A] 1213delT c.1081delT DIV Exon8 0 0 1 0 0 100 1248+1G>A c.1116+1G>A SNV Intron8 0 0 1 0 0 100 1259insA c.1127_11 DIV Exon9 0 0 2 0 0 100 28insA W401X (c.1202G>A) c.1202G>A SNV Exon9 0 0 1 0 0 100 W401X (c.1203G>A) c.1203G>A SNV Exon9 0 0 1 0 0 100 1341+1G>A c.1209+1G>A SNV Intron9 0 0 2 0 0 100 PolyTGPolyT S.O. PolyTG Intron9 369 79 52 3 4# 98,60 PolyT 29 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) 1461ins4 c.1329_ Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive DIV Exon10 0 0 1 0 0 100 1330ins AGAT A455E c.1364C>A SNV Exon10 4 2 0 0 0 100 1525-1G>A c.1393-1G>A SNV Exon11 0 0 1 0 0 100 S466X (C>A) c.1397C>A SNV Exon11 0 0 1 0 0 100 S466X (C>G) c.1397C>G SNV Exon11 1 0 1 0 0 100 L467P c.1400T>C SNV Exon11 0 0 1 0 0 100 V470M c.1408G>A SNV Exon11 311 71 0 0 0 100 1548delG c.1418delG DIV Exon11 1 0 1 0 0 100 P477S c.1429C>T SNV Exon11 0 1 0 0 0 100 S485T c.1454G>C SNV Exon11 1 0 0 0 0 100 S489X c.1466C>A SNV Exon11 0 0 2 0 0 100 S492F c.1475C>T SNV Exon11 0 0 1 0 0 100 Q493X c.1477C>T SNV Exon11 4 2 0 0 0 100 I506V c.1516A>G SNV Exon11 7 0 0 0 0 100 I507del c.1519_1521 DIV Exon11 4 2 0 0 0 100 DIV Exon11 84 29 0 0 0 100 delATC F508del c.1521_1523 delCTT 30 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive I507V c.1519A>G SNV Exon11 0 1 0 0 0 100 F508C c.1523T>G SNV Exon11 1 1 0 0 0 100 1677delTA c.1545_1546 DIV Exon11 1 0 0 0 0 100 delTA V520F c.1558G>T SNV Exon11 2 0 0 0 0 100 Q525X c.1573C>T SNV Exon11 0 0 1 0 0 100 E527E c.1581A>G SNV Exon11 3 2 0 0 0 100 E528E c.1584G>A SNV Exon11 6 2 0 0 0 100 1717-8G>A c.1585-8G>A SNV Intron11 0 0 1 0 0 100 1717-1G>A c.1585-1G>A SNV Exon12 4 1 0 0 0 100 G542X c.1624G>T SNV Exon12 12 3 0 0 0 100 S549R c.1645A>C SNV Exon12 0 0 1 0 0 100 S549N c.1646G>A SNV Exon12 2 2 1 0 0 100 S549R c.1647T>G SNV Exon12 3 1 0 0 0 100 G551D c.1652G>A SNV Exon12 8 3 0 0 0 100 Q552X c.1654C>T SNV Exon12 0 0 1 0 0 100 R553X c.1657C>T SNV Exon12 8 2 0 0 0 100 I556V c.1666A>G SNV Exon12 1 0 0 0 0 100 (c.1645A>C) (c.1647T>G) 31 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive L558S c.1673T>C SNV Exon12 0 0 1 0 0 100 A559T c.1675G>A SNV Exon12 4 0 1 0 0 100 R560K c.1679G>A SNV Exon12 0 0 1 0 0 100 R560T c.1679G>C SNV Exon12 6 1 0 0 0 100 1811+1.6kb A>G c.1679+1.6 SNV Intron12 0 0 1 0 0 100 kbA>G 32 1812-1 G>A c.1680-1G>A SNV Exon13 0 2 0 0 0 100 A561T c.1681G>A SNV Exon13 1 0 0 0 0 100 V562I c.1684G>A SNV Exon13 1 0 0 0 0 100 Y569D c.1705T>G SNV Exon13 0 0 1 0 0 100 P574H c.1721C>A SNV Exon13 0 1 0 0 0 100 G576A c.1727G>C SNV Exon13 4 1 0 0 0 100 D579G c.1736A>G SNV Exon13 0 0 1 0 0 100 E585X c.1753G>T SNV Exon13 0 0 1 0 0 100 1898+1G>A c.1766+1G>A SNV Intron13 2 1 0 0 0 100 1898+3A>G c.1766+3A>G SNV Intron13 0 0 1 0 0 100 H609R c.1826A>G SNV Exon14 0 1 0 0 0 100 D614G c.1841A>G SNV Exon14 0 0 2 0 0 100 R668C c.2002C>T SNV Exon14 5 2 0 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive R668H c.2003G>A SNV Exon14 1 0 0 0 0 100 2143delT c.2012delT DIV Exon14 2 1 0 0 0 100 K684TfsX4 c.2046_2047 DIV Exon14 0 0 1 0 0 100 DIV Exon14 3 1 0 0 0 100 delAA 2183AA>G c.2051_2052 delAAinsG 2184delA c.2052delA DIV Exon14 1 1 0 0 0 100 2184insA c.2052_2053 DIV Exon14 3 0 1 0 0 100 insA S686Y c.2057C>A SNV Exon14 0 1 0 0 0 100 R709X c.2125C>T SNV Exon14 1 0 2 0 0 100 K710X c.2128A>T SNV Exon14 3 0 0 0 0 100 E725K c.2173G>A SNV Exon14 2 0 0 0 0 100 2307insA c.2175_2176 DIV Exon14 3 0 2 0 0 100 insA 33 L732X c.2195T>G SNV Exon14 0 0 2 0 0 100 2347delG c.2215delG DIV Exon14 0 0 2 0 0 100 P750L c.2249C>T SNV Exon14 1 0 0 0 0 100 V754M c.2260G>A SNV Exon14 2 1 0 0 0 100 R764X c.2290C>T SNV Exon14 1 0 2 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive 2585delT c.2453delT DIV Exon14 0 0 2 0 0 100 E822X c.2464G>T SNV Exon14 0 0 2 0 0 100 2622+1G>A c.2490+1G>T SNV Intron14 0 0 2 0 0 100 E831X c.2491G>T SNV Exon15 0 0 1 0 0 100 D836Y c.2506G>T SNV Exon15 0 1 0 0 0 100 W846X c.2537G>A SNV Exon15 0 1 0 0 0 100 R851X c.2551C>T SNV Exon15 0 0 1 0 0 100 T854T c.2562T>G SNV Exon15 212 44 0 0 0 100 2711delT c.2583delT DIV Exon15 0 0 1 0 0 100 V868V c.2604A>G SNV Exon15 2 0 0 0 0 100 c.2657+2_2657+3insA c.2657+2_ DIV Intron16 0 0 1 0 0 100 2657+3insA 34 2789+5G>A c.2657+5G>A SNV Intron16 9 1 0 0 0 100 Q890X c.2668C>T SNV Exon17 1 0 0 0 0 100 A923A c.2769C>T SNV Exon17 1 0 0 0 0 100 L927P c.2780T>C SNV Exon17 0 0 1 0 0 100 S945L c.2834C>T SNV Exon17 0 0 1 0 0 100 M952T c.2855T>C SNV Exon17 1 0 0 0 0 100 3007delG c.2875delG DIV Exon17 0 0 1 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) 35 Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive T966T c.2898G>A SNV Exon17 5 0 0 0 0 100 G970R c.2908G>C SNV Exon17 0 0 1 0 0 100 S977F c.2930C>T SNV Exon18 0 0 1 0 0 100 3120G>A c.2988G>A SNV Exon18 1 0 0 0 0 100 3120+1G>A c.2988+1G>A SNV Intron18 7 1 0 0 0 100 3121-1G>A c.2989-1G>A SNV Exon19 0 0 1 0 0 100 L997F c.2991G>C SNV Exon19 2 1 0 0 0 100 I1027T c.3080T>C SNV Exon19 1 2 0 0 0 100 3272-26A>G c.3140-26A>G SNV Intron19 0 1 0 0 0 100 F1052V c.3154T>G SNV Exon20 0 1 0 0 0 100 L1065P c.3194T>C SNV Exon20 0 0 1 0 0 100 R1066C c.3196C>T SNV Exon20 6 0 0 0 0 100 R1066H c.3197G>A SNV Exon20 1 0 1 0 0 100 G1069R c.3205G>A SNV Exon20 0 1 0 0 0 100 R1070W c.3208C>T SNV Exon20 0 2 0 0 0 100 R1070Q c.3209G>A SNV Exon20 0 1 0 0 0 100 L1077P c.3230T>C SNV Exon20 0 0 1 0 0¥ 100 W1089X c.3266G>A SNV Exon20 4 0 0 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) 36 Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive Y1092X (C>A) c.3276C>A SNV Exon20 3 1 0 0 0 100 Y1092X (C>G) c.3276C>G SNV Exon20 0 0 1 0 0 100 T1095T c.3285A>T SNV Exon20 7 0 0 0 0 100 M1101K c.3302T>A SNV Exon20 2 2 0 0 0 100 E1104X c.3310G>T SNV Exon20 0 0 1 0 0 100 c.3368-2A>T c.3368-2A>T SNV Intron20 0 1 0 0 0 100 D1152H c.3454G>C SNV Exon21 10 1 0 0 0 100 V1153E c.3458T>A SNV Exon21 1 0 0 0 0 100 R1158X c.3472C>T SNV Exon22 7 1 0 0 0 100 R1162X c.3484C>T SNV Exon22 5 1 0 0 0 100 R1162L c.3485G>T SNV Exon22 0 2 0 0 0 100 3659delC c.3528delC DIV Exon22 4 1 0 0 0 100 S1196X c.3587C>G SNV Exon22 1 0 0 0 0 100 W1204X (c.3611G>A) c.3611G>A SNV Exon22 0 0 1 0 0 100 W1204X (c.3612G>A) c.3612G>A SNV Exon22 0 0 1 0 0 100 3791delC c.3659delC DIV Exon22 2 0 0 0 0 100 I1234V c.3700A>G SNV Exon22 1 0 1 0 0 100 S1235R c.3705T>G SNV Exon22 9 1 0 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) 3849+10 c.3717+ kbC>T 12191C>T G1244E Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive SNV Intron22 11 2 0 0 0 100 c.3731G>A SNV Exon23 0 0 1 0 0 100 3876delA c.3744delA DIV Exon23 6 1 0 0 0 100 S1251N c.3752G>A SNV Exon23 1 0 1 0 0 100 3905insT c.3773_3774 DIV Exon23 3 1 0 0 0 100 insT D1270N c.3808G>A SNV Exon23 0 2 0 0 0 100 W1282X c.3846G>A SNV Exon23 9 1 0 0 0 100 P1290P c.3870A>G SNV Exon23 10 3 0 0 0 100 4005+1G>A c.3873+1G>A SNV Intron23 0 0 1 0 0 100 4016insT c.3884_3885 DIV Exon24 0 0 1 0 0 100 insT T1299T c.3897A>G SNV Exon24 3 0 0 0 0 100 N1303K c.3909C>G SNV Exon24 9 1 0 0 0 100 Q1313X c.3937C>T SNV Exon24 0 0 1 0 0 100 G1349D c.4046G>A SNV Exon25 0 1 0 0 0 100 4209TG c.4077_4080 DIV Exon25 0 0 1 0 0 100 TT>AA delTGTT insAA 37 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Appels positifs (variants) Génotype (nom courant/nom Nom d’ADNc Type de variant d’ADNc/coordonnée) CFTR c.3964-78_ dele22, 23 4242+577del 4382delA Région de gène CFTR (hg19) Échantillons Échantillons de Échantillons cliniques lignée cellulaire synthétiques Aucun-appels* Appels Concordance incorrects positive Del Intron24 1 0 1 0 0 100 c.4251delA DIV Exon27 0 0 1 0 0 100 Y1424Y c.4272C>T SNV Exon27 6 2 0 0 0 100 Q1463Q c.4389G>A SNV Exon27 150 32 0 0 0 100 2 072 3 4 99,66 Total tous TS (CN) 2 600 928 1 2§ > 99,99 Total tous TS et variants (CG) 2 603 000 4 6 > 99,99 Total tous variants (CP)† DIV est l’acronyme pour variant de délétion/insertion. * Les échantillons n’ont pas été ré-analysés. ^ Le logiciel ne signale pas de nom d’ADNc pour cette coordonnée génomique. ** Le rapport Sanger a classé le variant P205S comme hétérozygote pour l’échantillon clinique. Une révision des données de suivi de Sanger a cependant indiqué que le variant était en réalité homozygote et rapporté de manière incorrecte. Le système MiSeqDx a signalé le variant comme étant homozygote. # L’un des résultats discordants provient de l’étude de reproductibilité. Le résultat PolyTG/PolyT pour l’échantillon est concordant sur les 18 réplicats, mais discordant avec le séquençage bidirectionnel Sanger. ¥ Il a été déterminé que l’échantillon hétérozygote synthétique d’origine a été préparé de manière incorrecte. Lorsqu’il a été testé ultérieurement après avoir été préparé à nouveau, en utilisant le même plasmide, il a pu être détecté. † La CP à l’exclusion des appels PolyTG/PolyT était de 100 %. § Un échantillon d’hétérozygote synthétique pour exon 8 a été rapporté comme hétérozygote pour le variant CFTR dele22, 23. Un examen approfondi a révélé que ce résultat provient probablement d’une faible contamination. En outre, pour un second échantillon, les primers de Sanger n’avaient pas pu détecter entièrement le variant Q1463Q en raison des indels, tant en amont qu’en aval du site du variant. Tableau 16 Précision du variant PolyTG/PolyT pour le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Génotype PolyTGPolyT Nbre d’échantillons Nbre d’échantillons de lignée Nbre d’échantillons Nbre d’appels Nbre d’aucun- Précision en cliniques cellulaire synthétiques incorrects appel* % 2 0 0 0 1 50.00 (TG)9(T)7/(TG)11(T)7 38 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Génotype Nbre d’échantillons Nbre d’échantillons de lignée Nbre d’échantillons Nbre d’appels Nbre d’aucun- Précision en cliniques cellulaire synthétiques incorrects appel* % (TG)9(T)9/(TG)10(T)7 1 0 0 0 0 100 (TG)9(T)9/(TG)11(T)7 5 1 0 0 0 100 (TG)9(T)9/(TG)11(T)9 1 0 0 0 0 100 (TG)10(T)7/(TG)10(T)7 25 8 0 0 0 100 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 39 16 0 0 0 100 (TG)10(T)7/(TG)11(T)5 2 0 0 0 0 100 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 72 11 0 0 0 100 (TG)10(T)7/(TG)12(T)5 1 0 0 0 0 100 (TG)10(T)7/(TG)12(T)7 10 1 0 0 1 90,91 (TG)10(T)9/(TG)10(T)9 7 6 0 0 0 100 (TG)10(T)9/(TG)11(T)5 5 0 0 0 0 100 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 76 20 0 0 0 100 (TG)10(T)9/(TG)11(T)9 3 0 0 0 0 100 (TG)10(T)9/(TG)12(T)5 3 2 0 0 0 100 (TG)10(T)9/(TG)12(T)7 13 0 0 0 1 92,31 (TG)11(T)5/(TG)11(T)7 6 0 0 1 0 83,33 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 52 8 0 0 0 100 (TG)11(T)7/(TG)11(T)9^ 2 1 0 3 0 0 (TG)11(T)7/(TG)12(T)5 2 0 0 0 0 100 PolyTGPolyT 39 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Génotype Nbre d’échantillons Nbre d’échantillons de lignée Nbre d’échantillons Nbre d’appels Nbre d’aucun- Précision en cliniques cellulaire synthétiques incorrects appel* % (TG)11(T)7/(TG)12(T)7 37 3 0 0 0 100 (TG)11(T)9/(TG)12(T)7 3 0 0 0 0 100 (TG)12(T)7/(TG)12(T)7 2 2 0 0 0 100 4 3 98,44 PolyTGPolyT Total 448 * Les échantillons n’ont pas été ré-analysés. ^ L’un des résultats discordants provient de l’étude de reproductibilité. Le résultat PolyTG/PolyT pour l’échantillon est concordant sur les 18 réplicats, mais discordant avec le séquençage bidirectionnel Sanger. Reproductibilité La reproductibilité du système pour fibrose kystique MiSeqDx a été déterminée par une étude en aveugle utilisant trois sites d’essai et deux opérateurs sur chaque site. Deux panels bien caractérisés de 46 échantillons chacun ont été analysés par chaque opérateur sur chaque site pour un total de 276 résultats d’échantillons par opérateur. Ce panel contenait un mélange d’ADN génomique issu des lignées cellulaires lymphoblastiques ayant des mutations connues dans le gène CFTR, ainsi que du sang déleucocyté enrichi de lignées cellulaires lymphoblastiques ayant des mutations connues dans le gène CFTR. Les échantillons de sang ont été fournis pour permettre l’incorporation des étapes d’extraction utilisées dans la préparation d’ADNg qui sert d’entrée primaire pour le flux de travail du test. Le débit de passage des échantillons, défini comme le nombre d’échantillons passant les indicateurs de contrôle qualité lors de la première tentative, était de 99,7 %. Tous les résultats sont basés sur des tests initiaux. La CP au niveau du génotype pour tous les variants, variant PolyTG/PolyT compris, était de 99,22 %, et de 99,60 % en excluant le variant PolyTG/PolyT. La CN pour tous les TS était > 99,70 %, et la CG pour toutes les positions rapportées était > 99,70 %. La CP des variants PolyTG/PolyT était de 97,83 %. Tableau 17 Reproductibilité du Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx (sans les variants PolyTG/PolyT) Total résultats Échantillon 1 40 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) c.1408G>A | Référence 15038344 rév. C FRA Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site V470M Appels concordants 6 Tous les sites 18 Site 1 Site 2 Site 3 6 6 6 Aucun- Appels appel€ incorrects 0 0 concordance 100 Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 41 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 1 c.1646G>A S549N 6 18 6 6 6 0 0 100 1 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c.1581A>G E527E 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c.1680-1G>A 1812-1 G>A 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c.312delA 444delA 6 18 6 6 6 0 0 100 2 c.3870A>G P1290P 6 18 6 5 6 0 1 94,44 2 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 3 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 3 c.1477C>T Q493X 6 18 6 6 6 0 0 100 3 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 3 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 3 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 4 c.1408G>A V470M 6 18 5 6 6 1 0 94,44 4 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 5 6 6 1 0 94,44 4 c.2052delA 2184delA 6 18 5 6 6 1 0 94,44 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 42 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 5 c.1408G>A V470M 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 5 c.224G>A R75Q 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 5 c.2562T>G T854T 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 5 c.3472C>T R1158X 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 5 c.366T>A Y122X 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 5 c.625G>T A209S 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 6 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 6 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 6 c.2051_2052delAAinsG 2183AA>G 6 18 6 6 6 0 0 100 7 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 7 c.223C>T R75X 6 18 6 6 6 0 0 100 7 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 8 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 8 c.1519_1521delATC I507del 6 18 6 6 6 0 0 100 8 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 8 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 8 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 43 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 9 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 9 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 9 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 9 c.3846G>A W1282X 6 18 6 5 6 0 1* 94,44 9 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 10 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 10 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 10 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 10 c.3140-26A>G 3272-26A>G 6 18 6 5 6 0 1* 94,44 10 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 11, 39 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 11, 39 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 12 12 0 0 100 11, 39 c.2002C>T R668C 12 36 12 12 12 0 0 100 11, 39 c.2562T>G T854T 12 36 12 12 12 0 0 100 11, 39 c.3717+12191C>T 3849+10kbC>T 12 36 12 12 12 0 0 100 11, 39 c.4389G>A Q1463Q 12 36 12 12 12 0 0 100 12, 40 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 44 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 12, 40 c.2562T>G T854T 12 36 12 12 12 0 0 100 12, 40 c.2988+1G>A 3120+1G>A 12 36 12 12 12 0 0 100 12, 40 c.4389G>A Q1463Q 12 36 12 12 12 0 0 100 12, 40 c.489+1G>T 621+1G>T 12 36 12 12 12 0 0 100 13 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 13 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 13 c.178G>T E60X 6 18 6 6 6 0 0 100 13 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 14 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 14 c.1584G>A E528E 6 18 6 6 6 0 0 100 14 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 14 c.3302T>A M1101K 6 18 6 6 6 0 0 100 15 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 15 c.1584G>A E528E 6 18 6 6 6 0 0 100 15 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 15 c.3302T>A M1101K 6 18 6 6 6 0 0 100 16 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 45 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 16 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 16 c.3080T>C I1027T 6 18 6 6 6 0 0 100 17, 41 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 17, 41 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 12 12 0 0 100 17, 41 c.3528delC 3659delC 12 36 12 12 12 0 0 100 18, 42 c.-4G>C 117120145 12 36 12 12 12 0 0 100 18, 42 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 18, 42 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 12 12 0 0 100 18, 42 c.350G>A R117H 12 36 12 12 12 0 0 100 19 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 19 c.489+1G>T 621+1G>T 6 18 6 6 6 0 0 100 19 c.579+1G>T 711+1G>T 6 18 6 6 6 0 0 100 20, 43 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 20, 43 c.254G>A G85E 12 36 12 12 12 0 0 100 20, 43 c.489+1G>T 621+1G>T 12 36 12 12 12 0 0 100 21, 44 c.1364C>A A455E 12 36 12 12 12 0 0 100 21, 44 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 46 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 21, 44 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 12 12 0 0 100 22 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 22 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 22 c.1679G>C R560T 6 18 6 6 6 0 0 100 22 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 22 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 23 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 23 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 23 c.3276C>A Y1092X (C>A) 6 18 6 6 6 0 0 100 24, 45 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 24, 45 c.3909C>G N1303K 12 36 12 12 12 0 0 100 24, 45 c.4046G>A G1349D 12 36 12 12 12 0 0 100 25 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 25 c.1624G>T G542X 6 18 6 6 6 0 0 100 26 c.-8G>C 117120141 6 18 6 6 6 0 0 100 26 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 26 c.1624G>T G542X 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 47 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 27, 46 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 27, 46 c.1652G>A G551D 12 36 12 12 12 0 0 100 27, 46 c.1657C>T R553X 12 36 12 12 12 0 0 100 27, 46 c.2562T>G T854T 12 36 12 12 12 0 0 100 27, 46 c.4389G>A Q1463Q 12 36 12 12 12 0 0 100 28 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 28 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 28 c.3717+12191C>T 3849+10kbC>T 6 18 6 6 6 0 0 100 28 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 29 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 29 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 29 c.91C>T R31C 6 18 6 6 6 0 0 100 30 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 30 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 30 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 30 c.3485G>T R1162L 6 18 6 6 6 0 0 100 30 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 48 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 31 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 31 c.1585-1G>A 1717-1G>A 6 18 6 6 6 0 0 100 31 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 31 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 32 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 32 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 32 c.3484C>T R1162X 6 18 6 6 6 0 0 100 32 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 33 c.1040G>C R347P 6 18 6 6 6 0 0 100 33 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 33 c.1652G>A G551D 6 18 6 6 6 0 0 100 33 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 33 c.4272C>T Y1424Y 6 18 6 6 6 0 0 100 33 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 34 c.1000C>T R334W 6 18 6 6 6 0 0 100 34 c.3368-2A>T c.3368-2A>T 6 18 6 6 6 0 0 100 35 c.1523T>G F508C 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 49 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 36 c.254G>A G85E 6 18 6 6 6 0 0 100 36 c.3454G>C D1152H 6 18 6 6 6 0 0 100 37 c.1007T>A I336K 6 18 6 6 6 0 0 100 37 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 37 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 37 c.3705T>G S1235R 6 18 6 6 6 0 0 100 38 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 38 c.1727G>C G576A 6 18 6 6 6 0 0 100 38 c.2002C>T R668C 6 18 6 6 6 0 0 100 38 c.2057C>A S686Y 6 18 6 6 6 0 0 100 38 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 38 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 47, 85 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 47, 85 c.2562T>G T854T 12 36 12 12 12 0 0 100 47, 85 c.2657+5G>A 2789+5G>A 12 36 12 12 12 0 0 100 47, 85 c.4389G>A Q1463Q 12 36 12 12 12 0 0 100 48, 86 c.54-5940_273+10250del21kb CFTRdele2,3 12 36 12 11 12 1 0 97,22 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 50 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 48, 86 c.1408G>A V470M 12 36 12 11 12 1 0 97,22 48, 86 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 11 12 1 0 97,22 49, 87 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 49, 87 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 12 12 0 0 100 49, 87 c.1766+1G>A 1898+1G>A 12 36 12 12 12 0 0 100 50, 88 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 50, 88 c.220C>T R74W 12 36 12 12 12 0 0 100 50, 88 c.2562T>G T854T 12 36 12 12 12 0 0 100 50, 88 c.3808G>A D1270N 12 36 12 12 12 0 0 100 51, 89 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 51, 89 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 12 12 0 0 100 51, 89 c.2012delT 2143delT 12 36 12 12 12 0 0 100 52 c.3744delA 3876delA 6 18 6 6 6 0 0 100 53, 90 c.3773_3774insT 3905insT 12 36 12 12 12 0 0 100 54, 91 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 54, 91 c.262_263delTT 394delTT 12 36 12 12 12 0 0 100 55, 92 c.1408G>A V470M 12 36 12 12 12 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 51 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 55, 92 c.1519A>G I507V 12 36 12 12 12 0 0 100 55, 92 c.1521_1523delCTT F508del 12 36 12 12 12 0 0 100 55, 92 c.2562T>G T854T 12 36 12 12 12 0 0 100 55, 92 c.3080T>C I1027T 12 36 12 12 12 0 0 100 55, 92 c.4389G>A Q1463Q 12 36 12 12 12 0 0 100 56 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 56 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 56 c.3154T>G F1052V 6 18 6 6 6 0 0 100 56 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 57 c.-8G>C 117120141 6 18 6 6 6 0 0 100 57 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 57 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 57 c.3209G>A R1070Q 6 18 6 6 6 0 0 100 58 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 58 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 58 c.2991G>C L997F 6 18 6 6 6 0 0 100 59 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 52 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 59 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 59 c.3205G>A G1069R 6 18 6 6 6 0 0 100 60 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 60 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 60 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 60 c.617T>G L206W 6 18 6 6 6 0 0 100 61 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 61 c.2260G>A V754M 6 18 6 6 6 0 0 100 61 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 62 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 62 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 62 c.988G>T G330X 6 18 6 6 6 0 0 100 64 c.1040G>A R347H 6 18 6 6 6 0 0 100 64 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 64 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 64 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 65 c.948delT 1078delT 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 53 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 66 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 66 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 66 c.532G>A G178R 6 18 6 6 6 0 0 100 67 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 67 c.1647T>G S549R (c.1647T>G) 6 18 6 6 6 0 0 100 68 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 68 c.1646G>A S549N 6 18 6 6 6 0 0 100 68 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 68 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 69 c.2506G>T D836Y 6 18 6 6 6 0 0 100 69 c.2537G>A W846X 6 18 6 6 6 0 0 100 70 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 70 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 70 c.3485G>T R1162L 6 18 6 6 6 0 0 100 70 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 71 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 71 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 54 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 71 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 71 c.274G>T E92X 6 18 6 6 6 0 0 100 71 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 72 c.1022_1023insTC 1154insTC 6 18 6 6 5 1 0 94,44 72 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 5 1 0 94,44 72 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 5 1 0 94,44 72 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 5 1 0 94,44 72 c.489+1G>T 621+1G>T 6 18 6 6 5 1 0 94,44 73 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 73 c.1624G>T G542X 6 18 6 6 6 0 0 100 73 c.1826A>G H609R 6 18 6 6 6 0 0 100 74 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 5 0 1 94,44 74 c.1429C>T P477S 6 18 6 6 6 0 0 100 74 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 75 c.1408G>A V470M 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 75 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 75 c.1721C>A P574H 6 18 6 5 6 1^ 0 94,44 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 55 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 76 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 76 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 76 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 76 c.425delT F143LfsX10 6 18 6 6 6 0 0 100 76 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 77 c.1364C>A A455E 6 18 6 6 6 0 0 100 77 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 77 c.489+1G>T 621+1G>T 6 18 6 6 6 0 0 100 78 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 78 c.1581A>G E527E 6 18 6 6 6 0 0 100 78 c.1680-1G>A 1812-1 G>A 6 18 6 6 6 0 0 100 78 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 78 c.312delA 444delA 6 18 6 6 6 0 0 100 78 c.3870A>G P1290P 6 18 6 6 6 0 0 100 78 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 79 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 79 c.220C>T R74W 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Échantillon 56 Nom du HGVS (ou emplacement si aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 79 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 79 c.3808G>A D1270N 6 18 6 6 6 0 0 100 80 c.-8G>C 117120141 6 18 6 6 6 0 0 100 80 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 80 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 80 c.1657C>T R553X 6 18 6 6 6 0 0 100 80 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 81 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 81 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 81 c.1652G>A G551D 6 18 6 6 6 0 0 100 81 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 81 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 82 c.1040G>C R347P 6 18 6 6 6 0 0 100 82 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 82 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 82 c.4272C>T Y1424Y 6 18 6 6 6 0 0 100 83 c.-4G>C 11720145 6 18 6 6 6 0 0 100 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Total résultats Nom du HGVS (ou emplacement si Échantillon aucun HGVS) Appels concordants Total* (tous les sites) % de Nom du variant Tous les Par site sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun- Appels appel€ incorrects concordance 83 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 83 c.1521_1523delCTT F508del 6 18 6 6 6 0 0 100 83 c.350G>A R117H 6 18 6 6 6 0 0 100 84 c.1408G>A V470M 6 18 6 6 6 0 0 100 84 c.1519_1521delATC I507del 6 18 6 6 6 0 0 100 84 c.2562T>G T854T 6 18 6 6 6 0 0 100 84 c.4389G>A Q1463Q 6 18 6 6 6 0 0 100 2 580 7 740 2 562 2 553 2 565 37 23 99,22 Total tous TS (CN) 2 871 132 8 613 396 2 865 930 2 855 526 2 865 932 26 006 2 99,70 Total tous TS et variants (CG) 2 873 712 8 621 136 2 868 492 2 858 079 2 868 497 26 043 25 99,70 Total de tous les variants (CP)** (y compris les données PolyTG/PolyT dans le Tableau 18) Les échantillons n’ont pas été ré-analysés. ^ Un réplicat de chacun des échantillons 5 et 75 avait un débit d’appel de 0 %. Un examen approfondi a montré que les échantillons n’avaient vraisemblablement pas été ajoutés à la plaque d’échantillon avant la préparation de la librairie. * Après vérification, il semble que les échantillons 9 et 10 aient été échangés par l’opérateur avant la préparation de la librairie. ** À l’exclusion des variants PolyTG/PolyT, la CP était de 99,60 %. € Tableau 18 Reproductibilité PolyTG/PolyT pour le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Nombre de résultats Panel 57 Échantillon Appels concordants Total tous sites Génotype % de concordance Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun-appels Appels incorrects A 1 (TG)12(T)7/(TG)12(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 2 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Nombre de résultats Panel 58 Échantillon Appels concordants Total tous sites Génotype % de concordance Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun-appels Appels incorrects A 3 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 4 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 5 6 6 1 0 94,44 % A 5 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 5 6 1 0 94,44 % A 6 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 7 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 8 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 9 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 10 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 11, 39 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % A 12, 40 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % A 13 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 14 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 15 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 5 6 1 0 94,44 % A 16 (TG)10(T)9/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 17, 41 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % A 18, 42 (TG)10(T)9/(TG)12(T)5 12 36 12 12 12 0 0 100 % A 19 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 20, 43 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % A 21, 44 (TG)10(T)9/(TG)10(T)9 12 36 12 12 12 0 0 100 % | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Nombre de résultats Panel 59 Échantillon Appels concordants Total tous sites Génotype % de concordance Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun-appels Appels incorrects A 22 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 23 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 24, 45 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % A 25 (TG)10(T)9/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 26 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 27, 46 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 12 36 11 12 12 0 1 97,22 % A 28 (TG)10(T)7/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 29 (TG)10(T)7/(TG)12(T)7 6 18 6 4 4 4 0 77,78 % A 30 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 31 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 32 (TG)10(T)7/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 33 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 5 6 6 1 0 94,44 % A 34 (TG)11(T)7/(TG)12(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 35 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 36 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 37 (TG)11(T)7/(TG)12(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % A 38 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 47, 85 (TG)10(T)7/(TG)10(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % B 48, 86 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 11 11 12 2 0 94,44 % | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Nombre de résultats Panel 60 Échantillon Appels concordants Total tous sites Génotype % de concordance Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun-appels Appels incorrects B 49, 87 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % B 50, 88 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % B 51, 89 (TG)10(T)9/(TG)10(T)9 12 36 12 12 12 0 0 100 % B 52 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 53, 90 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % B 54, 91 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % B 55, 92 (TG)10(T)9/(TG)10(T)7 12 36 12 12 12 0 0 100 % B 56 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 57 (TG)12(T)7/(TG)12(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 58 (TG)10(T)9/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 59 (TG)11(T)7/(TG)12(T)7 6 18 5 6 6 1 0 94,44 % B 60 (TG)9(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 61 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 62 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 5 6 6 1 0 94,44 % B 63 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 64 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 5 6 6 1 0 94,44 % B 65 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 66 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 67 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Nombre de résultats Panel Échantillon Appels concordants Total tous sites Génotype % de concordance Par site Tous les sites Site 1 Site 2 Site 3 Aucun-appels Appels incorrects B 68 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 69 (TG)11(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 70 (TG)10(T)7/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 71 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 72 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 5 6 5 2 0 88,89 % B 73 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 74 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 75 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 6 5 6 1 0 94,44 % B 76 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 77 (TG)10(T)9/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 78 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 5 6 6 1 0 94,44 % B 79 (TG)10(T)7/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 80 (TG)11(T)7/(TG)11(T)9 6 18 0 0 0 0 18* 0 % B 81 (TG)10(T)7/(TG)10(T)9 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 82 (TG)10(T)9/(TG)11(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 83 (TG)10(T)9/(TG)12(T)5 6 18 6 6 6 0 0 100 % B 84 (TG)10(T)7/(TG)10(T)7 6 18 6 6 6 0 0 100 % 552 1 656 537 540 543 17 19 97,83 % Total des variants PolyTG/PolyT (CP) * Les 18 échantillons étaient tous concordants les uns avec les autres, mais discordants avec le séquençage bidirectionnel Sanger. 61 | Référence 15038344 rév. C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Extraction d’ADN Trois méthodes d’extraction disponibles dans le commerce et couramment utilisées correspondant à l’extraction à base de billes magnétiques, la précipitation dans l’alcool et la filtration sur colonne de silice ont été évaluées à l’aide de sang total anticoagulé K2EDTA. Au total, 14 échantillons de sang ont été utilisés pendant l’étude; deux étaient de type sauvage, tandis que les échantillons restants portaient des génotypes uniques représentant neuf variants différents, y compris des variants courants et rares. Pour la variation polyTG/polyT, des échantillons ayant du (T)5-9 et du (TG)10-12 ont été inclus. Les trois méthodes d’extraction d’ADN ont été testées indépendamment par deux opérateurs différents, qui ont effectué trois analyses par méthode d’extraction. Chaque extraction a été réalisée par chaque opérateur à des jours différents. La concentration d’ADN et le rapport A260/A280 des échantillons d’ADNg extrait ont été déterminés par spectrophotométrie. La taille totale des échantillons pour chaque méthode d’extraction dans cette étude était de 168 (14 échantillons × 2 opérateurs/méthode d’extraction × 3 analyses/opérateur × 2 réplicats/échantillon d’ADNg extrait). Nombre Méthode d’extraction d’échantillons Débit au premier Débit d’appel Précision testés passage de l’échantillon* Précipitation dans l’alcool 168 > 99,99 % > 99,99 % 100 % Filtration sur colonne de silice 168 > 99,99 % > 99,99 % 100 % Extraction à base de billes magnétiques 168 > 99,99 % > 99,99 % 100 % * Pourcentage d’échantillons présentant un débit d’appel > 99 % dans la première analyse. Entrée d’ADN La plage d’entrée d’ADN du Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina a été évaluée en effectuant une étude de dilution en série au moyen de 14 échantillons d’ADN représentatifs contenant 16 variants de fibrose kystique uniques. Chaque échantillon a été testé en double exemplaire sur neuf niveaux d’entrée d’ADN allant de 1 250 ng à 1 ng (1 250 ng, 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng et 1 ng). Pour la détermination de la précision, des génotypes d’échantillon ont été comparés aux données de séquençage bidirectionnel Sanger et les délétions ont été comparées à un test PCR. Les limites supérieure et inférieure identifiées pour une entrée d’ADN sont respectivement de 1 250 ng et 25 ng, car ils présentaient un débit au premier passage ≥ 95 % sans aucun appel incorrect (précision et débit d’appel de 100 %). Les entrées d’ADN de 1 250 ng, 250 ng et 100 ng ont été également testées avec quatre échantillons d’ADN représentatifs et au moins 20 réplicats par niveau d’entrée d’ADN pour chaque échantillon (n = 4 × 20 = 80 échantillons), tandis que la limite inférieure de 25 ng a été testée avec 14 échantillons, 20 réplicats pour chaque échantillon (n = 14 × 20 = 280 échantillons). Le débit au premier passage de l’échantillon et le taux de précision étaient de 100 % à tous les niveaux d’entrée d’ADN. Substances interférentes Pour évaluer l’incidence de substances interférentes sur le système pour fibrose kystique MiSeqDx d’Illumina, les performances du test ont été évaluées en présence et en l’absence d’éventuels éléments interférents. Seize échantillons de sang total avec des génotypes FK uniques ont été testés dans l’étude. Quatre substances interférentes endogènes (bilirubine, cholestérol, hémoglobine et triglycérides) ont été testées en les intégrant à des échantillons sanguins avant l’extraction d’ADN. Les limites de concentration pour chaque substance sont indiquées dans le tableau ci-dessous. En outre, pour évaluer l’interférence résultant du prélèvement sanguin (petit volume), de l’EDTA a été intégré aux échantillons de sang. Pour évaluer l’interférence résultant de la préparation d’échantillon, le tampon de lavage final d’une méthode de filtration sur colonne de silice a été ajouté à de l’ADN génomique purifié. Le Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx a atteint un débit d’appel de 100 % pour tous les échantillons testés, et un taux de reproductibilité de 100 % de typages génotypiques entre les échantillons en présence et Mars 2015 Référence 15038344 rév. C FRA | 62 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx en l’absence de substances interférentes. Aucune interférence n’a été observée au niveau de tous les éléments interférents endogènes ou exogènes. Pour évaluer l’incidence d’une interférence de primer d’index de multiplexage, une étude de contamination croisée utilisant deux échantillons, chacun présentant des génotypes homozygotes uniques au niveau de quatre positions génomiques différentes, et deux primers d’index respectifs a été effectuée. Aucun changement concernant l’appel de variants n’a été observé avec des niveaux de contamination < 40 %. Le génotype de l’échantillon est devenu hétérozygote avec des niveaux ≥ 40 %. Substance de test Nombre total de réplicats Concentration analysée Concentration analysée dans le sang dans le sang (Limite supérieure) (Limite inférieure) Débit d’appel Bilirubine 16 684 µmol/l 137 µmol/l 100 % Cholestérol 16 13 mmol/l 2,6 mmol/l 100 % Hémoglobine 16 2 g/l 0,4 g/l 100 % Triglycéride 16 37 mmol/l 7,4 mmol/l 100 % EDTA 16 7,0 mg/ml 2,8 mg/ml 100 % Références 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 63 Bobadilla JL, Macek Jr. M, Fine JP, Farrell PM. (2002) Cystic Fibrosis: A Worldwide Analysis of CFTR Mutations—Correlation With Incidence Data and Application to Screening. Human Mutation 19:575 606. Moskowitz SM, Chmiel JF, Sternan DL, Cheng E, Gibson RL, et coll. (2008) Clinical practice and genetic counseling for cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Genetics in Medicine 10(12):851–868. Moskowitz SM, Chmiel JF, Sternen DL, Cheng E, Cutting GR. CFTR-related disorders. Pagon RA, Bird TC, Dolan CR, Stephens K, editors. GeneReviews. Seattle (WA): Université de Washington; 2008. 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C FRA Mars 2015 Test de séquençage clinique de la fibrose kystique MiSeqDx 14 Watson MS, Cutting GR, Desnick RJ, Driscoll DA, Klinger K, et coll. (2004) Cystic fibrosis population carrier screening : 2004 revision of American College of Medical Genetics mutation panel. Genetics in Medicine 6(5) : 387–391. 15 Pratt VM, Caggana M, Bridges C, Buller AM, DiAntonio L, et coll. (Mai 2009) Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing. Journal of Molecular Diagnostics 11(3) : 186–193. 16 Amos J, Feldman GL, Grody WW, Monaghan K, Palomaki GE, et coll. (Édition 2008, révisée en mars 2011) American College of Medical Genetics Standards and Guidelines for Clinical Genetic Laboratories. 17 Rehm HL, Bale SJ, Bayrak-Toydemir P, Berg JS, Brown KK, Deignan JL, et coll. (2013) ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing. Genetics in Medicine. Genetics in Medicine 15(9) : 733–747. 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